Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale

Nos protocoles fournissent un point de départ pour les études fonctionnelles du développement et de la physiologie des lentilles et pour le dépistage génétique inverse des phénotypes des lentilles chez le poisson zèbre. Nos protocoles permettent de faire le pont entre les analyses in vitro et in vivo de la morphologie de la membrane de la lentille du poisson zèbre et fournissent une méthode nouvelle et simple pour quantifier le développement de l’optique des lentilles de poisson zèbre. L’analyse de la morphologie et de l’optique des lentilles de poisson zèbre permet de mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement des lentilles, la physiologie normale et la pathophysiologie.

Ces idées peuvent à leur tour conduire à une capacité de retarder ou de prévenir la cataracte. Il n’y a eu aucun rapport chez d’autres espèces que le poisson zèbre de noyaux de lentilles localisés asymétriquement. L’identification des sutures de lentille est essentielle pour orienter correctement la lentille pour mesurer la localisation du noyau.

Après confirmation d’une sédation suffisante avec Tricaine, utilisez des ciseaux de microdissection pour exciser immédiatement les deux yeux d’un poisson zèbre adulte ou larvaire et placez les deux yeux dans une boîte petri sur mesure de 35 millimètres avec un moule de dissection en silicone rempli de PBS. Pour récolter la lentille à partir d’un poisson zèbre adulte, placez le côté postérieur de l’œil vers le haut et insérez des forceps à un angle inférieur à 45 degrés à travers le disque optique. Utilisez des ciseaux de dissection pour faire deux ou trois incisions radiales à travers la rétine et la sclère du disque optique à la zone ciliaire dans l’œil immobilisé et peler la rétine et la sclère comme des pétales de fleurs.

Inverser l’œil, côté cornée vers le haut, et utiliser le côté plat des ciseaux pour immobiliser la lentille indirectement par la manipulation de la sclère et la cornée en utilisant des forceps pour retirer la rétine et les tissus attachés, puis soigneusement couper tout excès de tissu de la lentille. Pour la récolte larvaire de lentille de poisson zèbre, placez un côté postérieur d’oeil larvaire vers le haut sur la partie plate d’un plat de silicone de PBS et emploiez une aiguille aiguisée de tungstène pour faire des coupures radiales par la rétine et la sclère tout en immobilisant l’oeil avec une autre aiguille ou forceps, puis ramassez doucement la lentille de l’oeil dissocié avec le côté émoussé d’une aiguille faite sur commande de fil de tungstène et retirez soigneusement le tissu attaché. Pour mesurer la localisation du noyau de l’axe antérieur-postérieur, orientez les lentilles fraîchement excisées axially dans PBS dans un plat de 35 millimètres avec un fond de verre de couverture avec les poteaux et les sutures orientées parallèlement au plan de mise au point.

Pour identifier le noyau de la lentille, recherchez une différence dans l’indice réfractif, qui se produit habituellement à l’interface du cortex de la lentille et du noyau de la lentille. Si les sutures de lentille ne sont pas apparentes, un léger léchage avec des forceps à la capsule de la lentille révèle les sutures et le noyau de la lentille, aidant à orienter la lentille pour la mesure. Placez le plat sur la scène d’un microscope de dissection équipé d’une caméra et imagez les lentilles avec le noyau de l’objectif au point sous l’éclairage lumineux ou avec l’optique différentielle de contraste d’interférence.

Imagez un micromètre sous le même grossissement pour l’étalonnage et cliquez sur Live View. Cliquez sur Instantané pour obtenir une image et enregistrer l’image en tant que fichier TIFF. Pour calibrer les images de lentilles acquises, dans un logiciel de traitement d’image approprié, sélectionnez l’outil en ligne droite et tracez une ligne de longueur connue sur l’image du micromètre.

Cliquez sur Analyser et définir l’échelle et entrez la distance et les unités connues, puis sélectionnez Étalonnage global et cliquez sur OK. Pour mesurer la distance entre le centre du noyau de la lentille et le pôle antérieur, identifiez l’emplacement de la suture de la lentille et utilisez l’outil en ligne droite pour tracer une ligne à travers le centre image du noyau de la lentille dans une orientation axiale. Le centre de cette ligne est le centre du noyau de la lentille. Tracez une autre ligne à partir de ce point vers le pôle antérieur de la lentille et sélectionnez Mesurer dans le menu Analyser pour mesurer la distance.

Tracez une autre ligne du pôle antérieur au pôle postérieur et mesurez cette distance comme diamètre de la lentille, puis copiez ces longueurs de la fenêtre Résultats à une feuille de calcul et calculez la localisation normalisée du noyau de la lentille par rapport au rayon de la lentille. Par trois jours après la fécondation, des sutures antérieures se forment au pôle antérieur et la convergence frappante des cellules est clairement visualisée par la coloration de phalloidin des membranes étroites de cellules de fibre dans les embryons fixes. L’étiquetage plus fort de cellules à fibres larges dans la membrane de lentille localisée mApple transgénique permet la visualisation en direct des sous-bois membranaires, mais n’a pas la convergence suturale.

Les sutures postérieures peuvent être visualisées in vitro et in vivo à trois jours après la fécondation. Dans un plan équatorial, la phalloidine étiquette fortement les cellules externes de fibre corticale, révélant une forme hexagonale aplatie. Phalloidin est exclu du noyau de lentille compacté et de type sauvage et lentille mutante look indiscernable.

La forte étiquetage des cellules à fibres larges dans les mosaïques mApple localisées par la membrane des lentilles transgéniques révèlent des perturbations du volume cellulaire dans la lentille mutante. Comme l’expression transgénique n’est pas limitée par la perméabilité, certaines mosaïques révèlent l’étiquetage du noyau de la lentille. Chez les animaux de type sauvage, le noyau de la lentille commence plus près du pôle de lentille antérieur au cours des premiers stades du développement avant de se centraliser à l’âge adulte.

L’expression de protéines étiquetées vertes dans un hôte transgénique dans lequel les membranes cellulaires fluoresce rouge permet la localisation simultanée des protéines ainsi que l’évaluation de la morphologie des cellules fibreuses in vivo. Le poisson zèbre est particulièrement bien adapté pour les études in vivo. En utilisant les outils décrits ici, nous pouvons sonder les mécanismes de lentille, largement étudiés in vitro, dans un système in vivo.