Génération d’Organoïdes des voies biliaires extrahépatiques souris

Ce système organoïde extrahépatique de choe murine peut adresser l’accès limité aux modèles précliniques de cholangiopathies et aux limitations des modèles organoïdes pluripotents de cellules souches et de cholangiocytes hépatiques. Notre modèle est spécifique aux tissus adultes, réductionniste, reproductible, et le temps et rentable. Il sera ux pour les laboratoires qui n’ont pas accès aux tissus humains.

Notre technique permet la culture d’un nombre presque illimité de cholangiocytes extrahépatiques des canaux biliaires pour étudier la régénération des tissus et les interactions cellule à cellule. Junya Shiota, post-doc de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour l’isolement intrahépatique des canaux biliaires, placez la souris adulte dans une position supine et ouvrez la cavité abdominale le long de la ligne médiane.

Rétractez le foie pour se reposer sur le diaphragme et utilisez un hémstat pour tirer doucement le dudénodum proximal pour révéler le canal biliaire commun immédiatement au-dessous de l’hilum de foie. Utilisez un scalpel pour séparer le canal biliaire extrahépatique des tissus environnants. Tenant l’extrémité proximale du canal biliaire commun avec des forceps, disséquez le conduit distally juste au-dessus de sa jonction avec le duodène avant de disséquer l’extrémité proximale du conduit du foie.

Placez immédiatement le canal biliaire extrahépatique isolé dans une plaque de verre contenant un tampon de lavage à froid sur la glace, puis nettoyez le canal biliaire du tissu environnant et hachez-le en sections de 0,5 millimètre. Lorsque tout le tissu a été haché, transférer les sections dans un tube contenant 500 microlitres de tampon de dissociation pour une incubation de 20 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de la dissociation, neutraliser le tampon avec 500 microlitres de culture cellulaire glacée moyenne et triturer la suspension tissulaire 20 fois à travers une aiguille de calibre 18, puis 20 fois à travers une aiguille de calibre 20.

Filtrez ensuite la suspension cellulaire résultante à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Pour établir une culture organoïde biliaire, recueillir les cellules par centrifugation et enlever soigneusement le supernatant. Resuspendez la pastille en un millilitre de PBS stérile et glacé et transférez les cellules dans un tube de 1,5 millilitre pour une deuxième centrifugation.

Resuspendez la pastille lavée dans 120 microlitres de matrice de sous-sol liquéfiée et glacée et plaquez 40 microlitres de cellules au centre de chacun des trois puits d’une plaque de 37 degrés Celsius réchauffée et 24 puits, puis placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant environ 15 minutes. Lorsque la matrice du sous-sol s’est solidifiée, ajouter 600 microlitres de 37 degrés Celsius de milieu d’ensemencement à chaque puits avant de retourner la plaque à l’incubateur. Après trois jours et tous les trois jours par la suite, remplacer le milieu d’ensemencement par 600 microlitres de milieu de culture organoïde frais, en surveillant la croissance organoïde régulièrement avec un microscope inversé.

Pour passer les cultures extrahépatiques des canaux biliaires, pipette les organoïdes dans chaque puits avec 400 microlitres de PBS glacé 10 fois par puits avant de transférer le contenu du puits à des tubes individuels de 1,5 millilitre. Passer chaque mélange à travers une aiguille de calibre 25 quatre fois pour dissocier les organoïdes et recueillir les cellules par centrifugation. Puis résuspendez les cellules dans la matrice du sous-sol au rapport approprié pour le re-placage.

Pour le stockage extrahépatique à long terme des organoïdes des canaux biliaires, lavez chaque puits d’organoïdes avec du PBS à température ambiante sans déranger les gouttes de matrice du sous-sol et ajoutez 500 microlitres de milieu de congélation glacé à chaque puits. Resuspendez doucement les organoïdes et transférez le mélange dans des flacons cryogéniques individuels, puis placez les flacons à moins 80 degrés Celsius pendant 48 heures avant de transférer les organoïdes dans un réservoir d’azote pour un stockage à long terme dans une phase de vapeur. Pour préparer les organoïdes à l’intégration de la paraffine, remplacez le milieu par 500 microlitres de quatre degrés Celsius PBS et transférez la suspension de chaque puits en tubes individuels de 1,5 millilitre contenant la matrice de sous-sol liquéfiée.

Recueillir les organoïdes par centrifugation et utiliser une pointe de pipette P1000 modifiée pour enlever soigneusement les supernatants sans déranger les granulés. Ajoutez ensuite un millilitre de glace, 4% de paraformaldéhyde aux organoïdes pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez le fixatif par un millilitre de PBS à température ambiante pour une incubation de cinq minutes à température ambiante et lavez les organoïdes par centrifugation trois fois.

Après le dernier lavage, resuspendez les organoïdes en un millilitre de 30 % d’éthanol pour une incubation de cinq minutes à température ambiante, suivie d’une incubation de cinq minutes en un millilitre de 70 % d’éthanol à température ambiante. À la fin de l’incubation de 70 % d’éthanol, recueillir les organoïdes par centrifugation et resuspendre les organoïdes en un millilitre de 100 % d’éthanol pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation 100% éthanol, chauffer le gel de traitement des échantillons au micro-ondes pendant 20 secondes ou jusqu’à ce qu’il soit liquéfié, et ajouter 50 microlitres du gel liquéfié à chaque tube d’organoïdes.

Placez les tubes sur la glace jusqu’à ce que le gel de traitement de l’échantillon soit solidifié et transférez la goutte d’organoïdes de chaque tube entre les tampons d’éponge bleus dans une cassette pour un traitement ultérieur dans l’ensefant de paraffine. Placez la cassette dans un processeur de tissu programmé pendant 15 minutes par étape, puis sectionnez les organoïdes incorporés paraffine dans le gel de traitement des échantillons à quatre micromètres par section pour la coloration et l’analyse immunohistochimiques selon les protocoles standard. L’efficacité extrahepatic de placage organoïde de canal biliaire est approximativement 2%lorsqu’elle est isolée des souris néonatales ou adultes.

Après le passage deux, l’efficacité de placage des organoïdes extrahépatiques de cholagisme dérivés des souris adultes augmente à 11% et reste stable. La majorité des organoïdes démontrent une morphologie cystique dans tous les passages avec des organoïdes irréguliers rares. Les organoïdes atteignent un pic de croissance de cinq à sept jours, après quoi ils commencent à accumuler des débris intraluminaux et se détériorent.

Par conséquent, pour le maintien de la culture organoïde, les organoïdes doivent être divisés tous les sept à dix jours. Une fois analysés avec l’immunofluorescence, les organoïdes extrahepatic de cholagisme se composent d’une population pure des cellules épithéliales marquées par E-cadherin. Les cellules organoïdes démontrent également des marqueurs des cellules progénitrices biliaires aussi bien que des marqueurs de différenciation biliaire.

Fait important, un pourcentage élevé de cellules organoïdes possèdent un cilium primaire marqué par l’alpha tubuline acétylated, qui est une caractéristique des cholangiocytes normaux et suggère une polarisation appropriée de cellules organoïdes. Une observance étroite de l’état de température décrit est nécessaire. La dissection méticuleuse des canaux biliaires prévient la contamination des cellules du pancréas.

La perte de matériel cellulaire peut être évitée par une manipulation minutieuse après centrifugation. Ces organoïdes peuvent être utilisés comme modèles précliniques, manipulés génétiquement et pharmacologiquement, ou utilisés pour tester les médicaments et les effets des agents infectieux. Cette méthode peut être utilisée par les laboratoires qui veulent tirer parti des modèles de souris génétiquement modifiés pour étudier plus avant les mécanismes de la biologie des cholangiocytes.