PIÈGE numérique de gouttelettes (ddTRAP): adaptation du protocole de répétition d’amplification de télomère à la réaction en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes

L’analyse ddTRAP permet d’obtenir une mesure sensible, robuste et hautement quantitative de l’activité enzymatique de la télomérase dans les cellules. La possibilité d’exécuter jusqu’à 96 échantillons par course d’une manière à débit moyen nous offre un grand avantage. Nous pouvons exécuter les contrôles et les répliques pour une analyse statistique appropriée sur les données recueillies.

Immédiatement avant le lysage cellulaire, décongeler un aliquot congelé de tampon de lyse NP-40. Une fois décongelé, placez le tampon de lyse sur la glace. Ajouter l’inhibiteur de la protéase PMSF au tampon de lyse NP-40 pour atteindre une concentration finale de 0,2 millimolaire.

Ensuite, ajoutez 40 microlitres du tampon de lyse au tube contenant une pastille cellulaire pour atteindre une équivalence cellulaire de 25 000 cellules par microlitre. Pipette doucement le lysate de haut en bas afin de briser les cellules. Essayez d’éviter de faire des bulles.

Laisser les cellules se lyser sur la glace pendant 30 minutes. Vortex doucement le lysate toutes les 10 minutes pour empêcher les grappes de débris cellulaires de se former. Pendant la lyse cellulaire, préparer un mélange principal dans un tube de microcentrifugeuse pour la réaction d’extension de la télomérase, et conserver sur la glace.

Après la lyse cellulaire, pipette 48 microlitres de maître d’extension se mélangent dans chaque tube PCR. Ajouter deux microlitres de lysate dilué à chaque tube PCR pour atteindre une équivalence cellulaire finale de 50 cellules par microlitre, et continuer la réaction d’extension de télomérase selon le manuscrit. Préparer un mélange maître dans un tube de microcentrifugeuse pour le ddTRAP, et le garder à température ambiante.

Pipette 19,8 microlitres de mélange principal ddPCR dans chaque tube PCR. Ajouter 2,2 microlitres de la solution de réaction d’extension précédente à chaque tube, laissant un volume total de 22 microlitres. Pour installer la cartouche de génération de gouttelettes, chargez d’abord 20 microlitres de la solution préparée dans l’échantillon moyen bien dans la cartouche.

Appuyez doucement sur le côté de la cartouche pour déplacer les bulles vers le haut de la solution. Tous les puits de la cartouche doivent être chargés d’échantillon avant de charger l’huile. Ensuite, chargez 70 microlitres d’huile de production de gouttelettes dans le puits de pétrole gauche.

Fixez le joint en place en l’attacheant aux extrémités de la cartouche et placez la cartouche chargée et assemblée dans le générateur de gouttelettes. Le générateur affiche une lumière verte solide pour informer que la cartouche est placée correctement. Après 60 à 90 secondes, lorsque la lumière du générateur cesse de clignoter, le cycle est terminé.

Maintenant, retirez la cartouche. Retirer délicatement le joint de la cartouche. Utilisez une pipette multicanal pour pipette environ 40 microlitres des gouttelettes nouvellement générées à partir du puits droit dans une plaque PCR de 96 puits.

Sceller la plaque avec des joints de plaque PCR en papier d’aluminium une fois que tous les échantillons sont chargés dans la plaque de 96 puits pour éviter l’évaporation. Ensuite, chargez la plaque de 96 puits dans un thermocycleur pour effectuer la réaction PCR. Pour commencer, chargez la plaque de 96 puits dans le lecteur de gouttelettes.

Orientez correctement la plaque de sorte que l’échantillon A1 corresponde à celui du support. Ouvrez le logiciel associé au lecteur de gouttelettes. Double-cliquez sur le premier puits, A01, pour ouvrir l’écran de l’éditeur bien échantillon.

Cliquez sur Expérimenter et sélectionnez le type d’analyse à utiliser dans le menu drop-down. Sélectionnez QX200 ddPCR EvaGreen Supermix comme méthode de détection correcte. Cliquez sur Appliquer dans le côté inférieur droit de l’écran de l’éditeur de puits pour enregistrer les paramètres définis par l’utilisateur sur tous les puits mis en surbrillance.

Ensuite, cliquez sur Cible dans l’écran de l’éditeur de puits et cliquez sur le menu drop-down de Target pour sélectionner le contrôle inconnu, de référence ou sans modèle pour définir le type d’échantillon. Dans la section Nom de l’échantillon, étiquetez tous les échantillons et cliquez sur Appliquer. Cliquez sur Exécuter pour lire la plaque.

Sélectionnez colonnes ou lignes dans l’écran Des options d’exécuter lorsqu’elles sont invitées à informer de l’orientation dans qui la plaque doit être lue. Déterminez le nombre de gouttelettes acceptées pour chaque échantillon en cliquant en double sur les puits individuels ou les en-têtes de colonne et de rangée pour fournir un tableau d’information. Pour le ddTRAP, les échantillons de 10 000 gouttelettes acceptées ou plus sont valides pour une analyse plus approfondie.

Mettre en évidence les puits représentant des répliques d’échantillons et des échantillons de CNT. Définissez manuellement le seuil pour les échantillons en cliquant sur l’icône pour définir des seuils en bas à gauche de l’écran. Dans ce protocole, l’activité de telomerase a été mesurée dans un panneau cellulaire se composant de neuf lignes cellulaires du cancer de poumon et des fibroblastes telomerase-négatifs.

Un seuil a été fixé à environ 2000 amplitudes de fluorescence pour les trois répliques biologiques pour le SHP77, le H2887 et le CNT. Les gouttelettes positives avaient une intensité de fluorescence autour de 6000 amplitude de fluorescence, qui formait une population claire au sommet, et se séparaient des gouttelettes négatives autour de 1100 amplitude de fluorescence. Les produits totaux d’extension de télomérase par équivalent cellulaire entre tous les échantillons ont été estimés à partir de la concentration mesurée des acides nucléiques, qui représente l’activité de télomérase dans les lignées de cancer du poumon.

Toute contamination par la RNase pendant les étapes de la lyse ou de la réaction d’extension détruira l’activité enzymatique de la télomérase puisqu’il s’agit d’un complexe de ribonucléoprotéines. ddTRAP peut être suivi avec ddPCR sur les niveaux d’expression de l’ARNm hTERT dans la cellule. Les deux ensembles de données nous permettent de corréler l’expression du hTERT avec l’activité de la télomérase et de creuser plus profondément dans les mécanismes de régulation potentiels de la télomérase tels que l’épissage alternatif.

Nous pouvons explorer les manipulations à des facteurs d’épissage spécifiques et leurs effets sur l’activité de la télomérase. Actuellement, nous concevons des modulateurs d’épissage d’oligonucléotide comme médicaments potentiels ciblant l’activité de télomérase.