Name: Génotypage de lanémone de mer pendant le développement précoce (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Apprenez le génotypage non létal de Nematostella vectensis pendant la gastrulation pour identifier les mutants sans sacrifier l'embryon. Cette méthode permet d'analyser les phénotypes post-embryonnaires en biologie du développement.

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Nous remercions les critiques anonymes pour les commentaires sur la version antérieure du manuscrit, qui a amélioré le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des fonds de l'Université de l'Arkansas.

1. Induction du frai, de la fécondation in vitro et de la dégelée
<ol><li>Maintenir Nematostella vectensis dans l'eau de mer avec une salinité de 12 parties par millier (ppt) dans l'obscurité à 16 oC, alimentant Artemia tous les jours.</li>
	<li>La veille de l'induction du frai, placez les animaux dans un incubateur à température et à lumière. Programmez l'incubateur de sorte que les animaux soient exposés à 8 h de lumière à 25 oC. Facultatif : Nourrissez un petit morceaud'huître (1 mm 3) d'huîtres à des animaux individuels avant de les placer dans l'incubateur pour améliorer le frai.</li>
	<li>Laisser les animaux dans l'incubateur pendant 1 h à 16 oC.</li>
	<li>Retirez les animaux de l'incubateur et laissez-les sur un banc avec de la lumière à température ambiante (RT) pour permettre le frai. Le frai se produit habituellement dans les 1,5 à 2 h suivants.</li>
	<li>Si les mâles et les femelles sont dans des contenants séparés, placez les paquets d'œufs du contenant femelle dans un contenant mâle contenant des spermatozoïdes à l'aide d'une pipette de transfert dont la pointe est coupée pour agrandir l'ouverture afin que les œufs ne soient pas endommagés par un stress mécanique pendant transférer. Laisser les œufs être fécondés en les laissant dans le récipient mâle pendant au moins 15 min.</li>
	<li>Dégelée les paquets d'œufs dans l'eau de mer contenant 3% de cystéine (pH 7.4) sur un plat Petri ou dans un tube de 15 ml. Agiter doucement sur un shaker pendant 12 min.</li>
	<li>Utilisez une pipette en plastique pour briser les touffes et continuer à agiter pendant un autre 2-3 min jusqu'à ce que complètement déjellied.</li>
	<li>Enlever la cystéine en remplaçant les médias par de l'eau de mer fraîche pendant au moins 5 x.</li>
	<li>Gardez les œufs fécondés sur un plat Petri en verre à 16 oC ou RT.</li>
</ol>2. Enlèvement chirurgical d'un tissu aboral d'un embryon de gastrula
<ol><li>Préparer un tampon d'extraction d'ADN composé de 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3 % Tween20, 0,3 % NP40 et 1 mg/mL de protéinase K. Utilisez 20 mL de tampon d'extraction par embryon. Bien mélanger en vortexant et aliquot le tampon dans les tubes PCR.</li>
	<li>Dissoudre 1% d'agarose dans l'eau de mer et verser dans un plat Petri pour couvrir le fond. Refroidir sur un banc pour faire un lit en gel. Verser l'eau de mer fraîche pour couvrir le lit de gel dans le plat Petri.</li>
	<li>Transférer 24 h d'embryons post-fertilisation (hpf) (stade précoce à mi-gastrula) dans le plat Petri contenant un lit de gel agarose.</li>
	<li>Insérez une aiguille de tungstène dans un porte-aiguille et stérilisez en trempant la pointe de l'aiguille dans de l'alcool (70 % ou plus) et en la mettant en flammes pour brûler l'alcool.</li>
	<li>Sous un microscope à disséquer (à 20x à 40x grossissement), utiliser l'aiguille de tungstène pour faire une dépression sur le lit agarose en enlevant un morceau d'agarose de surface de la taille d'un embryon à manipuler, et placez l'embryon sur la dépression avec son latéral côté vers le bas afin de restreindre le mouvement de l'embryon pour la microchirurgie.</li>
	<li>Utilisez l'aiguille de tungstène pour exciser chirurgicalement un morceau de tissu aboral situé en face de l'ouverture blastorale orale. Un tiers à un quart du tissu embryonnaire le long de l'axe oral-aboral est généralement suffisant.</li>
	<li>Utilisez une pipette P20 pour transférer le tissu aboral isolé (en lt;2 ml) dans un tube PCR contenant 20 ml de tampon d'extraction d'ADN.</li>
	<li>Transférer l'embryon post-chirurgical dans un puits contenant au moins 500 ml d'eau de mer fraîche dans une assiette de 24 ou 96 puits.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.4-2.8 pour le nombre d'embryons au besoin.</li>
	<li>Placez la plaque de puits contenant des embryons post-chirurgical dans un incubateur à 16 oC ou RT jusqu'à ce que le génotypage soit terminé.</li>
</ol>3. Extraction et génotypage génomique de l'ADN PCR
<ol><li>Faites brièvement tourner les tubes PCR contenant le tampon d'extraction d'ADN et les tissus embryonnaires isolés à l'aide d'une mini-centrifugeuse (p. ex. à 2 680 x g pour 10 s).</li>
	<li>Pour extraire l'ADN génomique d'embryons uniques, incubez les tubes PCR à 55 oC pendant 3 h. Vortex pendant 30 s toutes les 30 min afin d'assurer la rupture des amas cellulaires et d'améliorer la lyse cellulaire.</li>
	<li>Incuber les tubes PCR à 95 oC pendant 5 min pour inactiver la protéase K.</li>
	<li>Gardez les extraits d'ADNc à 4 oC ou sur la glace, et passez immédiatement à PCR. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici en plaçant des extraits d'aDNc dans un congélateur de -20 oC.</li>
	<li>Configurez une réaction PCR à l'aide de l'ADN g extrait comme modèle pour amplifier le locus génomique d'intérêt.<ol>
<li>Si différents allèles au lieu d'intérêt diffèrent en taille de sorte que la différence de taille peut être détectée par électrophoresis gel agarose, concevoir un seul ensemble d'amorces pour amplifier l'ensemble du locus.</li>
		<li>Alternativement, utilisez des amorces spécifiques à l'allèle qui génèrent des produits PCR uniquement en présence de l'allèle spécifique; par exemple, en concevant l'amorce qui se lie à une région contenant des mutations d'insertion/suppression.</li>
		<li>Utilisez un mélange de réaction PCR typique de 20 mL comme suit : 5 ml d'extraits d'adnas, 8 ml d'eau sans nucléane, 4 ml de tampon PCR, 0,2 mL de 10 mMd, 0,6 mL de DMSO, 1 ml d'apprêt avant de 10 mmm, 1 ml d'amorce inverse de 10 mM , et 0,2 ml de polymérase d'ADN (voir Tableau des matériaux). REMARQUE : Plusieurs amorces peuvent être utilisées dans une réaction PCR. Par exemple, une amorce avant universelle et deux amorces inversées spécifiques à l'allèle peuvent être combinées, tant que les deux amorces inversées sont conçues pour générer des produits PCR de tailles distinctes afin que la présence/absence des deux allèles puisse être sans ambiguïté par électrophoresis de gel (voir la section des résultats représentatifs).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécuter l'électrophorèse gel agarose pour déterminer la taille et la présence / absence des produits PCR. Ajuster l'état de l'électrophorèse de gel d'agarose (p. ex., pourcentage de gel d'agarose, V/cm, et durée) selon la taille prévue des produits DE PCR.</li>
	<li>Utilisez les résultats de PCR concernant la taille et la présence/absence des produits PCR pour attribuer un génotype à chaque embryon post-chirurgical. Par exemple, si différents allèles sont censés générer des produits PCR de différentes tailles, utilisez les informations de taille pour attribuer le génotype pour chaque embryon. Si des amorces spécifiques à l'allèle sont utilisées, les données sur la présence ou l'absence de produits PCR devraient être utilisées pour attribuer un génotype à chaque embryon.</li>
	<li>Trier les embryons selon le génotype.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

L'auteur n'a rien à révéler.

Décrit ici un protocole basé sur PCR pour génotyper un seul embryon d'anémone de mer sans sacrifier l'animal. Après le frai et la dégelée, les œufs fécondés sont autorisés à se développer en gastrulae. La région aboral de chaque embryon de gastrula est enlevée chirurgicalement, et le tissu aboral isolé est employé pour l'extraction génomique suivante d'ADN, tandis que les embryons post-chirurgicaux restants guérissent et continuent le développement. Les extraits de gDNA sont ensuite utilisés pour un test PCR pour détermi...

Les Cnidariens représentent un groupe diversifié d'animaux qui comprennent les méduses, les coraux et les anémones de mer. Ce sont des diploblastes, composés d'ectoderm et d'endoderm qui sont séparés par une matrice extracellulaire (mesoglea). Cnidaria est un groupe sœur pour spécifier Bilateria, à laquelle les modèles animaux traditionnels tels que Drosophila et Mus appartiennent1. En outre, on pense que la divergence Cnidaria-Bilateria s'est produite dans la période précambrienne2. En tant que tel, les études comparatives des cnidaires et des bilateriens sont essentielles pour obtenir des perspicacités dans la biologie de leur ancêtre commun le plus récent. Récemment, la génomique comparative a révélé que les cnidaires et les bilateriens partagent de nombreux gènes de boîte à outils de développement tels que l'encoche et la bHLH, ce qui implique que leur ancêtre commun avait déjà ces gènes3. Cependant, le rôle de ces gènes de boîte à outils développementales dans le dernier ancêtre commun de Cnidaria et De Bilateria est comparativement moins bien compris. Pour résoudre ce problème, il est essentiel d'étudier comment ces gènes profondément conservés fonctionnent chez les cnidaires.
L'un des nouveaux modèles génétiques cnidaires est l'anthozoan Nematostella vectensis. Son génome a été séquencé3, et une variété d'outils génétiques, y compris le knockdown de gène morpholino-négocié, la transgenèse meganuclease-négociée, et LES knockins et knockouts de gène CRISPR-Cas9-négociés, sont maintenant disponibles pour l'usage dans cet animal. En outre, le développement de Nematostella est relativement bien compris. Pendant l'embryogenèse, la gastrulation se produit par invagination4, et l'embryon se développe en une larve de planula de nage libre. La planule se transforme ensuite en polype sessile avec une bouche et des tentacules circonraux. Le polype grandit alors et atteint la maturité sexuelle.
CRISPR-Cas9-mediated mutagenesis ciblé est maintenant couramment utilisé pour étudier la fonction génique dans Nematostella vectensis5,6,7,8,9. Pour générer des mutants knock-out dans Nematostella, un cocktail contenant locus-spécifique RNA mono-guide et la protéine Cas9 endodocléuale est d'abord injecté dans les œufs non fécondés ou fécondés pour produire des animaux fondateurs F0 qui montrent généralement mosaïsme. Les animaux F0 sont ensuite élevés à maturité sexuelle et croisés les uns avec les autres pour produire une population de F1, dont un sous-ensemble peut être ko en état de mutation6. Alternativement, les animaux F0 sexuellement matures peuvent être croisés avec des animaux de type sauvage pour générer des animaux hétérozygotes F1, et les hétérozygotes F1 qui portent un allèle knock-out dans le lieu d'intérêt peuvent alors être croisés les uns avec les autres pour produire la progéniture F2, un quart dont on s'attend à ce qu'il s'agit de mutants knock-out5. Les deux approches nécessitent une méthode pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène. Les tentacules de polype peuvent être employéspour extraire l'ADN génomique pour le génotypage 6,7. Cependant, dans les cas où la fonction développementale du gène d'intérêt est étudiée et où les embryons mutants n'atteignent pas le stade du polype (c.-à-d. en raison de la létalité larvaire associée à la mutation), les mutants knock-out doivent être identifiés tôt dans l'ontogéne. Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotyper des animaux individuels au stade de gastrula sans sacrifier l'animal, qui permet d'identifier des mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il nécessite un minimum de 4-5 h.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier Incubateur réfrigéré</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>Utilisé pour l’induction du frai</td></tr><tr><td>Sel de mer de mer</td><td>instantané Océan instantané</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Kystes de crevettes de saumure</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de L-cystéine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital standard, modèle 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>QUALITÉ BIOLOGIQUE</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Substitut</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K solution (20 mg/mL), grade ARN</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Micro Porte-aiguille de dissection</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille de dissection en tungstène</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Thermocyclers</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion ADN polymérase haute fidélité</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide universal forward primer</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>Amorce inversée spécifique à glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>Amorce inversée spécifique à glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Décrit ici est un protocole PCR-basé pour génotype l'embryon de stade de gastrula du vectensis cnidaire anthozoan nematostella sans sacrifier la vie de l'animal. Après la fécondation in vitro et la dégelée, les zygotes sont autorisés à se développer pendant 24 h à température ambiante pour atteindre le stade précoce à moyen-gastrula. Les embryons de gastrula sont ensuite placés sur un lit de gel d'agarose dans un plat Petri contenant de l'eau de mer. Sous le microscope disséquant, une aiguille de tungstène est utilisée pour séparer chirurgicalement un fragment de tissu aboral de chaque embryon. Les embryons post-chirurgical sont ensuite autorisés à guérir et à poursuivre leur développement. L'ADN génomique est extrait du fragment de tissu isolé et utilisé comme modèle pour le PCR spécifique au locus. Le génotype peut être déterminé en fonction de la taille des produits PCR ou de la présence ou de l'absence de produits PCR spécifiques à l'allèle. Les embryons post-chirurgical sont ensuite triés en fonction du génotype. La durée de l'ensemble du processus de génotypage dépend du nombre d'embryons à dépister, mais il faut au minimum 4 à 5 h. Cette méthode peut être utilisée pour identifier les mutants knock-out d'une population génétiquement hétérogène d'embryons et permet d'analyser les phénotypes au cours du développement.

Le génome de Nematostella a un locus unique qui code une protéine précurseur pour le gLWamide neuropeptide. Trois alleles mutants knock-out à ce locus (glw-a, glw-b, et glw-c) ont été précédemment signalés5. Quatre mâles hétérozygotes portant un allèle de type sauvage (en) et allèle à élimination bée-c-cau locus gLWamide (génotype : ' ' ''' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ...

Le but de ce protocole est de génotype de l'anémone de mer Nematostella vectensis pendant la gastrulation sans sacrifier l'embryon.

Génotypage de l'anémone de mer pendant le développement précoce

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Ce protocole permet à un chercheur d’identifier les anémones de mer mutantes au cours de l’embryogenèse précoce afin que le phénotype développemental post-embryonnaire puisse être analysé. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour génotyper les anémones de mer individuelles au début de l’ontogenèse sans sacrifier la vie de l’animal. Miguel Silva, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette procédure.La veille de l’induction du frai, placez l’anémone nematostella vectensis dans un incubateur à température et à commande lumineuse, programmant l’incubateur de sorte que les animaux soient exposés à huit heures de lumière à 25 degrés Celsius. Le lendemain, retirez les animaux de l’incubateur et laissez-les sur un banc à température ambiante avec la lumière allumée pour permettre le frai, qui se produira dans les une heure et demie à deux heures suivantes. Utilisez une pipette de transfert dont la pointe est coupée pour agrandir l’ouverture pour placer les paquets d’ovules du récipient femelle dans un récipient mâle contenant du sperme et les laisser dans le récipient masculin pendant au moins 15 minutes pour permettre la fécondation.Après la fécondation, pour dejelly les paquets d’oeufs, placez-les dans l’eau de mer contenant 3% de cystéine sur une boîte en verre de Petri et agitez doucement sur un shaker pendant 12 minutes. Ensuite, briser les touffes avec une pipette en plastique et continuer à agiter pendant encore deux à trois minutes jusqu’à ce que complètement dejellied. Gardez les œufs fécondés sur le même plat à 16 degrés Celsius ou à température ambiante.Le lendemain, préparez un tampon d’extraction d’ADN tel que décrit dans le manuscrit, mélangez bien par vortex, et aliquot dans les tubes PCR en ajoutant 20 microlitres à chaque tube. Dissoudre 1% d’agarose dans l’eau de mer, la verser dans une boîte de Pétri pour couvrir le fond, et refroidir sur un dessus de banc pour faire un lit de gel. Couvrir le lit de gel d’eau de mer fraîche.Transférer des embryons post-fécondation 24 heures sur 24 à l’aide d’une pipette dans la boîte de Pétri contenant du gel d’agarose. Insérez une aiguille de tungstène dans un support de besoin et stérilisez en plongeant sa pointe dans l’alcool et en la plaçant en flammes pour brûler l’alcool. Sous un microscope disséquant, faire une dépression sur l’agarose en utilisant l’aiguille de tungstène pour enlever un morceau de surface agarose sur la taille d’un embryon à manipuler.Ensuite, à l’aide de l’aiguille de tungstène, placez l’embryon dans la dépression avec son côté latéral orienté vers le bas afin de limiter le mouvement de l’embryon pour la microchirurgie. Afin d’effectuer une chirurgie réussie, il est essentiel de restreindre le mouvement de l’embryon. Avec l’aiguille de tungstène, enlever chirurgicalement un morceau de tissu aboral le long de l’axe aboral oral, situé en face de l’ouverture blastoporale orale.À l’aide d’une pipette P20, transférer le tissu aboral isolé dans un tube PCR contenant 20 microlitres de tampon d’extraction d’ADN. Transférer l’embryon post-chirurgie dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant au moins 500 microlitres d’eau de mer fraîche. Et placez la plaque contenant des embryons post-chirurgie dans un incubateur à 16 degrés Celsius jusqu’à ce que le génotypage soit terminé.Pour extraire l’ADN génomique d’embryons simples, faites d’abord brièvement tourner les tubes PCR contenant le tampon d’extraction de l’ADN et les tissus embryonnaires isolés à l’aide d’une mini centrifugeuse. Puis incuber les tubes à 55 degrés Celsius pendant trois heures tout en tourbillonnant pendant 30 secondes toutes les 30 minutes pour assurer la rupture des touffes cellulaires et améliorer la lyse cellulaire. Après avoir inactivé proteinase K à 95 degrés Celsius pendant quatre minutes, mettre en place une réaction PCR en utilisant l’ADN génomique extrait comme un modèle pour amplifier le lieu d’intérêt.Concevoir les amorces désirées telles que décrites dans le manuscrit. Configurer une réaction PCR de 20 microlitres. Après avoir terminé pcr, exécuter électrophoresis gel agarose pour déterminer la taille et la présence ou l’absence de produits PCR, en s’assurant d’ajuster l’état de gel agarose électrophoresis en fonction de la taille prévue des produits PCR.Utilisez les résultats pcr concernant la taille et la présence ou l’absence ou les produits PCR pour attribuer un génotype à chaque embryon post-chirurgical, puis trier les embryons en fonction de leur génotype. Le génome de la nématostella a un seul locus qui code une protéine précurseur pour le neuropeptide, GLWamide. Trois allèles mutants knockout au locus ont été précédemment rapportés.Les résultats de PCR des embryons aléatoirement échantillonnés parmi la progéniture d’un croisement de F1 entre une femelle hétérozygote portant un allèle de KO d’A et les mâles hétérozygotes portant un allèle de KO de C montrent différents génotypes. Les embryons un et deux montrent une seule bande PCR correspondant à la taille prévue d’un allèle knockout. Embryons trois et six montrent deux bandes PCR avec les tailles prévues pour les allèles KO A et C.Embryos quatre, sept et huit montrent une seule bande PCR correspondant à la taille prévue de C knockout allèle.L’embryon 5 ne montre aucune bandes, suggérant l’absence de liaison d’amorce. Pour écarter la possibilité d’une défaillance de l’extraction de l’ADN génomique, un autre PCR a été exécuté à l’aide d’une amorce inverse qui peut se lier à la séquence de type sauvage. Lorsqu’un produit PCR d’une taille prévue a été détecté, l’extraction de l’ADN génomique a été couronnée de succès.Alors qu’aucun produit n’a suggéré une défaillance dans l’extraction. Bien que ce protocole soit conçu pour les embryons d’anémone marine, il sera certainement possible d’appliquer cette méthode à d’autres cnidaires, tels que les coraux et les méduses, où l’information génomique et les embryons sont accessibles. Après cette procédure, les mutants identifiés sont utilisés pour évaluer le phénotype développemental.Par exemple, des techniques histologiques telles que l’immunostaining peuvent être employées pour évaluer des défauts dans la morphologie, alors que l’hybridation in situ, le RT-PCR quantitatif en temps réel, et le RNA-seq peuvent être utilisés pour évaluer des défauts dans l’expression de gène. En outre, l’imagerie vivante peut être utilisée pour évaluer les défauts de comportement pendant le développement post-embryonnaire, comme chez les larves ou dans les polypes précoces.

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Developmental Biology

Biologie du développement

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