Visualisation de la protéine Kinase Une activité chez des souris à behaving à l'aide de la microscopie d'imagerie à deux photons in vivo fluorescence à vie
7 juin 2019
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Une procédure est présentée pour visualiser les activités de kinase a de protéine dans les souris head-fixed, se comportant. Un journaliste amélioré d'activité de A-kinase, tAKARMD, est exprimé dans les neurones corticaux et rendu accessible pour la formation image par une fenêtre crânienne. La microscopie d'imagerie à vie à deux photons est utilisée pour visualiser les activités de LPJ in vivo pendant la locomotion forcée.
Notre méthode utilise une nouvelle protéine kinase Un capteur appelé cible A kinase reporter d’activité alpha, ou tAKAR
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Aperçu
Cette étude présente une procédure permettant de visualiser l'activité de la protéine kinase A (PKA) chez des souris fixées par la tête et en activité comportementale, à l'aide d'un capteur amélioré d'activité PKA, le tAKARα. Le capteur est exprimé dans les neurones corticaux et permet une imagerie à travers une fenêtre crânienne par microscopie à deux photons de fluorescence en temps de vie durant la locomotion.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Techniques d'imagerie
- Signalisation par la protéine kinase
Contexte
- La protéine kinase A joue un rôle crucial dans la signalisation neuronale et la plasticité.
- La compréhension de l'activité de la PKA in vivo peut fournir des informations sur les mécanismes comportementaux.
- Les souris fixées par la tête permettent l'observation de comportements tout en contrôlant les variables externes.
- Les méthodes d'imagerie précédentes présentent des limites que cette étude vise à surmonter.
Objectif de l'étude
- Visualiser l'activité de la PKA chez des souris en mouvement pendant la locomotion.
- Utiliser une technique d'imagerie avancée afin d'obtenir des informations sur la dynamique des signaux cérébraux.
- Améliorer les méthodes existantes de visualisation des activités des kinases chez des animaux vivants.
Méthodes utilisées
- Utilisation de la microscopie d'imagerie à durée de vie de fluorescence biphotonique comme plateforme principale d'observation.
- Le modèle biologique clé consiste à exprimer le rapporteur tAKARα dans les neurones corticaux de souris fixées par la tête.
- Les souris sont soumises à une locomotion forcée afin d'étudier les modifications de l'activité de la PKA.
- L'imagerie est réalisée à travers une fenêtre crânienne, permettant des observations en temps réel.
Résultats principaux
- L'étude parvient à visualiser et à suivre l'activité de la PKA in vivo, démontrant ainsi la dynamique de la signalisation cellulaire pendant le comportement.
- Les variations observées de l'activité de la PKA sont corrélées à la locomotion, soulignant le rôle mécanistique de la PKA dans le comportement.
- Les résultats indiquent des améliorations méthodologiques significatives par rapport aux techniques d'imagerie précédentes.
Conclusions
- La présente étude démontre une nouvelle approche permettant de visualiser l'activité de la PKA, offrant ainsi une meilleure compréhension de la signalisation neuronale pendant le comportement.
- Les résultats ont des implications pour les recherches futures sur les mécanismes neuronaux et la plasticité.
- Dans l'ensemble, les avancées méthodologiques présentées pourraient améliorer les études en neurosciences du comportement.
Questions fréquemment posées
Quels sont les avantages de l'utilisation de souris à tête fixe pour l'imagerie de la PKA ?
Les souris fixées au niveau de la tête permettent un contrôle précis des conditions expérimentales tout en permettant l'étude de l'activité neuronale pendant des comportements naturalistes tels que la locomotion.
Comment le rapporteur tAKARα est-il exprimé chez les souris ?
Le traceur tAKARα est exprimé dans les neurones corticaux, permettant l'imagerie en temps réel des activités de la PKA pendant des tâches comportementales.
Quels types de données peuvent être obtenus à partir de cette méthode d'imagerie ?
La méthode fournit des données sur la dynamique de l'activité de la PKA, permettant aux chercheurs de corréler l'activité de la kinase avec des comportements spécifiques et des réponses neuronales.
Cette méthode peut-elle être adaptée à d'autres types d'imagerie des kinases ?
Oui, la technique d'imagerie et la conception du marqueur pourraient être modifiées afin d'étudier différentes kinases, élargissant ainsi leur application à diverses voies de signalisation en neurosciences.
Quelles sont les limites de cette méthode d'imagerie ?
Les limites peuvent inclure une interférence potentielle provenant d'autres voies de signalisation cellulaire et la nécessité de procédures chirurgicales pour implanter des fenêtres crâniennes.
Comment la microscopie d'imagerie de la durée de vie de la fluorescence à deux photons améliore-t-elle les observations ?
La microscopie à deux photons permet une pénétration plus profonde dans les tissus et provoque moins de photodommages, ce qui autorise une imagerie détaillée des processus cellulaires dynamiques in vivo.
Quelles sont les implications de ces résultats pour les neurosciences comportementales ?
Les résultats apportent des éclairages sur le rôle de la PKA dans la signalisation neuronale pendant le comportement, ce qui pourrait influencer les recherches futures sur les mécanismes d'apprentissage et de mémoire.
Pertinence sectorielle pour les cadres
La visualisation des dynamiques de signalisation intracellulaire chez des animaux en activité comble le fossé entre les mécanismes moléculaires et les phénotypes comportementaux, une étape cruciale pour la validation de cibles en découverte de médicaments du système nerveux central. Cette méthode permet un suivi en temps réel, avec une résolution au niveau cellulaire unique, de l'activité de la PKA — un point de convergence pour plusieurs voies de neuromodulation — durant des comportements définis, offrant ainsi une dé-risquisation mécanistique pour les cibles situées en amont de la signalisation par l'AMPc. En corrélant l'activité de la kinase avec la locomotion chez des souris fixées par la tête, cette approche renforce la confiance prédictive dans l'engagement de la cible et la modulation de la voie, orientant les décisions précoces de type aller/ne pas aller dans les programmes de médicaments neuropsychiatriques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en visualisant l'activité de la PKA comme indicateur de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G neuromodulateurs dans des populations neuronales définies.
- Valeur opérationnelle : Permet une validation fonctionnelle des cibles dans des circuits neuronaux intacts pendant le comportement, réduisant ainsi l'ambiguïté mécanistique dans le choix des cibles.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en associant la modulation de la cible à des changements mesurables de l'activité kinase durant des états comportementaux pertinents.
Développement de tests et de criblages
- Prêt de l'essai : Prépare des systèmes biologiques validés (neurones corticaux exprimant tAKARα) en vue de criblages de composés ciblant des protéines neuromodulatrices.
- Données quantitatives : Fournit des mesures de durée de vie de la fluorescence (FLIM) basées sur la transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET), permettant une évaluation normalisée et reproductible des variations de l'activité de la PKA en réponse à des perturbations pharmacologiques.
- Extensibilité : La fenêtre crânienne chronique et la préparation avec fixation de la tête permettent des sessions d'imagerie répétées, facilitant ainsi une évaluation longitudinale des effets des composés sur la dynamique des voies de signalisation.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Applicable à l'étude d'une régulation altérée de la PKA dans des modèles de troubles neuropsychiatriques où la signalisation neuromodulatrice est altérée.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la validation précoce de cibles thérapeutiques et les tests d'efficacité préclinique en assurant une mesure cohérente de l'activité de la voie de signalisation à travers les différentes étapes.
- Progression ajustée au risque : Permet une évaluation précoce de l'engagement des composés candidats sur leurs cibles et de leur capacité à moduler la signalisation en aval chez des animaux en comportement, orientant ainsi le choix des doses et des biomarqueurs fondés sur le mécanisme d'action.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur la cible à l'identification de candidats puis à la validation préclinique, en fournissant un indicateur mécanistique qui éclaire les décisions de progression à chaque étape.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en visualisant les variations de l'activité de la PKA en réponse à la libération de neuromodulateurs ou à la modulation de récepteurs pendant le comportement.
- Écrantage : Permet la mise en place d'essais pour évaluer les effets de composés sur la signalisation cAMP/PKA dans des réseaux neuronaux avec une résolution au niveau cellulaire.
- Analytique : Génère des mesures quantitatives de FRET basées sur le FLIM, permettant de comparer les dynamiques de signalisation selon les conditions, les génotypes ou les traitements.
- Recherche translationnelle : S'intègre aux travaux précliniques en fournissant un indicateur transposable de l'activation de la voie, pouvant être reflété dans des stratégies de biomarqueurs.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'étude de multiples cibles neuromodulatrices convergeant vers la PKA, applicable à différentes régions cérébrales et paradigmes comportementaux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive dans le mécanisme ciblé en visualisant directement l'activité des kinases comme un indicateur fonctionnel de la modulation de la voie de signalisation.
- Valeur opérationnelle : Normalise la mesure de la signalisation intracellulaire au moyen de capteurs génétiquement codés et de la microscopie de durée de vie en fluorescence (FLIM), réduisant ainsi la variabilité dans l'évaluation des voies.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en reliant l'engagement du cible aux modifications de la signalisation en aval dans des contextes comportementaux pertinents.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation des composés ajustée au risque, en fonction de leur capacité à moduler l'activité de la PKA chez des animaux en comportement, réduisant ainsi les échecs en phase avancée dus à l'absence de modulation de la voie cible.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la livraison de vecteurs viraux ou l'électroporation in utero pour l'expression neuronale de capteurs génétiquement codés.
- Dépend de l'infrastructure d'imagerie par microscopie de durée de vie de fluorescence à deux photons et d'une expertise dans l'acquisition et l'analyse des données FLIM.
- Exige des protocoles standardisés pour la préparation sous fixation crânienne, l'entraînement comportemental et l'entretien de fenêtres chroniques afin d'assurer la reproductibilité entre les études.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la méthode à différentes régions cérébrales ou à des tests comportementaux autres que la locomotion.
- Les limitations pratiques incluent la complexité chirurgicale et la variabilité potentielle des niveaux d'expression des capteurs, qui doivent être contrôlées pour des comparaisons quantitatives.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Pourquoi le test d'hypothèse nulle est-il important pour la validation de la cible lors de la visualisation de l'activité de la PKA ?
Le test d'hypothèse nulle détermine si les variations observées de l'activité de la PKA au cours du comportement sont statistiquement significatives, plutôt que dues à des fluctuations aléatoires, fournissant ainsi une preuve rigoureuse de l'interaction avec la cible et de la modulation de la voie dans les études précliniques.
Comment l'isolement de la variable indépendante s'intègre-t-il au processus de découverte dans les études d'imagerie de la PKA ?
L'isolement de variables indépendantes, comme la libération d'un neuromodulateur spécifique ou l'activation d'un récepteur, permet aux chercheurs d'attribuer les changements d'activité de la PKA à des cibles définies, soutenant ainsi une détection mécanistique des risques en phase précoce de découverte.
Quelles mesures quantitatives de variables dépendantes permettent d'évaluer l'activité de la PKA chez des souris en activité comportementale ?
Les variations de FRET mesurées par FLIM à deux photons fournissent des lectures quantitatives des dynamiques d'activité de la PKA, permettant leur corrélation avec les états comportementaux et les interventions pharmacologiques.
Pourquoi les exigences de réplication sont-elles importantes pour la collaboration interfonctionnelle dans les flux de travail d'imagerie PKA ?
La réplication garantit que les mesures de l'activité de la PKA sont cohérentes entre les animaux, les séances et les laboratoires, ce qui est essentiel pour un partage fiable des données entre les équipes de découverte, précliniques et translationnelles.
Quelles sont les capacités d'analyse statistique requises avant la mise en œuvre de l'imagerie PKA FLIM dans la découverte de médicaments ?
Des capacités d'analyse des données FRET en série temporelle, de comparaison des distributions entre différentes conditions et de modélisation des relations entre l'activité de la kinase et le comportement sont nécessaires pour extraire des informations significatives à partir des jeux de données d'imagerie.
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Motorized Treadmill Construction
3:22
In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging (2pFLIM) Microscopy
6:29
2pFLIM Image Analysis
8:38
Results: Representative 2pFLIM Data Quantification and Targeted A-Kinase Activity-reporter-alpha (t-AKAR-alpha) Tracking
9:29
Conclusion
