Name: Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Apprenez l'expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34+ du sang de cordon ombilical humain à l'aide d'un cocktail de cytokines et d'acide valproïque. Cette méthode simple et fiable augmente significativement le nombre de cellules souches fonctionnelles pour la médecine régénérative et la thérapie cellulaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par NYSTEM accorder C030136 à R.H. Nous tenons à remercier Bartek Jablonski pour ses commentaires et la révision du manuscrit

Le HSC ex vivo protocole d’expansion suit les directives de la Commission d’éthique de recherche au Mount Sinai School of Medicine.
1. tampon et la préparation des médias
<ol><li>Préparer le tampon de séparation 24 h avant l’isolement du CD34+ cellules de canettes usagées en ajoutant 2 mL de 0,5 M éthylène Diamine tétra-acétique (EDTA) et 33 mL de 7,5 % albumine sérique Bovine (BSA) à 465 mL tamponné physiologique (solution de 1 PBS x). Mélanger doucement et maintenir le tampon durant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Médias chauds à température ambiante le jour de la purification.</li>
</ol>2. isolement de cellules Mononuclées (PTM) de l’unité de l’UCB
<ol><li>Distribuer l’ensemble de l’UCB dans une fiole de2 75 cm. Diluer et mélanger doucement l’UCB avec un volume égal de PBS à température ambiante.</li>
	<li>Déterminer le nombre de tubes nécessaires pour le traitement de l’ensemble UCB (un tube conique de 50 mL peut être utilisé pour traiter 35 mL d’UCB dilué). Ajouter 15 mL de média de gradient de densité (voir Table des matières) dans chaque tube et répartir l’UCB dilué sur le dessus de la média de gradient de densité créant deux couches. Remarque : Distribuer l’UCB dilué très lentement en les tenant à un angle de 45° pour empêcher le mélange de la couche de médias de gradient de densité avec l’UCB.</li>
	<li>Centrifuger à 400 g pendant 30 minutes à un faible taux d’accélération et de décélération. Après centrifugation, multinationales localiser dans la couche blanche (couche leuco-plaquettaire) entre la couche de plasma et de densité médias dégradé.</li>
	<li>Aspirer doucement 2/3 du plasma sans déranger la couche de la couche leuco-plaquettaire. Transvaser avec soin la couche leuco dans un nouveau tube de 50 mL. Collecter toutes les multinationales de la même unité UCB dans un tube de 50 mL jusqu'à 25 mL. Utilisez un nouveau tube si le volume des multinationales collectées dépasse 25 mL.</li>
	<li>Ajouter 25 mL de PBS froid dans le tube contenant 25 mL de multinationales et bien mélanger. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min à 4 ° C. Remarque : PBS froid est important pour prévenir le bouchage des anticorps à la surface des cellules et réduire non spécifiques d’étiquetage.</li>
	<li>Aspirer soigneusement le surnageant et doucement resuspendre le culot dans 50 mL de PBS froid.</li>
	<li>Retirez 20 μL de la suspension cellulaire pour le comptage. Compter le nombre de cellules coloré avec l’iodure de l’acridine orange/propidium coloration à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Calculer le nombre total des multinationales. Remarque : Le nombre d’éléments peut être également effectué par la méthode d’exclusion bleu trypan utilisant un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C. Remarque : Si ne pas requis immédiatement, multinationales peuvent être congelés à ce stade.</li>
</ol>3. isolement de CD34+ les cellules de l’UCB
<ol><li>Préparer le CD34+ anticorps couplé à la solution de billes magnétiques pour l’isolement de CD34+ cellules de PTM. Mix 300 µL de tampon de séparation avec 100 µL d’IgG humaine humaines FcR (réactif de blocage) et 100 µL de CD34 billes magnétiques pour l’isolement de CD34 + des cellules de chaque 10 multinationales de8 . Pour l’isolation d’un plus grand nombre de CD34+ cellules de (> 108) MNC, intensifier les réactifs en conséquence.</li>
	<li>Soigneusement aspirer le surnageant du tube centrifugé à étape 2.8. Resuspendre le culot dans la solution de billes magnétiques CD34 préparée à l’étape 3.1 (utiliser 500 µL de solution par 108 cellules).</li>
	<li>Mélanger doucement et laisser incuber à 4 ° C pendant 30 min. Remarque : Préparer le dispositif séparateur de cellule (voir Table des matières) au cours de la période d’incubation. Remplacer la solution de stockage avec le tampon de travail comme indiqué par le fabricant et exécuter un programme de lavage suivi d’un programme de rinçage.</li>
	<li>Ajouter un séparateur de cellule glaciale tampon en cours d’exécution dans le tube contenant le mélange de la cellule jusqu'à ce que le tube est complètement rempli. Centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans le séparateur de cellule glaciale tampon (2 mL/108 cellules). Transférer le 2 mL du mélange de suspension cellulaire dans des tubes de 15 mL.</li>
	<li>Jeux de charges 3 tubes de 15 mL dans le rack de séparateur de cellule prérefroidies à 4 ° C. Un ensemble de tubes contient des multinationales, la deuxième série de tubes serviront à recueillir la fraction de négative et le troisième ensemble de tubes serviront à recueillir CD34 purifiée+ cellules.</li>
	<li>Charger le panier dans le dispositif de séparateur de cellule et exécutez le programme préétabli de posseld2 . Remarque : Une autre méthode qui utilise le séparateur magnétique manuel peut servir à remplacer la cellule de dispositif séparateur12 .</li>
	<li>Tubes à centrifuger avec la fraction positive à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le CD34 purifiée+ cellules dans 1 mL de sérum.</li>
	<li>Compter les cellules colorées avec l’iodure de l’acridine orange/propidium à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Remarque : Si ne pas requis immédiatement, purifié CD34+ cellules peuvent être congelés à ce stade.</li>
</ol>4. APV Ex Vivo Expansion de purifiée cellules UCB-CD34+ 
<ol><li>Préparer un volume suffisant de médias pour le CD34 purifiée sur plaque+ des cellules à une densité de 3,3 x 104 cellules/mL. La composition de milieux de culture est le milieu de culture sans sérum (voir Table des matières) additionné de 10 µL/mL stylo/strep, 150 ng/mL facteur de cellules souches (SCF), 100 ng/mL fms-like tyrosine kinase du récepteur 3 (ligand FLT3), 100 ng/mL thrombopoïétine (TPO), et 50 ng/mL interleukine 3 (IL-3).</li>
	<li>Plaque purifiée CD34+ des cellules dans une plaque de 12 puits (5 x 104 CD34+ cellules / 1,5 mL de médias / bien) et de la culture à 37 ° C dans une étuve humide de2 CO 5 %.</li>
	<li>Évaluer la pureté du CD34 isolé+ des cellules et la composition cellulaire par analyse des FACS comme décrit ci-dessous dans l’étape 6.3.</li>
	<li>Ajouter APV à une concentration finale de 1 mM dans les cultures de cellules traitées pendant 16 h avec cocktail de cytokine.</li>
	<li>Les cellules de la culture pour une période supplémentaire de 7 jours à 37 ° C dans une étuve humide de2 CO 5 %. Remarque : Médias reste inchangé pendant toute la durée de l’ex vivo expansion.</li>
</ol>5. les anticorps coloration pour l’analyse en cytométrie en flux
<ol><li>Préparer la solution de coloration à l’anticorps pour souiller 2 x 104-6 x 104 cellules et isotype solution pour déterminer des FACS gating stratégie et déterminer le degré de liaison non spécifique. Diluer les anticorps (1/100 APC anti-CD34, 1/200 FITC anti-CD90) et les isotypes respectifs dans 50 µL de tampon de séparation (composition du tampon de séparation est définie à l’étape 1.1). Remarque : Effectuer la coloration unique des cellules avec chacun des anticorps pour un AFS gating stratégie. Kit de billes anticorps total compensation (voir Table des matières) peut être utilisé pour l’installation de compensation.</li>
	<li>Homogénéiser la culture cellulaire en pipettant également plusieurs fois. Compter les cellules et pipette 5 x 104 cellules dans un tube de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon de séparation et centrifuger à 400 x g pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 50 µL de la solution colorante. Incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 450 µL de tampon de séparation et centrifuger à 400 x g pendant 15 min à température ambiante.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans 100 µL de tampon de séparation. Conservez les cellules sur la glace pendant au moins 5 min jusqu'à effectuer des analyses de FACS. Ajouter 1 µL de 7-AAD à la porte des cellules viables.</li>
	<li>Charger l’échantillon de cellules colorées sur la machine de FACS et d’acquérir des cellules au débit le plus bas.</li>
	<li>Pour chaque fluorophore, analyser l’isotype contrôles et les cellules colorées unique de mettre en place le blocage pour FITC (CD90), APC (CD34) et PerCP/Cy5.5 (7-AAD) coloration.</li>
	<li>PerCP/Cy5.5 négatifs fraction et intrigue APC vs FITC pour déterminer le pourcentage de CD34 viable la porte+, CD90+et CD34+CD90+ cellules qui définit la population HSPC/HSC dans la culture.</li>
</ol>6. les anticorps coloration pour écoulement Cytometry cellule tri
<ol><li>Remettre en suspension les cellules élargis en pipettant également plusieurs fois. Compter le nombre de cellules et de transférer toute la culture dans un tube de 15 mL ou 50 mL.</li>
	<li>Remplir le tube avec le tampon de séparation froid</li>
	<li>Centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer la solution de coloration à l’anticorps sur la tache de 5 x 105– 2 x 106 cellules et isotype solution pour souiller 1 x 105 cellules et déterminer le blocage des FACS. Diluer 1/10 (APC anti-CD34), 1/20 (FITC-CD90) les anticorps et les isotypes correspondante dans 500 µL de séparation tampon par chaque État.</li>
	<li>Préparer les commandes de compensation couleur unique à l’aide d’un kit de billes anticorps total compensation conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Transférer le surnageant de l’étape 5.2 dans un nouveau tube et le maintenir à 37 ° C. Ce support de culture seront réutilisé pour la culture des cellules triées.</li>
	<li>Resuspendre le culot dans le tampon de séparation froid pour obtenir une concentration de 5 x 105 cellules / mL. Transférer 1 x 105 cellules dans des tubes de 1,5 mL pour la coloration d’isotype et les cellules restantes qui seront triés dans les autres tubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension les granules des cellules dans l’isotype coloration solution et le culot de cellules qui sera trié dans l’anticorps solution de coloration.</li>
	<li>Incuber 30 min à 4 ° C.</li>
	<li>Ajouter 450 µL de tampon de séparation et centrifuger à 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Remettre en suspension les pellets avec 2 mL de tampon de séparation froid.</li>
	<li>Pour empêcher les sabots, filtrer les échantillons par un 40 μm cellule crépine et lieu sur la glace jusqu'à FACS.</li>
	<li>Trieur de cellules de mise en place de tri avec les paramètres corrects.</li>
	<li>Exécuter les exemples d’isotype pour régler la tension et de gain pour la marche avant et de diffusion latérale et d’identifier les populations de fluorescence négative.</li>
	<li>Contrôles d’exécution unicolores de définir les coefficients de compensation et d’appliquer compensée paramètre de protocole de collecte.</li>
	<li>Exécutez une petite aliquote de l’échantillon (Ab) (~ 50 000 événements) pour établir la stratégie de blocage.</li>
	<li>Mettre en place des décisions de la sorte pour recueillir le CD34+ CD90 fraction cellulaire– .</li>
	<li>Cellules de tri dans les tubes de prélèvement couchés avec 2 mL de tampon de séparation.</li>
	<li>Après le tri, racontent les cellules et les centrifuger à 400 g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	<li>Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans les médias récupérés à l’étape 5.5 pour atteindre une concentration finale de 3 x 104 cellules/mL.</li>
	<li>Plaque CD34+ CD90– purifiée cellules dans des boîtes de 12 puits avec 1,5 mL moyen/puits (5 x 104 CD34+ CD90– cellules/1.5 mL de médias/puits).</li>
	<li>Évaluer la pureté par analyse de FACS en utilisant 50 µL de cellules contenant de médias.</li>
	<li>Traiter les cultures de CD34+CD90– cellules avec APV à concentration finale de 1mM.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans une étuve humide de2 CO 5 %.</li>
</ol>

<ol><li>Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+the+efficacy+of+engraftment+of+cord+blood+for+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+and+Apheresis+Science%22%5BJournal%5D)">Enhancing the efficacy of engraftment of cord blood for hematopoietic cell transplantation.</a> Transfusion and Apheresis Science. 54 (3), 364-372 (2016).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cord+blood+expansion.+Pyrimidoindole+derivatives+are+agonists+of+human+hematopoietic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal.</a> Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).</li>
<li>Chaurasia, P., Gajzer, D. C., Schaniel, C., D'Souza, S., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+induces+the+expansion+of+cord+blood+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming induces the expansion of cord blood stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (6), 2378-2395 (2014).</li>
<li>Wagner, J. E. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I%2FII+Trial+of+StemRegenin-1+Expanded+Umbilical+Cord+Blood+Hematopoietic+Stem+Cells+Supports+Testing+as+a+Stand-Alone+Graft%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase I/II Trial of StemRegenin-1 Expanded Umbilical Cord Blood Hematopoietic Stem Cells Supports Testing as a Stand-Alone Graft.</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 144-155 (2016).</li>
<li>Peled, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide%2C+a+SIRT1+inhibitor%2C+inhibits+differentiation+and+facilitates+expansion+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+enhanced+bone+marrow+homing+and+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide, a SIRT1 inhibitor, inhibits differentiation and facilitates expansion of hematopoietic progenitor cells with enhanced bone marrow homing and engraftment.</a> Experimental Hematology. 40 (4), 342-355.e1 (2012).</li>
<li>Nikiforow, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Expansion+of+HSCs%3A+New+Possibilities+for+HSC+Transplants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dramatic Expansion of HSCs: New Possibilities for HSC Transplants?</a> Cell Stem Cell. 18 (1), 10-12 (2016).</li>
<li>Mehta, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Techniques+for+Ex+vivo+Expansion+of+Cord+Blood%3A+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel Techniques for Ex vivo Expansion of Cord Blood: Clinical Trials.</a> Frontiers in Medicine. 2, 89(2015).</li>
<li>Papa, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+HSC+expansion+requires+coordination+of+cellular+reprogramming+with+mitochondrial+remodeling+and+p53+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human HSC expansion requires coordination of cellular reprogramming with mitochondrial remodeling and p53 activation.</a> Blood Advances. 2 (20), 2766-2779 (2018).</li>
<li>Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Role+in+Stemness+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Role in Stemness and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells International. , In press (2019).</li>
<li>Genovese, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+repopulating+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells.</a> Nature. 510 (7504), 235-240 (2014).</li>
<li>Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+Differentiation+and+Platelet+Formation+from+Human+Cord+Blood-derived+CD34%2B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56420(2017).</li>
<li>Fares, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPCR+expression+marks+UM171-expanded+CD34%28%2B%29+cord+blood+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">EPCR expression marks UM171-expanded CD34(+) cord blood stem cells.</a> Blood. 129 (25), 3344-3351 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole visant à développer rapidement de manière significative le nombre de csh humaine fonctionnelle de l’UCB. Les études pilotes et cinétiques utilisant ce protocole indiquent que l’ex vivo cellules élargies rapidement acquérir et conserver l’expression de plusieurs marqueurs phénotypiques HSC CD90 ainsi que primitive HSC caractéristiques métaboliques9.
Ex vivo protocole d’expansion est relativement simple et fiable. Purification de CD34<sup...

Expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de sang de cordon ombilical unités (UCB) est très prometteur pour les applications de HSC en médecine régénératrice et de thérapie de la transplantation. Transplantation avec des unités de l’UCB a plusieurs avantages uniques telles que la collecte facile, haute disponibilité, un risque minime d’infection, le faible risque de rechute de la maladie et de basse fréquence de graft-versus maladie l’hôte (GVH). Toutefois, les principaux inconvénients de leur utilisation dans des milieux cliniques sont du nombre limité de csh présents au sein de chaque unité UCB1. Le nombre insuffisant de csh provoque retard prise de greffe et reprise hématopoïétique, risque de rejet du greffon et de reconstitution immunitaire aberrante.
Actuellement, les différentes méthodes et stratégies ont été développés pour ex vivo, élargir le nombre limité de csh de l’UCB. Combinaisons de différentes cytokines cocktails avec petites molécules ou des composés en ex vivo résultat de cultures à des degrés divers de l’expansion du HSC numéros2,3,4,5,6, 7,8. Ce qui est important, ex vivo culture conditions induisent stress, menant à la prolifération cellulaire rapide, une activité métabolique accrue et la perte des caractéristiques primitives qui définissent les CSH primaire. Par conséquent, les protocoles en développement qui conduisent à l’expansion d’un grand nombre de csh fonctionnelle avec des caractéristiques qui ressemblent étroitement aux primaires autorenouveler primitif sont nécessaires.
Des cultures sans sérum de CD34+ cellules isolées d’UCB et traités avec le résultat de (APV) acide valproïque dans l’expansion d’un grand nombre de primitives autorenouveler4,9,10. L’expansion de HSC n’est pas uniquement due à la prolifération de la csh existantes dérivées de l’UCB. Au lieu de cela, cette expansion est attribuable à l’acquisition d’un phénotype primitif associé à un nombre limité de divisions cellulaires et prolifération9. Dans le première 24 à 48 h d’incubation avec une combinaison de cytokines et VPA, CD34+ cellules acquièrent une transcriptomique et profil phénotypique qui caractérisent les CSH à long terme. L’augmentation significative du pourcentage de csh est accompagnée d’une augmentation rapide du nombre de csh (augmentation de 63 fois dans les 24 h de traitement de l’APV)9. Notamment, la stratégie d’expansion APV-ex vivo s’étend des CSH avec faible activité métabolique, ce qui souligne encore leurs caractères primitifs.
La méthode décrite ici fournit des affections et les traitements qui conduisent à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif pour soit clinique ou les applications de laboratoire. Cette ex vivo stratégie d’expansion utilise un cocktail de cytokine, combiné avec le traitement de l’APV. VPA est un médicament approuvé par la FDA pour le traitement des troubles bipolaires et autres maladies neurologiques. L’expansion de HSC avec APV est rapide et se produit dans les 7 jours, réduisant au minimum la durée de la manipulation et le risque de contamination. Ce qui est important, ce protocole permet l’acquisition de longue durées marqueurs phénotypiques HSC comme CD90 et CD49f sous 24-48 h après traitement avec APV9. Greffes de csh élargis créés avec ce protocole ont la capacité de régénérer le système hématopoïétique, car elles peuvent se différencier en toutes les lignées de cellules hématopoïétiques et établir la greffe à long terme suite à une transplantation chez la souris myeloablated NSG les modèles4. De plus, ce protocole est hautement reproductible et permet une isolation efficace et rapide de CD34 viable+ les cellules de l’UCB, ce qui est essentiel pour l’industrialisation de cette procédure.
L’APV ex vivo protocole d’expansion a également le potentiel pour surmonter la perte importante de csh, qui se produit pendant le gène édition11. Gène montage exige une exposition aux cytokines, qui sont nécessaires pour les cellules cyclisme et l’activation des mécanismes de réparation de l’ADN. En raison des effets rapides de traitement de l’APV, cette méthode peut être bénéfique pour la génération d’un nombre plus élevé de cellules génétiquement modifiées dans un délai qui est pertinente pour actuellement utilisé des protocoles de modification génétique.

<table><tbody><tr><td>Média d’expansion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Stemline II Média d’expansion de cellules souches S0192-500ML</td><td></td></tr><tr><td>AO/PI (orange acridine/iodure de propidium) solution de coloration pour cellules nucléées de mammifères vivants/morts.</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Souris APC Anti-Humain CD34 Clone 581</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>555824</td><td></td></tr><tr><td>Souris APC IgG1, &kappa ; Clone de contrôle d’isotype MOPC-21</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>555751</td><td></td></tr><tr><td>solution de rinçage autoMACS</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tube de 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 5 mL Tube à fond rond en polystyrène</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit, contient des billes cd34 et un réactif bloquant fcr, humain</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-703</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur et trieur de cellules</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Aria II</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometer Auto 2000 Cell Compteur</td><td></td>de viabilité</tr><tr><td>Séparateur de cellules</td><td>autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambres de comptage</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-PD100-002</td><td></td></tr><tr><td>Milieux à gradient de densité</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-humain CD90 ( Thy1) Clone 5E10</td><td>BIOLEGEND</td><td>328108</td><td></td></tr><tr><td>FITC souris IgG1, &kappa ; Isotype Ctrl (FC) Anticorps</td><td>BIOLEGEND</td><td>400109</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td></td><td></td><td></td>inversé</tr><tr><td>PBS</td><td>Corning cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Flt-3 Ligand Protein</td><td>R& D Systems</td><td>308FKN</td><td></td></tr><tr><td>Protéine humaine recombinante IL-3 (IL-3)</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>Protéine SCF humaine recombinante</td><td>R& D Systems</td><td>255-SC</td><td></td></tr><tr><td>Protéine de thrombopoïétine humaine recombinante (TPO)</td><td>R& D Systems</td><td>288-TP</td><td></td></tr><tr><td>Kit de perles de compensation totale d’anticorps</td><td>thermofisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr>Programme de sang placentaire de<td>cordon ombilical</td><td>au New York Blood Center</td><td>http://nybloodcenter.org/products-services/blood-products/national-cord-blood-program/cord-blood-101/</td><td></td></tr> <tr><td>Sel de sodium de l’acide valproïque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr></tbody></table>

expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques cd34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Unités de sang (UCB) cordon ombilical offrent une autre source de cellules souches hématopoïétiques humaines (CSH) pour les patients qui ont besoin de transplantation allogénique de moelle osseuse. Alors que l’UCB a plusieurs avantages uniques, le nombre limité de GPX au sein de chaque unité UCB limite leur utilisation en médecine régénératrice et greffe de csh chez l’adulte. Expansion efficace de csh humaine fonctionnelle peut être réalisée par ex vivo cultivant des CD34+ des cellules isolées d’UCB et traités avec un inhibiteur de la désacétylase, acide valproïque (VPA). Le protocole détaillé ici décrit les conditions de culture et de la méthodologie d’isoler rapidement CD34+ des cellules et l’étendre à un haut degré un pool de csh primitif. Le csh élargi est capables d’établir la prise de greffe à court et à long terme et peuvent donner lieu à tous les types de cellules hématopoïétiques différenciées. Cette méthode aussi détient potentielle d’application clinique dans la thérapie génique csh autologue et fournit une approche intéressante pour surmonter la perte de csh fonctionnelle associée à la modification des gènes.

L’ex vivo protocole décrit ici augmente le nombre de primitives GPX générés par CD34+ cellules isolées de l’UCB (Figure 1). Amorçage du CD34+ cellules pendant 16 h avec une cytokine cocktail, suivi du traitement par APV supplémentaires 7 jours, conduit à une grande expansion de HSC. Fait remarquable, le pool de cellules élargis est hautement enrichi pour csh, qui est phénotypiquement défini par CD34+CD90+ marqueurs....

Nous décrivons ici l’ex vivo expansion des cellules souches hématopoïétiques CD34+ cellules provenant du sang de cordon ombilical traitement avec une combinaison d’un cocktail de cytokine et l’APV. Cette méthode conduit à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif des deux cliniques ou les applications de laboratoire.

Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Ex vivo expansion de la cellule souche hématopoïétique de l’unité de sang de cordon ombilical tenir une grande promesse pour l’application HSC dans la médecine régénérative et la thérapie de transplantation. Ce protocole utilise un cocktail de cytokine combiné avec le traitement d’acide valproïque pour étendre rapidement un grand nombre de HSCs fonctionnels avec des caractéristiques qui ressemblent étroitement aux HSCs primitifs primaires. En raison des effets prompts du traitement d’acide valproïque, cette méthode a également le potentiel de surmonter la perte de HSCs liée à l’édition de gène.Cette méthode pourrait être bénéfique pour la génération d’un plus grand nombre de cellules génétiquement modifiées dans un délai qui est pertinent pour les protocoles de modification génétique actuellement utilisés. Le protocole d’expansion de l’acide valproïque ex vivo est relativement simple et fiable. La purification des cellules CD34 positives avec le dispositif de séparateur cellulaire est hautement reproductible et rapide, permettant la récupération rapide des cellules CD34-positives fortement purifiées.24 heures avant l’isolement des cellules cd-34 positives du sang de cordon ombilica

ex-vivo-expansion-hematopoietic-stem-cells-from-human-umbilical-cord

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Le but du présent protocole est d’isoler les primates non-humains CD34+ des cellules de moelle apprêtée, gène-modification de ces cellules avec des vecteurs lentiviraux et de préparer un produit infusion dans l’hôte autologue. La longueur totale de protocole est d’environ 48 h.

Préparation et Modification de gène de Primate non-humaine souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

On présente ici un protocole pour initier, maintenir et analyser des cultures de cellules souches hématopoïétiques de souris en utilisant une expansion ex vivo à base d’alcool polyvinylique, ainsi que des méthodes pour les manipuler génétiquement par transduction lentivirale et électroporation.

Ex Vivo Expansion et manipulation génétique de cellules souches hématopoïétiques de souris dans des cultures à base d’alcool polyvinylique

Ici, nous avons établi in vivo des ostéo-organoïdes déclenchés par des échafaudages de gélatine chargés de protéine 2 morphogénétique osseuse pour récolter des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques pour la reconstruction d’un système hématopoïétique et immunitaire endommagé. Dans l’ensemble, cette approche peut fournir une source cellulaire prometteuse pour les thérapies cellulaires.

Approche ostéo-organoïde in vivo pour la récolte de cellules souches/progénitrices hématopoïétiques thérapeutiques

La modélisation de l’érythropoïèse offre une occasion précieuse de comprendre l’importance biologique des acteurs de ce processus et d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques susceptibles d’atténuer les défauts de différenciation. Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour différencier efficacement les cellules souches hématopoïétiques et progénitrices CD34+ ex vivo.

Un pipeline complet pour évaluer l’efficacité de l’érythropoïèse humaine in vitro et ex vivo

Apprenez l'expansion ex vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34+ du sang de cordon ombilical humain à l'aide d'un cocktail de cytokines et d'acide valproïque. Cette méthode simple et fiable augmente significativement le nombre de cellules souches fonctionnelles pour la médecine régénérative et la thérapie cellulaire.

Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque (Vidéo) | JoVE Journal

Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain⁺ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Explorer plus de vidéos