Quantification de la prolifération des cellules CD4^et T spécifiques à l'antigène humain à l'aide de Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Ce protocole fournit une plate-forme pour étudier les réponses des cellules CD4T qui sont souvent faibles et difficiles à détecter. Cette technique permet la détection, l’énumération et l’isolement des cellules CD4T sans connaissance préalable concernant la présentation d’antigène. Le principal avantage est l’analyse des cellules CD4T qui sont très souvent des populations rares associées à des maladies auto-immunes telles que le diabète de type 1.

En obtenant l’échantillon de sang périphérique d’un donneur sain, diluer le sang dans PBS dans au moins un à deux rapport avant de superposer 35 millilitres de sang plus de 15 millilitres de milieu de gradient de densité dans un tube de 50 millilitres. Séparez les cellules par centrifugation de gradient de densité et retirez environ 20 millilitres de la couche plasmatique supérieure qui en résulte. Puis recueillir la couche de globules blancs en prenant soin d’éviter la pastille de globule rouge et laver les cellules trois fois dans PBS frais.

Après compter, diluer les cellules à une fois 10 à la sixième cellule mononucléaire périphérique de sang ou PBMC par millilitre de concentration de PBS. Ajouter 300 microlitres de cellules pour chaque contrôle dans des tubes individuels de 10 millilitres. Après avoir recoupé chaque tube avec PBS, sédimenter les cellules par centrifugation et résuspendre les cellules à une fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration moyenne RP5.

Puis plaque 100 microlitres de cellules par contrôle à chacun des trois puits d’une plaque de puits 96 contenant 100 microlitres de RP5 moyen par puits. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept jours. Ensuite, transférez les PBMCs restants dans un nouveau tube de 50 millilitres et ajoutez un microlitre de solution de stock de travail CFSE par millilitre de suspension cellulaire sur le côté du tube.

Inversez rapidement le tube plusieurs fois pour mélanger et placer les cellules dans un incubateur de culture cellulaire pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec cinq millilitres de RP5 moyen et de recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille à une fois 10 à la sixième PBMCs par millilitre de milieu RP5 frais et ajoutez un millilitre de cellules à un tube de 10 millilitres par antigène à tester.

Ajoutez ensuite 100 microlitres de cellules par antigène à chacun des trois puits d’un puits de 96 plaques contenant 100 microlitres de RP5 moyen complété par l’antigène dilué d’intérêt par puits. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant sept jours. Pour tacher les populations de cellules CD4+T pour l’analyse cytométrique d’écoulement, à la fin de la culture transférer tout le volume des cellules de chaque puits dans le tri cellulaire activé par fluorescence individuelle ou tubes FACS.

Lavez chaque échantillon avec un millilitre de PBS complété par 0,1% sérum fœtal de veau ou FCS. Resuspendez les granulés dans un anticorps CD4 anti-humain approprié dans 100 microlitres de PBS plus FCS par tube. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, lavez les échantillons en un millilitre de PBS frais plus FCS par tube et réutilisez les granulés dans 100 microlitres de PBS frais plus FCS. Immédiatement avant l’analyse, ajouter un microlitre d’iodure de propidium à chaque tube pour permettre l’exclusion des cellules mortes. Portez les lymphocytes en fonction de leurs zones de dispersion avant et latérale.

Pour exclure les cellules apoptotiques, portez la zone de dispersion vers l’avant par rapport aux cellules négatives iodées propidium et utilisez les cellules non tachées pour définir une ligne de base de tension pour les cellules non fluorescentes. Réglez les tensions du fluorophore d’anticorps CD4 et du signal CFSE de sorte que le signal fluorescent soit inférieur à 1000 pour chacun. Utilisez les échantillons cfse et CD4 à commande de couleur unique pour confirmer un signal fluorescent positif pour chaque couleur à l’aide des tensions réglées avec les cellules non tachées.

Comme l’Iodure de l’ESFC et du propidium ont un certain chevauchement spectral, ajustez la compensation pour soustraire la fluorescence de l’iodure de propidium de la fluorescence cfse jusqu’à ce que l’échantillon CFSE seulement ne donne pas de signal dans le canal iodure propidium. Lorsque tous les échantillons ont été analysés, calculer l’indice de division cellulaire en divisant le nombre de cellules divisées par 5000 cellules indivises de l’antigène stimulé groupe par le nombre moyen de cellules divisées pour 5000 cellules indivises à partir des cellules cultures sans antigène. Presque tous les donneurs démontrent une réponse forte de T-cellule au toxoïde de tétanos après stimulation in vitro parce que les donateurs ont été vaccinés faisant du tétanos toxoïde un antigène positif utile de contrôle.

La prolifération des cellules CD4+T des PBMCs non formulés est toutefois minime. Après sept jours de stimulation avec pro-insuline humaine C-peptide, pro-insuline C-peptide spécifiques CD4 + T cellules peuvent être détectés dans le sang périphérique d’un individu avec le diabète de type un. Le PBMC stimulé par la protéine matricielle du virus de la grippe A démontre également la prolifération.

Prises dans leur ensemble, ces données démontrent que l’analyse peut être effectuée à l’aide de protéines pleine longueur ainsi que de peptides synthétiques courts. Le composant FACS de cette méthode peut être effectué à l’aide d’un cytomètre d’écoulement de tri cellulaire. À l’aide d’un trieur cellulaire, les cellules T spécifiques aux antigènes peuvent être isolées au niveau d’une seule cellule pour une analyse en aval.

Cette méthode a permis la découverte de réponses cellulaires CD4T chez les personnes atteintes de diabète de type 1 précoce. L’analyse de ces rares populations de cellules T utilisant d’autres méthodes présente divers défis techniques.