Name: Surveillance de la colonisation bactérienne et de lentretien des racines dArabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T09:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Apprenez à surveiller la colonisation bactérienne et son entretien sur les racines d'Arabidopsis thaliana grâce à un système hydroponique flottant. Cette méthode permet de quantifier et visualiser la distribution spatiale des bactéries.

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Ces travaux ont été appuyés par des fonds de recherche fournis par le Département de la recherche biologique et environnementale de l'énergie (DOE-BER 0000217519 à E.A.S.), la National Science Foundation (INSPIRE IOS-1343020 à E.A.S). SLH a également reçu l'appui du Programme de bourses d'études supérieures de la National Science Foundation. Nous remercions le Dr Jeffery Dangl d'avoir fourni des souches bactériennes et des renseignements inestimables. Nous remercions le Dr Andrew Klein et Matthew J. Powers pour leurs suggestions expérimentales. Enfin, SLH tient à remercier les réseaux sociaux de nous rappeler que la diffusion de la science est un privilège et une responsabilité, notamment par des moyens créatifs et accessibles.

REMARQUE : La configuration expérimentale est décrite pour plus de clarté et utilisée pour générer les résultats représentatifs inclus dans ce rapport, mais les conditions peuvent être modifiées comme vous le souhaitez. Toutes les étapes doivent être effectuées à l'aide de l'EPI et en suivant les reccomendations institutionnelles et fédérales pour la sécurité, selon le statut BSL des bactéries utilisées.
1. Caractérisation des bactéries
<ol><li>Déterminer la morphologie des bactéries sur la plaque d'agar moyenne de croissance. Resuspendre les cellules à un OD approximatifde 600 à 0,5 et plaquer un volume de 1 L sur le milieu d'agar de choix. Ajouter X-gal aux plaques d'agar à une concentration finale de 20 mg/mL pour mieux différencier les membres individuels de la communauté bactérienne spécifique. Cultivez à 24 oC ou 30 oC jusqu'à ce que des colonies se forment, puis prenez des photos et des notes sur la morphologie des colonies.</li>
	<li>Définir la corrélation entre la densité optique de chaque souche bactérienne et le nombre d'unités de formation de CFU (colonies) par mL16. Resuspendre les bactéries dans 1 ml d'eau dans une plaque de 24 puits à un OD approximatifde 600 à 5, effectuer des dilutions en série à deux volets, surveiller OD600 de toutes les dilutions, et la plaque chacune pour déterminer le CFU/mL viable dans chaque échantillon à de multiples densités optiques.</li>
	<li>Déterminer la tolérance maximale à la sonication pour chaque souche bactérienne. Pour ce faire, les cellules aliquot dans une plaque de 24 puits contenant milieu liquide, réservant certaines cellules comme un échantillon de contrôle non soniqueux. À l'aide d'un ultrasonateur avec une fixation de corne à 24 pointes, appliquer trois tours de 12 s de sonication à 40 ampères avec 2 impulsions. REMARQUE : Il est conseillé d'utiliser un ultrasonateur de 24 puits pour faciliter le multiplexage en aval des échantillons d'usines de traitement, mais si l'un d'eux n'est pas disponible, utilisez un ultrasonateur équipé d'un micropointe et effectuez chaque sonication d'échantillon indépendamment. Portez toujours des cache-oreilles évalués à au moins 25 protections NRR.</li>
	<li>Effectuez des dilutions sérielles 10 fois des échantillons sonicated et non sonicated et tachez sur des plaques d'agar. Déterminer s'il y a une réduction des cellules viables après la sonication. Si c'est le cas, utilisez un échantillon frais et répétez l'étape de sonication en utilisant un temps de sonication total réduit ou une amplitude jusqu'à ce que le traitement n'ait aucun effet sur cFU/mLfinal 17.</li>
</ol>2. Préparation des semis Arabidopsis thaliana sur un maillage en plastique
<ol><li>Créez des disques de maille en plastique à l'aide d'un poinçonneur de trou standard.<ol>
<li>Recueillir les disques dans un récipient en verre avec un couvercle lâche de papier d'aluminium, et stériliser à l'aide d'un autoclave réglé à un cycle sec de 20 min13.</li>
		<li>À l'aide d'une pince à épiler stérilisée à la flamme, distribuez environ 40 disques de maille stérilisés en une seule couche sur la surface d'une plaque d'agar à croissance végétale moyenne. Utilisez 0,5x sels de Murashige et de Skoog (MS), contenant 500 mg/L de tampon MES [2-(N-morpholino)ethanesulfonic acide] et 1,5% Bacto agar, comme milieu de croissance des plantes, avec 50 g/mL de bénomyl ajouté à la contamination fongique limite des semis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les graines hacheniques de A. thaliana comme décrit précédemment17.<ol>
<li>Placer environ 100 à 300 graines chacune dans des tubes de centrifugeuse individuels dans une grille et placer dans un récipient en verre refermable ou en plastique lourd (« pot ») dans un capuchon de fumée.</li>
		<li>Par prudence, placer un bécher de 100 ml d'eau de Javel dans le bocal, ajouter 3 ml de HCl concentré à l'eau de Javel, et sceller immédiatement le pot et laisser les vapeurs stériliser les graines pendant au moins 4 h.</li>
		<li>Retirez soigneusement les tubes de graines stérilisées sous le bocal et scellez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer deux graines au centre de chaque maillage. Scellez les plaques avec du ruban adhésif chirurgical et incuber pendant 2 à 6 jours à 4 oC dans l'obscurité pour vernaliser les graines.</li>
	<li>Pour germer et cultiver les semis, placez le côté agar de plaque vers le bas dans une chambre de croissance de plante pendant 8-10 jours dans des arrangements courts de jour : 9 h de lumière à 21 oC et 15 h d'obscurité à 18 oC (figure1, étape 2).</li>
</ol>3. Colonisation des plantes dans le milieu de croissance bactérienne liquide
<ol><li>Ajouter 1 ml de milieu de croissance bactérienne à chaque puits d'une plaque stérile de 24 puits, à l'exception des puits témoins à faible intensité de médias seulement. Utilisez Lennox Luria Broth (10 g de tryptone, 5 g d'extrait de levure, 5 g de NaCl) comme milieu de croissance bactérienne.</li>
	<li>Transférer les semis germés enmaillés dans le maillage des plaques d'agar au liquide (figure1, étape 3a).<ol>
<li>Épluchez délicatement la maille contenant deux semis germés vers le haut et hors de la plaque d'agar à l'aide de forceps stérilisés par flamme. Choisissez un maillage avec des semis de taille égale et intact.</li>
		<li>Si l'enlèvement de l'agar n'est pas lisse, jetez ce maillage et plantez. Transférer un flotteur dans chaque puits de liquide de croissance bactérienne, côté racine vers le bas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculer les bactéries dans les puits contenant des semis flottants.<ol>
<li>Resuspendre les bactéries cultivées du jour au lendemain sur des plaques d'agar à un OD600 équivalent à 108 CFU/mL dans le liquide moyen de croissance bactérienne. Ajouter 10 ll de suspension bactérienne à chaque puits pour une concentration finale de 106 bactéries CFU par puits.</li>
		<li>Si vous préparez un mélange de bactéries, suspendez-les chacune à l'OD600 équivalant à 108 CFU/mL, mélangez dans des proportions égales, et ajoutez 10 L du mélange final par puits de liquide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sceller la plaque pour une croissance stérile. Sans toucher le côté collant, appuyez soigneusement sur le film perméable au gaz sur la plaque. Assurez-vous que chaque puits a été scellé individuellement en appliquant une pression autour de chacun des anneaux fabriqués par les puits. Remplacer le couvercle en plastique de la plaque confortablement sur la plaque et le film perméable au gaz (Figure 1, étape 3b).</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 18 h dans une chambre de croissance des plantes, dans les mêmes conditions que les semis ont été germés à l'origine, sauf sur un shaker de plaque orbitale réglé à 220 tr/min.</li>
</ol>4. Maintien de la colonisation bactérienne
<ol><li>Pour rincer tous les flotteurs (plantes sur maille), ajouter 1 ml d'eau stérile aux puits d'une nouvelle plaque de 24 puits. Enlever le film perméable au gaz. À l'aide de forceps stériles, transférer les flotteurs vers les puits avec de l'eau (figure1, étape 4a). Rincer en vous reposant 10 min à température ambiante (RT) sans agitation. REMARQUE : Pour déterminer l'efficacité bactérienne de colonisation des racines plutôt que leur capacité à maintenir la colonisation au fil du temps, les plantes peuvent être sacrifiées à cette étape en les prenant directement à l'étape 5.1.</li>
	<li>Remplir les puits d'une nouvelle plaque de 24 puits avec 1 ml de milieu de croissance des plantes. Transférer un maillage à chaque puits. Couvrir d'un joint perméable au gaz et couver pendant 72 h sur le shaker de plaque orbitale à 220 tr/min dans la chambre de croissance des plantes (figure1, étape 4b).</li>
	<li>Répétez le rinçant tel qu'il est effectué à l'étape 4.1 avec des flotteurs après la période d'incubation de 72 h.</li>
</ol>5. Collecte de bactéries pour des comptes cellulaires viables
REMARQUE : Le nombre de bactéries par racine de semis peut être déterminé à n'importe quel point d'incubation. La colonisation peut être surveillée entre 0 h et 18 h, tandis que l'entretien peut être surveillé à partir de 18 h. Les plantes destinées à l'imagerie peuvent passer directement à l'article 6.
<ol><li>Retirez les semis du maillage (Figure 1, étape 5). Placez délicatement les pincements à flammes sous les feuilles (mais sur le côté de la feuille de la maille) et pincez légèrement la tige. Remuer les semis vers le haut et loin de la maille pour déloger la racine sans la casser. Si la racine se brise, gratter doucement le fond de maille pour recueillir toute la longueur.</li>
	<li>Enlever les bactéries des racines des plantes. Transférer les bactéries dans les puits d'une plaque de 24 puits contenant 1 ml de ddH20. Sonicate les échantillons tels que décrits à l'étape 1.3. REMARQUE : À l'aide d'un microscope, recherchez les bactéries restantes sur la surface de la racine sur un échantillon sonicated. Si les bactéries demeurent, augmentez le temps de sonication total ou l'intensité jusqu'à ce qu'aucune bactérie ne reste liée, jusqu'au niveau le plus élevé de sonication qui n'affecte pas le nombre de cellules viables tel que déterminé à la section 1.</li>
	<li>Quantifier les bactéries sur les racines.<ol>
<li>Effectuez des dilutions sérielles de 10 fois des échantillons sonicated jusqu'à une dilution de 10-6 dans le milieu de croissance bactérienne. Ajouter 50 l de chaque dilution dans des plaques d'agar individuelles et les étaler avec des perles de verre stériles (ou un épandeur bactérien). Incuber les plaques à la température optimale pour les bactéries jusqu'à ce que les colonies individuelles soient comptées.</li>
		<li>Une fois distinguable, compter le nombre de chaque morphologie de chaque colonie (tel que déterminé à la section 1) et calculer l'UFC de chaque espèce bactérienne par semis. Jetez tous les échantillons montrant une contamination, car la contamination pendant la colonisation ou l'entretien peut affecter la présence bactérienne.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Collection de racines végétales intactes pour la microscopie
<ol><li>À l'aide de forceps, retirer les semis du maillage comme à l'article 5.</li>
	<li>Transférer chaque plante sur des lames de microscope.<ol>
<li>Placez la pointe de la racine sur la glissière et éloignez-vous de la pointe pour régler la pousse avec la glissière, assurant ainsi une racine redressée pour une meilleure imagerie. Ajouter une goutte d'eau ou un milieu de croissance des plantes stériles aux échantillons pour hydrater les interfaces entre les couvertures et les lames.</li>
		<li>Placez un bordereau en verre juste au-dessus de la couronne racine (région la plus en boîte supérieure dans la figure 1) et au-dessous des feuilles de pousse pour éviter l'inclinaison de la couverture (pour permettre l'imagerie de la couronne racine), et appuyez doucement vers le bas17.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si vous utilisez des bactéries fluorescentes, imagez à l'aide de filtres d'excitation/émission appropriés pour différencier les bactéries les unes des autres et de la racine végétale18.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les plantes dans tous les environnements interagissent avec des milliers à des millions de bactéries et de champignons différents5,7. Ces interactions peuvent avoir un impact négatif et positif sur la santé des plantes, avec des effets potentiels sur le rendement des cultures et la production alimentaire. Des travaux récents suggèrent également que la colonisation variable des cultures par les PGPB peut expliquer la taille imprévisible des plantes et le rendement...

La destruction des cultures par les maladies bactériennes et fongiques entraîne une baisse de la production alimentaire et peut gravement perturber la stabilité mondiale1. Sur la base de la découverte que les microbes dans les sols suppressifs sont responsables de l'augmentation de la santé des plantes2, les scientifiques ont demandé si le microbiome végétal peut être exploité pour soutenir la croissance des plantes en modifiant la présence et l'abondance de particulier espèces bactériennes3. Les bactéries qui aident à la croissance ou au développement des plantes sont collectivement appelées bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB). Plus récemment, des études sont passées de la simple identification du PGPB potentiel à la compréhension de la façon dont les interactions inter-royaumes dans le sol, autour des racines ou dans la rhizosphère (la zone qui entoure directement et y compris la surface racinaire) peuvent avoir un impact sur le PGPB. activité4.
La colonisation de la rhizosphère par pgPB peut augmenter la santé ou le développement des plantes hôtes en réponse à divers facteurs de stress par rapport aux plantes non colonisées5. Cependant, les résultats sont souvent plus variables dans les conditions du sol indigène par rapport à ceux observés dans les serres et laboratoires étroitement contrôlés6. Une hypothèse pour cette différence est que la croissance ou le comportement de PGPB peut être inhibé par les bactéries indigènes du sol ou des champignons dans les champs7,8. Les effets bénéfiques des bactéries de la rhizosphère dépendent généralement de la capacité des bactéries à localiser et à se déplacer vers la racine, 2) coloniser la racine par la formation de biofilms, et 3) interagir avec la plante hôte ou des agents pathogènes par la production de petites molécules métabolites7,9. N'importe lequel de ces comportements de colonisation peut être affecté par la présence et l'activité des microbes voisins10.
Nous avons conçu un système pour quantifier et visualiser ces stades distincts de colonisation bactérienne de la rhizosphère (Figure 1). Cette approche facilitera les études sur les raisons pour lesquelles l'entretien à long terme du PGPB n'est pas parfois observé après le transfert des plantes dans de nouveaux environnements, comme lors de la plantation de semis pré-inoculés. Arabidopsis thaliana comme ont été choisis comme un modèle végétal en raison de son utilisation intensive dans les études de laboratoire ainsi que les nombreuses données disponibles sur ses interactions microbiennes11. Il y a trois étapes dans le système : 1) a. thaliana croissance, 2) la colonisation bactérienne, et 3) l'entretien bactérien (voir la figure 1). Parce que A. thaliana est une plante terrestre, il était important de s'assurer qu'il ne souffrait pas de stress hydrique indu dans le système hydroponique12. Inspirés par les méthodes utilisées par Haney et coll.13, les semis sont cultivés sur des mailles en plastique pour séparer la pousse du milieu de croissance liquide. Ce système ne semble pas compromettre la santé et le développement de l'hôte de la plante, et il améliore la croissance de A. thaliana dans le liquide11. Lorsque la pousse de la plante flotte au-dessus de la surface, les racines sont pleinement exposées à la colonisation par des bactéries inoculées dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Cela permet d'examiner les bactéries d'intérêt pour la colonisation des nutriments qui sont les plus propices à la croissance, tout en changeant les conditions pour permettre à la plante de continuer à croître dans un milieu nutritif conçu pour soutenir sa croissance. Les deux étapes comprennent des secousses régulières pour prévenir l'anoxie de la racine13. Les bactéries peuvent être visualisées ou quantifiées à partir des racines des plantes après le transfert du milieu de colonisation ou du milieu d'entretien. Ce système hydroponique est très flexible, permettant aux conditions expérimentales et aux contraintes appliquées d'être facilement modifiées en fonction des intérêts des chercheurs.
Cette méthode décrite est importante dans le contexte de l'ensemble de la littérature sur les interactions plantes-microbe, car elle fournit un système robuste pour étudier ces interactions à la surface des racines tout en étant personnalisable aux préférences de croissance de bactéries différentes. Les laboratoires de biologie végétale effectuent souvent des expériences de colonisation des microbes végétaux sur l'agar solide, ne permettant que le mouvement planaire (si cela) des bactéries tout en exigeant la manipulation potentiellement destructrice des plantes lors du transfert ultérieur. En revanche, les laboratoires de microbiologie ont souvent donné la priorité à la santé des bactéries dans leurs expériences, au détriment des plantes14,15. Ces différentes priorités des laboratoires axés sur les plantes et la microbiologie ont historiquement rendu difficile la comparaison des résultats entre ces groupes, puisque chacun optimise généralement les conditions expérimentales pour optimiser leur organisme d'intérêt15. Le système flottant-mesh-plant-croissance décrit ici empêche la submersion complète de plante, un avantage notable aux études microbiologiques précédentes, tout en optimisant temporairement la croissance et la survie des bactéries pour faciliter la colonisation. Ainsi, l'analyse que nous présentons ici peut répondre aux préoccupations des biologistes des plantes (sur la surhydratation et la manipulation tactile de la plante) tout en répondant aux critères des microbiologistes (permettant différentes conditions de croissance bactérienne et de multiples interactions des espèces)7. Ce protocole est conçu pour être adaptable pour une utilisation avec diverses bactéries, plantes et conditions environnementales.

<table><tbody><tr><td><fort>Matériaux requis</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubes Eppendorf</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>BD Falcon</td><td>1801343</td><td></td></tr><tr><td>Aeraseal</td><td>Excel</td> Scientific <td>BE255A2</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bactéries d’intérêt</td><td>tout</td><td>N/A</td><td>Stocké à - 80? C dans 40 % de glycérol préféré</td></tr><tr><td>BactoAgar</td><td>BD</td><td>2306428 ; REF 214010</td><td></td></tr><tr><td>décolorant</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Conviron</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td>Journée courte Lumière-Obscurité Cycles : 460-600 & micro ; moles/m&sup2 ;/s réglé à 9/15 heures lumière/obscurité à 18/21 ? C, avec prise de courant intérieure</td></tr><tr><td>Dessicator Bocal : verre ou plastique lourd</td><td>tout</td><td>S.O</td><td></td></tr>. <tr><td>Éthanol</td><td>tout</td><td>S.O</td><td></td></tr>. <tr><td>Flamme</td><td>tout</td><td>S.O</td><td></td></tr>. <tr><td>Pinces</td><td>tout</td><td>S.O</td>. Incubateur n’importe quel S.O<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>.</td><td>À température optimale pour la croissance des bactéries spécifiées</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>tout</td><td>S.O</td>.<td></td></tr><tr><td>Lennox LB Bouillon</td><td>RPI</td><td>L24066-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micropipeteurs</td><td>tout</td><td>N/A</td><td>Volumes 5 &micro ; L à 1000 & micro ; L</td></tr><tr><td>Microscope (de préférence à fluorescence)</td><td>tout</td><td>N/A</td><td>Pourrait être léger si la meilleure définition n’est pas importante</td></tr><tr><td>MS Sels + MES</td><td>RPI</td><td>M70300-50.0</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de plaque orbitale</td><td>tout</td><td>N/A</td><td>Capable de fonctionner à 220 tr/min pendant au moins 96 heures</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td>Volume total de 50 mL</td></tr><tr><td>Réservoirs</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>tout</td><td>S.O</td><td></td></tr>. <tr><td>Perforation standard</td><td>N</td><td>/D N/D</td><td>Diamètre du poinçon d’environ 7 mm</td></tr><tr><td>Eau stérile</td><td>N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Ruban chirurgical</td><td>3M</td><td>MMM1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Maille de téflon</td><td>McMaster-Carr</td><td>1100t41</td><td></td></tr><tr><td>Échosoniseur</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio</td><td>x4281c</td><td>autres fournisseurs disponibles</td></tr><tr><td>Matériaux suggérés</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 Accessoire d’ultrasoniseur à broches</td><td>tout</td><td>N/A</td><td>Pour soniser plusieurs échantillons à la fois. Peut être fait individuellement</td></tr><tr><td>Alumaseal II</td><td>Excel Scientific</td><td>FE124F</td><td></td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Multipetter/Repetter</td><td>tout</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plaques stériles à 96 puits</td><td>n’importe quel</td><td>N/A</td><td>Pour les dilutions en série. Peut être remplacé par des tubes eppendorf</td></tr> <tr><td>Biological Materials Used</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana</td><td>graines tout</td><td>N/A</td><td>Nous recommandons Arabidopsis Biological Resource Center pour les stocks de semences</td></tr><tr><td>Arthrobacter nicotinovorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Curtobacterium oceanosedimentum</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Microbacterium oleivorans</td><td></td><td></td><td>Levy, et al. 2018</td></tr><tr><td>Pseudomonas simiae WCS417r</td><td></td><td></td><td>Publié dans un système similaire dans Haney, et al. 2015. Souche utilisée développée dans Cole, et al. 2017</td></tr></tbody></table>

surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Les bactéries forment des microbiomes rhizosphèrecomplexes façonnés par des microbes en interaction, des organismes plus gros et l'environnement abiotique. Dans des conditions de laboratoire, la colonisation de la rhizosphère par des bactéries favorisant la croissance des plantes (PGPB) peut augmenter la santé ou le développement de plantes hôtes par rapport aux plantes non colonisées. Cependant, dans les milieux de terrain, les traitements bactériens avec PGPB souvent ne fournissent pas d'avantages substantiels aux cultures. Une explication est que cela peut être dû à la perte de la PGPB lors d'interactions avec les microbes du sol endogène au cours de la durée de vie de la plante. Cette possibilité a été difficile à confirmer, puisque la plupart des études se concentrent sur la colonisation initiale plutôt que sur le maintien du PGPB dans les communautés de rhizosphère. On suppose ici que l'assemblage, la coexistence et le maintien des communautés bactériennes sont façonnés par les caractéristiques déterministes du microenvironnement de la rhizosphère, et que ces interactions peuvent avoir un impact sur la survie du PGPB dans les milieux indigènes. Pour étudier ces comportements, un analyse hydroponique de croissance des plantes est optimisée en utilisant Arabidopsis thaliana pour quantifier et visualiser la distribution spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après le transfert vers une croissance différente Environnements. La reproductibilité et l'utilité de ce système sont ensuite validées avec le PGPB Pseudomonas simiaebien étudié. Étudier comment la présence de plusieurs espèces bactériennes peut affecter la dynamique de colonisation et d'entretien sur la racine de la plante, une communauté modèle de trois souches bactériennes (un Arthrobacter, Curtobacterium, et Microbacterium espèces) à l'origine isolée de la rhizosphère A. thaliana est construite. Il est démontré que la présence de ces diverses espèces bactériennes peut être mesurée à l'aide de cet analyse hydroponique de la mainntuence des plantes, qui offre une alternative aux études communautaires bactériennes basées sur le séquençage. De futures études utilisant ce système pourraient améliorer la compréhension du comportement bactérien dans les microbiomes végétaux multispécifiques au fil du temps et dans les conditions environnementales changeantes.

Le PGPB P. simiae WCS417r bien caractérisé est connu pour coloniser les racines de A. thaliana dans la culture hydroponique. Cette bactérie naturellement fluorescente peut facilement être visualisée à l'aide de microscopie sur les racines des semis après la colonisation (figure 2). Bien qu'il soit possible d'imaginer toute la longueur de ces racines de semis A. thaliana (4 à 6 mm de longueur), cela prendrait un temps prohibitif pour...

Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.

Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

La plupart des expériences étudient les interactions plantes-microbes en se concentrant sur la colonisation, mais notre protocole est conçu pour examiner à la fois la colonisation et le maintien des bactéries sur la racine. Nous pouvons changer l’expérience pour s’adapter à différentes bactéries et plantes, et nous pouvons même tester plusieurs bactéries dans chaque plaque de 24 puits. Pour commencer, utilisez un poinçonneur de trou standard pour créer des disques de maille en plastique.Recueillir les disques dans un récipient en verre, et couvrir lâchement. Stériliser à l’aide d’un jeu d’autoclave sur un cycle sec de 20 minutes. Utilisez des pinces à épiler stérilisées par flamme pour distribuer environ 40 disques en maille stérilisés en une seule couche à la surface de la plaque d’agar moyenne de croissance végétale préparée précédemment.Placer deux graines précédemment stérilisées au centre de chaque maille. Sceller l’assiette avec du ruban chirurgical, et incuber pendant deux à six jours à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pour vernaliser les graines. Ensuite, placez le côté agar de la plaque dans une chambre de croissance végétale pendant huit à dix jours sous des réglages de courte journée de neuf heures de lumière à 21 degrés Celsius et 15 heures d’obscurité à 18 degrés Celsius pour germer et faire pousser des semis.Ajouter un millilitre de milieu de croissance bactérienne à chaque puits d’une plaque stérile de 24 puits. Pour transférer les semis germés enchâssés dans le maillage, utilisez des forceps stérilisés par flamme pour peler délicatement le maillage contenant deux semis germés, de taille égale et intacts, de haut en large de la plaque d’agar. Transférer un flotteur avec des semis à chaque puits de liquide de croissance bactérienne, côté racine vers le bas.Ensuite, resuspendez les bactéries cultivées du jour au lendemain sur des plaques d’agar dans le milieu de croissance bactérienne liquide. Ajouter 10 microlitres de suspension bactérienne à chaque puits, à l’exception des puits de contrôle à base de médias seulement, pour une concentration finale d’un million d’unités de formation de colonies de bactéries par puits. Pour sceller la plaque pour une croissance stérile, pressez soigneusement le film perméable au gaz sur la plaque sans toucher le côté collant.Appliquez une pression autour de chacun des anneaux fabriqués par les puits pour vous assurer que chaque puits a été scellé individuellement. Ensuite, fermez la plaque avec son couvercle en plastique confortablement sur le film perméable au gaz. Placer la plaque dans une chambre de croissance végétale sur un shaker de plaque orbitale réglé à 220 rpm, et incuber pendant 18 heures dans les mêmes conditions que les semis ont été germés à l’origine.Pour rincer tous les flotteurs avec des plantes, ajouter un millilitre d’eau stérile à chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits. Retirer le film perméable au gaz de la plaque avec les plantes, et utiliser des forceps stériles pour transférer les flotteurs vers les puits avec de l’eau, et incuber pendant 10 minutes à température ambiante sans agitation. Ensuite, remplissez chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits d’un millilitre de milieu de croissance végétale.Transférer un maillage à chaque puits et couvrir d’un joint perméable au gaz. Incuber pendant 72 heures sur le shaker orbital à 220 rpm dans la chambre de croissance des plantes. Après l’incubation, rincer les plantes comme auparavant.Après le rinçage, retirer les semis du maillage en plaçant doucement des forceps stérilisés par flamme sous les feuilles du côté des feuilles du maillage. Pincez légèrement la tige et agitez les semis de haut en loin du maillage pour déloger la racine sans la casser. Pour éliminer les bactéries des racines des plantes, transférez les semis de chaque maille dans les puits individuels d’une plaque de sonication de 24 puits contenant un millilitre d’eau double distillée.Sonicate tous les échantillons dans la plaque à la fois à l’aide d’un sonicateur à plusieurs volets tel que décrit dans le manuscrit. Pour quantifier les bactéries, effectuez des dilutions périodiques 10 fois des échantillons soniques dans le milieu de croissance bactérienne. Étendre à l’aide de perles de verre stériles et incuber à la température optimale pour les bactéries jusqu’à ce que les colonies individuelles soient dé countables.Pour recueillir les racines intactes des plantes, utilisez des forceps pour enlever les semis du maillage. Ensuite, transférez chaque plante sur une lame de microscope en plaçant la pointe de la racine sur la lame et en la faisant glisser loin de la pointe pour régler la chasse d’eau avec la lame, assurant ainsi une racine redressée pour une meilleure imagerie. Ajoutez une goutte d’eau ou un milieu stérile de croissance végétale à chaque échantillon pour hydrater les interfaces entre les couvertures et les toboggans.Placez un coverslip en verre juste au-dessus de la couronne de racine et sous les feuilles de pousse pour éviter l’inclinaison du coverslip, et appuyez doucement vers le bas. Ensuite, imagez les bactéries à l’aide de filtres d’excitation/émission appropriés pour différencier les bactéries les unes des autres et la racine des plantes. Pseudomonas simiae, bactérie naturellement fluorescente, a colonisé les racines d’Arabidopsis thaliana et a été maintenue sur la racine après transfert au milieu de croissance des plantes.La couronne de racine, la mi-longueur, et la pointe montrent la fluorescence due à la colonisation de Pseudomonas simiae. Le contrôle négatif sans bactéries n’a montré aucune colonisation. Lorsque pseudomonas simiae sur les racines arabidopsis thaliana ont été quantifiés après 18 heures de colonisation ou 72 heures d’entretien, le nombre total d’unités de formation de colonies par semis à chaque point de temps a montré une bonne reproductibilité à travers les répliques biologiques effectuées à différents jours.Il y a eu une augmentation du nombre d’unités formant des colonies par semis après 72 heures dans le milieu d’entretien, par rapport aux nombres observés au point de temps de 18 heures après la colonisation, ce qui indique que la croissance active des bactéries colonisées sur la racine de la plante s’est produite pendant l’étape d’entretien. Trois espèces de bactéries isolées d’Arabidopsis thaliana cultivées en sol naturel dans des conditions de laboratoire ont été utilisées pour surveiller l’association de plusieurs espèces sur les racines des plantes. Ils ont été clairement différenciés sur les supports contenant X-gal en raison de différences dans la morphologie et la couleur des colonies, ce qui a permis de compter les unités de formation de colonies par semis de chaque espèce sans sélection d’antibiotiques, même en coculture multi-espèces.Ces trois espèces de bactéries ont toutes été colonisées et maintenues sur la racine, que ce soit seule ou en coculture bactérienne. Chaque espèce a montré des tendances similaires selon différentes répliques biologiques et techniques, montrant que ce protocole peut être utilisé pour mesurer les unités relatives ou totales de formation de colonies par racine de chaque espèce. Lorsqu’elles sont cultivées seules, aucune espèce n’a montré d’augmentation substantielle de l’abondance au cours de l’étape d’entretien, mais l’ensemble des unités de formation de colonies par racine de la communauté combinée a augmenté dans les cocultures, ce qui indique que ces bactéries n’interdisent pas la colonisation des autres souches.Les étapes les plus difficiles sont celles qui nécessitent l’enlèvement de plantes intactes des disques en maille. Être patient et doux rendra cela possible. Si les cellules bactériennes sont fluorescentes, les échantillons pourraient être triés par cytométrie d’écoulement pour déterminer le nombre relatif de cellules.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Source : Harris, S. L., et al. Surveillance de la colonisation bactérienne et de l’entretien des racines d’Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo démontre un protocole pour surveiller la colonisation de bactéries associées aux racines sur des semis d’Arabidopsis thaliana cultivés dans un système sans sol. Après la colonisation, les bactéries sont déplacées par sonication, puis diluées, placées et incubées pour former des colonies reflétant...

Surveillance de la colonisation bactérienne des racines d’Arabidopsis thaliana dans un système sans sol

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Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l&#39;aide du<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystème

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Un système de co-culture hydroponique pour l&#39;analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

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