Name: Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Découvrez la culture d'organoides biliaires extra-hépatiques de souris pour étudier la biologie des cholangiocytes. Cette méthode reproductible permet d'analyser la régénération tissulaire et les interactions cellulaires.

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Ce travail a été soutenu par l’Association américaine pour l’étude du foie, maladies Pinnacle prix (N.R.) et le National Institutes of Health, National Institute of Diabetes et Digestive and Kidney Diseases (prix DK34933 P30 à N.R., P01 DK062041 à J.L.M.). Nous remercions le Dr Ramon Ocadiz-Ruiz (Université du Michigan) pour son aide au développement de cette méthodologie.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.
1. préparation du matériel et matériaux pour l’Isolation EHBD souris
<ol><li>Préparer les semis moyen et tampon de lavage (Table des matières) dans 50 mL tubes coniques et garder à 4 ° C ou sur la glace jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Mettre en place une table d’opération chirurgicale (Figure 1 b). Préparer les instruments chirurgicaux stérilisés (Figure 1).</li>
	<li>Posez une plaque 24 puits stérile dans un incubateur à 37 ° C vitroplants de préchauffage il.</li>
	<li>Placer une aliquote de matrice de sous-sol sur la glace. Matrice de sous-sol utilisation uniquement lorsqu’il est complètement liquéfié.</li>
</ol>2. EHBD isolement et biliaire Organoïde Culture
<ol><li>
Isolement et préparation d’une suspension monocellulaire de souris EHBD
	<ol>
<li>Euthanasier une souris adulte (plue de 2 mois) selon les directives institutionnelles. Placez votre souris en position couchée. Ouvrir la cavité abdominale à l’aide d’une approche de la ligne médiane et rétracter le foie au repos sur le diaphragme.</li>
		<li>Identifier le canal cholédoque situé immédiatement au-dessous du hile du foie en tirant doucement sur le duodénum proximal avec une pince hémostatique. Séparer les EHBD les tissus environnants à l’aide d’une lame de bistouri. Avec une pince en tenant l’extrémité proximale de la voie biliaire principale, il disséquer distalement juste au-dessus de sa jonction avec le duodénum, puis disséquer l’extrémité proximale de la gaine du foie (Figure 1). Placer immédiatement isolé EHBD (Figure 1E) dans cold tampon de lavage.</li>
		<li>Enlever le EHBD de la mémoire tampon de lavage et émincer en sections de 0,5 mm à l’aide d’une lame de bistouri stérile. Placer le tissu sur une plaque de verre sur la glace lors de la procédure (Figure 1 b).</li>
		<li>Placez les parties EHBD dans un tube contenant 500 µL de tampon de la dissociation. Incuber pendant 20 min à 37 ° C. Neutraliser le tampon de dissociation en ajoutant 500 µL de milieu de culture cellulaire glacée.</li>
		<li>Triturer la suspension cellulaire et descendre la progression à travers les aiguilles 18 G et 20 G, 20 fois chacun. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 70 µm et recueillir le cheminement dans un tube de 50 mL. Remarque : Pré-conditionner la crépine avec 500 µL de stérile saline tamponnée au phosphate (PBS) avant le filtrage pour faciliter le passage de la suspension cellulaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Création d’EHBD organoïdes
	<ol>
<li>Centrifuger le cheminement de l’étape 2.1.5 à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C.</li>
		<li>Retirer délicatement le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de PBS stérile glacée. Transvaser la remise en suspension dans un nouveau tube de 1,5 mL. Répétez l’étape 2.2.1.</li>
		<li>Après centrifugation, retirez soigneusement le surnageant de cellules lavées recueillies dans le bas du tube. Resuspendre le culot de cellules dans 120 µL de matrice liquéfié sous-sol glacée de pipetage et descendre à l’aide de conseils P200. Remarque : Resuspension culot cellulaire dans la matrice de sous-sol doit être exécuté sur bain de glace.</li>
		<li>Plaque de 40 µL de la remise en suspension des cellules dans la matrice de sous-sol dans le centre d’un puits dans une plaque de 24 puits préchauffé. Remarque : Éviter l’aspiration d’air tout en manipulant la matrice du sous-sol pour éviter la formation de bulles.</li>
		<li>Retourner la plaque avec les cellules resuspendues dans la matrice du sous-sol à l’incubateur de vitroplants de 37 ° C pendant 15 min ou jusqu'à ce que la matrice de sous-sol est solidifiée. Ajouter 600 µL de milieu semi chauffé à 37 ° C dans chaque cupule (Table des matières). Remettez la plaque dans l’incubateur de vitroplants de 37 ° C.</li>
		<li>Remplacer le milieu d’ensemencement avec 600 µL de milieu de culture fraîche organoïde en 3 jours et ensuite tous les 3 jours. Surveiller la croissance organoïde avec un microscope inversé. Utilisation organoïdes pour une application en aval ou l’intermédiaire tous les 7 à 9 jours avant l’accumulation de la chute de débris et organoïde intraluminal sont observés (Figure 2 a).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD Organoïde Passage et stockage
<ol><li>
Passage de EHBD organoïdes 1:3 à 1:4 tous les 7 à 9 jours
	<ol>
<li>Retirez le support du puits et ajouter 400 µL de PBS glacée. Resuspendre l’organoïdes de pipetage doucement le mélange de haut en bas 10 fois dans le puits. Transférer le mélange dans un tube de 1,5 mL.</li>
		<li>Passage le mélange à travers une aiguille 25 G 4 fois à se dissocier de l’organoids. Centrifuger le mélange à 400 x g pendant 4 min à 4 ° C.</li>
		<li>Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans la matrice de sous-sol (1:3 à 1:4) pour cultiver davantage (étape 2.2.4.) ou laver les cellules avec du PBS froid glace pour un traitement ultérieur. Remarque : En règle générale, les cellules de 250-300 sont plaqués dans la plaque 24 puits pour applications en aval. Efficacité de placage peut être évaluée par microscopie en champ clair à l’aide d’un microscope inversé du jour 3-5 après passage en comptant le nombre d’organoïdes et en calculant leurs pour cent du nombre de cellules initiales. ARNm peut être isolés des EHBDOs lavées dans du PBS en utilisant le protocole standard à l’aide de guanidinium extraction de thiocyanate-phénol-chloroforme.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Entreposage à long terme des EHBD organoïdes
	<ol>
<li>Retirez le support du puits et laver l’organoïdes avec température ambiante PBS. Supprimer les PBS du puits sans déranger la goutte de matrice de sous-sol.</li>
		<li>Ajouter 500 µL de cellule glacée congélation moyen dans le puits. Resuspendre l’organoïdes dans la matrice de sous-sol liquéfié et cellule de congélation moyen doucement et transférer le mélange dans deux flacons cryogéniques.</li>
		<li>Conserver les flacons à-80 ° C pendant 48 h. transfert les flacons dans un réservoir d’azote pour le stockage à long terme dans une phase de vapeur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Organoïde Pprocessing pour l’enrobage de paraffine
<ol><li>Resuspendre les EHBDOs dans 500 µL de PBS glacée (4 ° C) en pipettant également, haut et bas de 5 à 10 fois. Recueillir des EHBDO remises en suspension dans la matrice de sous-sol liquéfié dans un tube de 1,5 mL. Remarque : Pour éviter de casser organoïdes, couper le fond de 2 à 3 mm d’une pointe de P1000 et éliminer le surnageant avec beaucoup d’attention.</li>
	<li>Centrifugeuse EHBD organoïdes à 350 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger le culot organoïde.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de paraformaldéhyde glacée de 4 % (PFA) pour l’organoïdes et incuber l’organoïdes chez 4 % PFA pour la nuit à 4° C. Enlever les 4 % PFA de l’organoïdes en utilisant un embout P1000 après incubation pendant la nuit.</li>
	<li>Ajouter 1000 µL de PBS de la température ambiante dans le tube avec l’organoïdes et incuber pendant 5 min à température ambiante (RT). Centrifuger le tube avec organoïdes dans du PBS à 350 x g pendant 5 min. répéter ce processus deux fois plus.</li>
	<li>Retirez les PBS et ajouter 1 mL d’éthanol à 30 % dans l’organoïdes. Incuber 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 350 x g pendant 5 min à RT. enlever 30 % éthanol. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 % et incuber pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger à 350 x g pendant 5 min. retirer éthanol à 70 %. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % et incuber pendant 5 min à température ambiante. Remarque : Organoïdes peuvent être conservés dans de l’éthanol 100 % à la température ambiante jusqu'à 48 h avant traitement ultérieur.</li>
	<li>Chauffer l’échantillon gel de traitement dans un four à micro-ondes pendant 20 s ou jusqu'à ce que liquéfié. Ajouter 50 µL de gel dans le tube avec organoïdes de traitement des échantillons. Placer le tube sur la glace jusqu'à ce que le traitement gel des échantillons sont solidifié.</li>
	<li>Retirez la goutte de gel avec organoïdes du tube de traitement des échantillons et entre les coussinets éponge bleue dans une cassette pour un traitement ultérieur dans le processeur de tissu. Utilisez 15 min pour chaque étape de l’embedder paraffine pendant la poursuite de la procédure...</li>
	<li>Section organoïdes de paraffine dans le traitement des échantillons de gel à 4 µm. Procédez avec immunohistochemical souillant comme précédemment décrit16.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
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<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas des intérêts concurrents.

Cet ouvrage décrit la génération d’un modèle 3-dimensional organotypique de souris EHBD biliaires. Des étapes importantes dans la production de la culture EHBDO incluent la dissection méticuleuse de EHBD pour éviter la contamination de cellules de pancréas, maintien des conditions stériles pour prévenir la contamination bactérienne et fongique et manipulation prudente après centrifugation afin d’éviter la perte du matériel cellulaire. Il faut une étroite adhésion aux conditions de température décrites. Il y a certaines l...

Cholangiopathies sont incurables chroniques progressive des troubles qui affectent les cellules biliaires situés intra - et les canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs)1. Certains cholangiopathies, tels que la cholangite sclérosante primitive, cholangiocarcinome, atrésie des voies biliaires et kystes cholédocien, affectent principalement EHBDs. Mise au point de thérapies pour les cholangiopathies est limitée par la disponibilité limitée des modèles précliniques. En outre, des études antérieures concentrent cholangiopathies regroupés : foie, intra- et EHBDs. Cependant, intra - et EHBDs ont une origine embryonnaire distinct et devraient donc être considérés comme des pathologies moléculaires distinctes. Voies biliaires intrahépatiques se développent à partir des plaques canalaires intrahépatiques et la partie crâniale du diverticule hépatique, EHBDs ensemble se développent à partir de la partie caudale du diverticule hépatique2. Ils comptent également sur les compartiments cellulaires différentes souches pour l’homéostasie adulte, y compris les canaux de Hering dans les voies biliaires intrahépatiques et glandes péribiliaires EHBDs2,3. Utilisation de modèles animaux pour des études précliniques est limitée par la dépense et devrait être réduite au minimum pour des raisons éthiques. Réductionniste, reproductible, temps et coût-efficace modèles in vitro sont donc hautement souhaitables.
La plupart des études préalables de cholangiopathies utilisé des souris normales ou modèles de cancer de rat ou lignées de cellules de cholangiocarcinome humain dérivées intra - et EHBDs4,5,6,7. Cependant, ceux-ci sont des modèles de cellules transformées et récapituler pas normal cholangiocyte biologie à l’homéostasie, ou dans un état sain. Les progrès récents dans l’élaboration de modèles de culture organotypique a permis le développement de structures 3D de types de tissus différents, y compris les tissus hépato-biliaire, bien que les souris normale non EHBDs8,9, 10. Ces structures en « orgue » visant à imitant le tissu principal et sont cultivés dans une niche artificielle soutenant l’auto-renouvellement des cellules de certains organes souches/progénitrices11.
« Organoïde » est un large mandat qui est plus communément décrit les modèles de tissus 3 dimensions dérivées de cellules souches. Organoïdes peut être généré de reprogrammé pluripotentes cellules souches représentée par des cellules souches embryonnaires et induit des cellules souches pluripotentes. Ils peuvent également être générés d’organe-spécifiques des cellules souches adultes12. Certains modèles d’organoïde cholangiocyte ont été proposées dans les études précédentes. Ainsi, organoïdes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines ont été déclarés7,9,13 et fournissent un outil efficace de temps précieux, qui permet la production simultanée de différents types cellulaires. Cependant, ces organoïdes de dérivés de cellules souches pluripotentes ne reflètent pas totalement la structure et les fonctionnalités de primaire adulte EHBD biliaires.
Organoïdes dérivées de cellules souches adultes de l' humain9 et féline10 du foie ont également été proposées. Féline de modèles ne sont pas largement disponibles et ont limité la panoplie d’outil à des fins d’étude. En outre, ces organoïdes de dérivés de cellules souches adultes provenant du foie ne pas poser biliaires extrahépatiques mais biliaires intrahépatiques plutôt.
Génération d’organoïde EHBD humaine normale EHBDs14 et la souris EHBD cholangiocarcinome15a été signalée. Cependant, l’accès pour les tissus humains de EHBD est extrêmement limité et organoïdes dérivés d’un modèle murin de cholangiocarcinome15 ne représentent pas de biologie cholangiocyte sain à l’homéostasie et proviennent de cellules génétiquement modifiées.
Pour pallier les lacunes des pluripotentes dérivées de cellules souches et de foie cholangiocyte organoïde modèles et l’accès limité aux tissus humains nécessaires dans les modèles précliniques, nous avons développé un modèle murin d’organoïde EHBD (Figure 1 a). Ce manuscrit décrit le développement d’une technique pour souris organoïdes EHBD dérivées de tissus adultes. Ces organoïdes EHBD nommés EHBDOs sera un outil important in vitro pour l’étude des mécanismes sous-jacents à l’EHBDs cholangiocyte l’homéostasie et maladie processus, tels que cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td>Milieu de culture cellulaire L-WRN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>1 %</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Tampon de lavage</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amphotéricine B&nbsp ;</td><td>6,25 et micro ; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td><Milieu de culture organoïde fort></fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Milieu conditionné&nbsp ;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-Glutamine</td><td>10 & micro ; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>Acide sulfonique N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &micro ; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 & micro ; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td><fort>Milieu de culture organoïde</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture organoïde&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Facteur de croissance des fibroblastes-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Anticorps primaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 (CK19), Rabbit</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Région déterminant le sexe Anticorps Y-Box 9 (SOX9), Lapin</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Anticorps anti-homeobox 1 (PDX1) du duodénal pancréatique, Lapin</td><td>1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr><tr><td>Anticorps E-cadhérine, Chèvre</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Anticorps acétylé &alpha ;-tubuline, souris</td><td>1:500</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td></tr><tr><td>Anticorps</td><td></td><td></td> secondaires<td></td></tr><tr><td>488 étiqueté anti-lapin, Donkey IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 étiqueté anti-chèvre, Donkey IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 étiqueté anti-souris, Chèvre IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt reporter assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TopFlash HEK293 cell line</td><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td></tr><tr>Kit <td></td><td>de dosage de la luciférase</td><td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0,4 % Trypan Blue Solution</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Matériaux et réactifs supplémentaires </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice de base, sans phénol Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Tampon de dissociation, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Milieu de congélation pour culture cellulaire, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Passoire cellulaire (70 & micro ; m, stérilisé)</td><td></td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td></tr><tr><td>Extraction de l’ARN du thiocyanate-phénol de guanidinium, TRIzol</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td></tr><tr><td>Gel de traitement des échantillons, HistoGel</td><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HG-4000-012</td></tr><tr><td>Kit universel de détection de mycoplasmes</td><td>ATCC</td><td>30-1012K</td>Tube de microcentrifugation de 1,5 mL Fisherbrand <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>05-408-129</td></tr><tr>Plaque <td></td> à<td>24 puits</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>Tube à centrifuger conique de 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td>Microscope à fluorescence Nikon Eclipse E800 Microscope inversé Biotium 30003-2 Plateau de nécropsie Fisherbrand 13-814-61 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

génération d’organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, d’affecter des canaux biliaires extrahépatiques (EHBDs), incluent l’atrésie des voies biliaires, la cholangite sclérosante primitive et cholangiocarcinome. Ils n’ont aucune option thérapeutique efficace. Outils pour étudier les EHBD sont très limitées. Notre but était d’élaborer un modèle de certains organes, polyvalent, adulte cholangiocyte de cellules souches dérivées, précliniques qui peut être facilement généré de type sauvage et des souris génétiquement modifiées. Ainsi, nous présentons la nouvelle technique de mettre au point un système de culture organoïde (EHBDO) EHBD de EHBDs de souris adulte. Le modèle est rentable, capable de doser facilement, et a de multiples applications en aval. Plus précisément, nous décrivons la méthodologie d’isolement EHBD souris et dissociation cellulaire unique, initiation de culture organoïde, propagation et maintenance à long terme et stockage. Ce manuscrit a aussi décrit EHBDO traitement pour immunohistochimie, microscopie fluorescente et quantification d’abondance ARNm en chaîne par polymérase quantitative en temps réel de la transcription inverse (qRT-PCR). Ce protocole a des avantages significatifs en plus de produire EHBD spécifique organoïdes. L’utilisation d’un milieu conditionné de cellules L-AVT réduit significativement le coût de ce modèle. L’utilisation de souris EHBDs fournit presque illimitée de tissus pour la production de la culture, à la différence des tissus humains. EHBDOs souris générés contiennent une population pure de cellules épithéliales avec des marqueurs de progéniteurs endodermiques et différencient de cellules biliaires. Organoïdes cultivées maintiennent morphologie homogène à travers les passages multiples et peuvent être récupérés après une longue période de stockage dans l’azote liquide. Le modèle permet l’étude de la prolifération des cellules progénitrices biliaire, peut être manipulé sur le plan pharmacologique et peut être généré à partir des souris génétiquement modifiées. Les études à venir sont nécessaires pour optimiser les conditions de culture afin d’accroître l’efficacité de l’électrodéposition, d’évaluer la maturité fonctionnelle cellulaire et la différenciation cellulaire directe. Développement de modèles de culture mixte et une matrice extracellulaire plus biologiquement neutre sont également souhaitables.

Notre protocole décrit la génération de souris EHBD organoïdes qui sont spécifiques des tissus et cellules souches dérivées d’adulte. Après que les organoïdes sont cultivées, une formation des structures kystiques peut être observée dès 1 jour après l’isolement du EHBD. Contamination par les fibroblastes n’est pas typiquement observée pendant la génération de la culture. EHBDO efficacité de placage est environ 2 % lorsqu’il est isolé depuis néonatale ou adulte (plus de 2 mois) souris (<st...

Ce protocole décrit la production d’une souris biliaires extrahépatiques organoïde 3-dimensions. Ces organoïdes biliaires peuvent être maintenues en culture pour étudier la biologie cholangiocyte. Organoïdes biliaires expriment des marqueurs des cellules biliaires et géniteur et sont composées de cellules épithéliales polarisées.

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Ce système organoïde extrahépatique de choe murine peut adresser l’accès limité aux modèles précliniques de cholangiopathies et aux limitations des modèles organoïdes pluripotents de cellules souches et de cholangiocytes hépatiques. Notre modèle est spécifique aux tissus adultes, réductionniste, reproductible, et le temps et rentable. Il sera ux pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux tissus humains.Notre technique permet la culture d’un nombre presque illimité de cholangiocytes extrahépatiques des canaux biliaires pour étudier la régénération des tissus et les interactions cellule à cellule. Junya Shiota, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour l’isolement intrahépatique des canaux biliaires, placez la souris adulte dans une position supine et ouvrez la cavité abdominale le long de la ligne médiane.Rétractez le foie pour se reposer sur le diaphragme et utilisez un hémstat pour tirer doucement le dudénodum proximal pour révéler le canal biliaire commun immédiatement au-dessous de l’hilum de foie. Utilisez un scalpel pour séparer le canal biliaire extrahépatique des tissus environnants. Tenant l’extrémité proximale du canal biliaire commun avec des forceps, disséquez le conduit distally juste au-dessus de sa jonction avec le duodène avant de disséquer l’extrémité proximale du conduit du foie.Placez immédiatement le canal biliaire extrahépatique isolé dans une plaque de verre contenant un tampon de lavage à froid sur la glace, puis nettoyez le canal biliaire du tissu environnant et hachez-le en sections de 0,5 millimètre. Lorsque tout le tissu a été haché, transférer les sections dans un tube contenant 500 microlitres de tampon de dissociation pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la dissociation, neutraliser le tampon avec 500 microlitres de culture cellulaire glacée moyenne et triturer la suspension tissulaire 20 fois à travers une aiguille de calibre 18, puis 20 fois à travers une aiguille de calibre 20.Filtrez ensuite la suspension cellulaire résultante à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Pour établir une culture organoïde biliaire, recueillir les cellules par centrifugation et enlever soigneusement le supernatant. Resuspendez la pastille en un millilitre de PBS stérile et glacé et transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre pour une deuxième centrifugation.Resuspendez la pastille lavée dans 120 microlitres de matrice de sous-sol liquéfiée et glacée et plaquez 40 microlitres de cellules au centre de chacun des trois puits d’une plaque de 37 degrés Celsius réchauffée et 24 puits, puis placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Lorsque la matrice du sous-sol s’est solidifiée, ajouter 600 microlitres de 37 degrés Celsius de milieu d’ensemencement à chaque puits avant de retourner la plaque à l’incubateur. Après trois jours et tous les trois jours par la suite, remplacer le milieu d’ensemencement par 600 microlitres de milieu de culture organoïde frais, en surveillant la croissance organoïde régulièrement avec un microscope inversé.Pour passer les cultures extrahépatiques des canaux biliaires, pipette les organoïdes dans chaque puits avec 400 microlitres de PBS glacé 10 fois par puits avant de transférer le contenu du puits à des tubes individuels de 1,5 millilitre. Passer chaque mélange à travers une aiguille de calibre 25 quatre fois pour dissocier les organoïdes et recueillir les cellules par centrifugation. Puis résuspendez les cellules dans la matrice du sous-sol au rapport approprié pour le re-placage.Pour le stockage extrahépatique à long terme des organoïdes des canaux biliaires, lavez chaque puits d’organoïdes avec du PBS à température ambiante sans déranger les gouttes de matrice du sous-sol et ajoutez 500 microlitres de milieu de congélation glacé à chaque puits. Resuspendez doucement les organoïdes et transférez le mélange dans des flacons cryogéniques individuels, puis placez les flacons à moins 80 degrés Celsius pendant 48 heures avant de transférer les organoïdes dans un réservoir d’azote pour un stockage à long terme dans une phase de vapeur. Pour préparer les organoïdes à l’intégration de la paraffine, remplacez le milieu par 500 microlitres de quatre degrés Celsius PBS et transférez la suspension de chaque puits en tubes individuels de 1,5 millilitre contenant la matrice de sous-sol liquéfiée.Recueillir les organoïdes par centrifugation et utiliser une pointe de pipette P1000 modifiée pour enlever soigneusement les supernatants sans déranger les granulés. Ajoutez ensuite un millilitre de glace, 4% de paraformaldéhyde aux organoïdes pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez le fixatif par un millilitre de PBS à température ambiante pour une incubation de cinq minutes à température ambiante et lavez les organoïdes par centrifugation trois fois.Après le dernier lavage, resuspendez les organoïdes en un millilitre de 30 % d’éthanol pour une incubation de cinq minutes à température ambiante, suivie d’une incubation de cinq minutes en un millilitre de 70 % d’éthanol à température ambiante. À la fin de l’incubation de 70 % d’éthanol, recueillir les organoïdes par centrifugation et resuspendre les organoïdes en un millilitre de 100 % d’éthanol pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation 100% éthanol, chauffer le gel de traitement des échantillons au micro-ondes pendant 20 secondes ou jusqu’à ce qu’il soit liquéfié, et ajouter 50 microlitres du gel liquéfié à chaque tube d’organoïdes.Placez les tubes sur la glace jusqu’à ce que le gel de traitement de l’échantillon soit solidifié et transférez la goutte d’organoïdes de chaque tube entre les tampons d’éponge bleus dans une cassette pour un traitement ultérieur dans l’ensefant de paraffine. Placez la cassette dans un processeur de tissu programmé pendant 15 minutes par étape, puis sectionnez les organoïdes incorporés paraffine dans le gel de traitement des échantillons à quatre micromètres par section pour la coloration et l’analyse immunohistochimiques selon les protocoles standard. L’efficacité extrahepatic de placage organoïde de canal biliaire est approximativement 2%lorsqu’elle est isolée des souris néonatales ou adultes.Après le passage deux, l’efficacité de placage des organoïdes extrahépatiques de cholagisme dérivés des souris adultes augmente à 11% et reste stable. La majorité des organoïdes démontrent une morphologie cystique dans tous les passages avec des organoïdes irréguliers rares. Les organoïdes atteignent un pic de croissance de cinq à sept jours, après quoi ils commencent à accumuler des débris intraluminaux et se détériorent.Par conséquent, pour le maintien de la culture organoïde, les organoïdes doivent être divisés tous les sept à dix jours. Une fois analysés avec l’immunofluorescence, les organoïdes extrahepatic de cholagisme se composent d’une population pure des cellules épithéliales marquées par E-cadherin. Les cellules organoïdes démontrent également des marqueurs des cellules progénitrices biliaires aussi bien que des marqueurs de différenciation biliaire.Fait important, un pourcentage élevé de cellules organoïdes possèdent un cilium primaire marqué par l’alpha tubuline acétylated, qui est une caractéristique des cholangiocytes normaux et suggère une polarisation appropriée de cellules organoïdes. Une observance étroite de l’état de température décrit est nécessaire. La dissection méticuleuse des canaux biliaires prévient la contamination des cellules du pancréas.La perte de matériel cellulaire peut être évitée par une manipulation minutieuse après centrifugation. Ces organoïdes peuvent être utilisés comme modèles précliniques, manipulés génétiquement et pharmacologiquement, ou utilisés pour tester les médicaments et les effets des agents infectieux. Cette méthode peut être utilisée par les laboratoires qui veulent tirer parti des modèles de souris génétiquement modifiés pour étudier plus avant les mécanismes de la biologie des cholangiocytes.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Une technique pour isoler cholangiocytes des voies biliaires extra-hépatiques de souris néonatale est décrite. Les conduits sont méticuleusement disséqués, puis les cellules sont isolées par l'excroissance dans des gels de collagène épaisses. Cette méthode fournit un outil utile pour étudier extrahépatique bile développement conduit et la pathologie.

Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

Le procédé de culture en trois dimensions décrite dans ce protocole récapitule le développement du pancréas de progéniteurs embryonnaires dispersées de pancréas de souris, y compris leur expansion substantielle, la morphogenèse et la différenciation dans un organe ramifié. Ce procédé se prête à l'imagerie, la perturbation fonctionnelle et la manipulation de la niche.

In Vitro pancréas organogenèse du dispersées progéniteurs embryonnaires de souris

Nous présentons une méthode assez simple et sensible pour la quantification précise de la densité de conduit biliaire dans le foie de souris. Cette méthode peut aider à déterminer les effets des modificateurs génétiques et environnementaux et l'efficacité des thérapies potentielles dans les modèles murins des maladies biliaires.

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Nous montrons une méthode pour l'autopsie et la dissection des modèles de cancer de la prostate de souris, se concentrant sur la dissection de tumeur de prostate. Un protocole étape par étape pour la génération des organoïdes de tumeur de prostate de souris est également présenté.

Génération d'organoïdes tumoraux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés du cancer de la prostate

Les systèmes cellulaires tridimensionnels (3D) sont des modèles pertinents pour étudier l’organogenèse. Une méthode hydrogel-basée pour la production biliaire de kystes et leur caractérisation est proposée. Ce protocole démêle les barrières de la caractérisation 3D, avec une méthode simple et fiable pour évaluer l’efficacité de formation de kyste, tailles, et pour tester leur fonctionnalité.

Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés

Un système de culture organoïde 3D ex vitro à long terme a été établi à partir d’hépatocytes de souris. Ces organoïdes peuvent être passés et génétiquement manipulés par l’infection à lentivirus de la construction shRNA/ectopique, la transfection de siRNA et l’ingénierie CRISPR-Cas9.

Établissement et manipulation génétique d’organoïdes d’hépatocytes murins

Pour l’observation des troubles des voies biliaires néonatales murines, un canal biliaire intact et une préparation efficace sont nécessaires. Par conséquent, une nouvelle approche pour isoler l’ensemble du système des canaux biliaires extrahépatiques chez les nouveau-nés murins a été développée avec succès tout en maintenant l’intégrité des voies biliaires.

Dissection des canaux biliaires extrahépatiques et de la vésicule biliaire chez les nouveau-nés de souris âgés de neuf jours

Ce protocole décrit la génération d’organoïdes hépatiques endodermiques rapides et reproductibles (eHEPO). Avec ce protocole, les eHEPO peuvent être produits en 2 semaines et se développer à long terme (plus d’un an) sans perdre leur différenciation et leur fonctionnalité.

Génération d’organoïdes hépatiques endodermiques fonctionnels

Les organoïdes générés à partir des tumeurs des patients sont injectés orthotopiquement dans le foie de la souris. La résection du tissu hépatique non tumoral conduit à un environnement régénérateur dans le tissu hépatique où se trouve la tumeur.

Un modèle de xénogreffe organoïde dérivé d’un patient atteint d’un cancer hépatocellulaire pour étudier l’impact de la régénération hépatique sur la croissance tumorale

Ce protocole présente une technique optimisée de perfusion hépatique de collagénase en deux étapes dans un modèle de rat et montre l’utilisation d’hépatocytes isolés pour la culture in vitro à long terme d’organoïdes 3D.

Perfusion hépatique de rat et isolement des hépatocytes primaires : une procédure ancienne cruciale pour la culture d’organoïdes 3D de pointe

Découvrez la culture d'organoides biliaires extra-hépatiques de souris pour étudier la biologie des cholangiocytes. Cette méthode reproductible permet d'analyser la régénération tissulaire et les interactions cellulaires.

Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

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