Name: Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par lévaluation de limmunofluorescence flottante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Découvrez une méthode d'immunofluorescence flottante pour détecter les agrégats d'alpha-synucléine dans les biopsies cutanées. Cette technique permet d'analyser les nerfs dermiques comme biomarqueur potentiel pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson.

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Nous remercions Parkinson Schweiz et ABREOC (le Conseil consultatif de recherche scientifique de l'Ente Ospedaliero Cantonale) pour leur soutien financier à cette étude.

Le protocole a été approuvé par le Comité cantonal d'éthique et tous les sujets inscrits ont donné leur consentement éclairé écrit à l'étude.
1. Collection de biopsie de peau
<ol><li>Laissez un médecin qualifié effectuer la biopsie de la peau dans un cadre clinique approprié.</li>
	<li>Choisissez la zone pour effectuer la biopsie de la peau et nettoyez-la avec un écouvillon d'alcool.</li>
	<li>Préparer la solution anesthésique avec 1 cc de lidocaïne 2%.</li>
	<li>Avec l'aiguille parallèle à la région, injecter sous-cutanée l'anesthésie locale.</li>
	<li>Après avoir vérifié l'effet de l'anesthésie, prendre le poinçon jetable de 3 mm et appliquer une pression rotatif et délicate vers le bas pour le faire pivoter à travers l'épiderme et le derme, jusqu'à ce que la graisse sous-cutanée soit atteinte.</li>
	<li>Retirez le poinçon.</li>
	<li>Utilisez des forceps jetables pour tirer doucement le bouchon de la peau vers le haut.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux pour découper la base du spécimen au niveau du tissu adipeux.</li>
	<li>Placez le spécimen dans un tube contenant 10 ml de solution fixative paropérienne-lysine-paraformaldéhyde (PLP).</li>
	<li>Désinfecter la zone et la recouvrir d'un bandage adhésif.</li>
</ol>2. Fixation et stockage des tissus
<ol><li>Faire une solution fixative PLP fraîche (voir tableau 1).</li>
	<li>Immédiatement après la collecte de la biopsie de la peau, immerger dans un tube contenant 10 ml de solution fixative PLP et l'incuber pendant la nuit (O/N) à 4 oC.</li>
	<li>Le lendemain, sous le capot de fumée, retirer le fixatif PLP doucement et dans le même tube, laver la biopsie 3 fois pendant 5 min avec 5 ml de la solution de 0,1 M Sorensen (tableau 1).</li>
	<li>Jeter la solution du Sorensen et couver la biopsie avec 5 ml de solution cryo-protectrice O/N à 4 oC.</li>
	<li>Conserver la biopsie à 4 oC si la coupe avec un cryotome est effectuée dans un délai d'une semaine; conserver la biopsie à -20 oC si la coupe est effectuée dans un délai de 3 mois; intégrer la biopsie dans un cryomold (étapes 3.2-3.4) et la stocker à -80 oC pour la conserver pendant une plus longue période de temps.</li>
</ol>3. Coupe de tissu avec un Cryotome
<ol><li>Fixer le cryotome à -20 oC.</li>
	<li>Prenez un cryomold et remplissez-le avec le milieu cryo-embedding. Évitez de créer des bulles.</li>
	<li>À l'aide d'une pince à épiler, immerger la biopsie dans le milieu cryo-encastré avec l'axe longitudinal (épiderme - derme) parallèle au fond du cryomold.</li>
	<li>Congelez l'échantillon avec de l'azote liquide pour obtenir un cube solide de milieu cryo-encastré contenant la biopsie dans la bonne orientation.</li>
	<li>Mettre l'échantillon dans le cryostat et attendre 30 min pour permettre à la biopsie de s'acclimater.</li>
	<li>Fixer l'échantillon sur le cryostat et couper des sections de 50 m.</li>
	<li>À l'aide d'une petite brosse, transférer les cryosections dans une plaque de puits de 96 contenant 200 l de solution antigel dans chaque puits. Une section par puits.</li>
	<li>Conserver à -20 oC. REMARQUE: Si l'analyse de la biopsie entière n'est pas analysée, coupez-la seulement partiellement. Dans ce cas, les sections doivent être stockées à -20 oC et la partie restante de la biopsie à -80 oC pour la conserver pendant une plus longue période de temps.</li>
</ol>4. Staining immunofluorescence
<ol><li>Remplir une assiette de 96 puits, avec 100 l de solution de lavage.</li>
	<li>Transférer les sections à analyser de la plaque de stockage à la nouvelle contenant la solution de lavage. 1 section par puits (4 sections par site anatomique, par patient : habituellement un total de 12 sections par patient).</li>
	<li>Laissez la section dans la solution de lavage pendant 10 min à température ambiante (RT). Transférer la section dans un autre puits contenant la même solution et répéter le lavage.</li>
	<li>Déplacer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de solution de blocage et incuber pendant au moins 90 min et pour un maximum de 4 h à RT.</li>
	<li>Diluer les anticorps primaires anti-PGP9.5 (Rabbit polyclonal, 1:1000) et anti-5G4 (Mouse monoclonal, 1:400) dans la solution de travail.</li>
	<li>Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de la solution de travail des anticorps primaires et les incuber O/N à RT.</li>
	<li>À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min à RT, avec 100 ll de solution de lavage.</li>
	<li>Diluer les anticorps secondaires (conjugués avec différents fluorophores) Chèvre anti-Rabbit pour détecter PGP9.5 (1:700) et un anti-souris de chèvre pour détecter 5G4 (1:700) dans la solution de travail.</li>
	<li>Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 l de la solution de travail des anticorps secondaires pendant 90 min à RT. À partir de ce point, couvrir la plaque de puits 96 avec du papier d'aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué avec des anticorps secondaires / ies.</li>
	<li>À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 l de la solution de lavage.</li>
	<li>Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 L de DAPI (dilué 1:5 000 en PBS 1x) pendant 5 min à RT.</li>
	<li>À l'étape 4.3, lavez les sections 2 fois pendant au moins 10 min, avec 100 l de la solution de lavage.</li>
	<li>Montez les sections sur une glissière dans la bonne position en évitant les erreurs de pliage.</li>
	<li>Ajouter quelques gouttes du support de montage sur la glissière et couvrir d'un bordereau.</li>
	<li>Laisser sécher les o/N avant d'utiliser le microscope confocal/fluorescence.</li>
	<li>Conservez les diapositives dans une boîte appropriée à 4 oC en évitant l'exposition à la lumière. S'il est stocké avec précision, le signal sera visible pendant environ 6 mois. REMARQUE: Le transfert d'une section de la plaque de puits 96 contenant les tranches nouvellement coupées à la plaque de puits 96 contenant la solution de lavage (étape 4.1) est effectué à l'aide d'une petite brosse qui aide à ramasser la biopsie. Après le transfert de la section dans le premier puits, chaque fois que la tranche doit être incubée avec une solution différente, déplacez-la de bien à bien avec l'aide de la brosse.</li>
</ol>5. Imagerie immunofluorescence
<ol><li>Afficher les sections sous un microscope à fluorescence inversée ou un microscope confocal (20X, 40x ou grossissement supérieur, utiliser des cadres successifs de 2 par incréments de m sur un plan Z-stack pour de meilleurs résultats).</li>
	<li>Acquérir des images par une caméra connectée au microscope</li>
	<li>
Utiliser un logiciel d'imagerie adéquat (c.-à-d. ImageJ) pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d'intensité du signal. Pour ce faire, effectuer les étapes mentionnées ci-dessous.
	<ol>
<li>Ouvrez le fichier avec le logiciel ImageJ.</li>
		<li>Cliquez sur l'image 'gt; couleur 'gt; canaux de fractionnement afin d'analyser chaque canal de couleur.</li>
		<li>Cliquez sur L'image 'gt; pile 'gt; Z projet pour obtenir une fusion d'acquisitions de sections multiples.</li>
		<li>Cliquez sur L'image 'gt; couleur 'gt; fusionner les canaux pour obtenir une fusion de différents canaux de couleur de la même acquisition.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>
Solution antigel (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois)</td>
			<td>30% de glycérol 30% d'éthylène glycol 30% dH2O 10% 2x tampon de phosphate</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution de blocage (préparer pour le moment)</td>
			<td>4% Sérum de chèvre normal 1% Triton X-100 dans la solution de lavage</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Cryo-protecteur (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois)</td>
			<td>20% de glycérol 80% la solution de Sorensen</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution de phosphate d'hydrogène disodium (magasin à RT jusqu'à 6 mois)</td>
			<td>0.45M Phosphate d'hydrogène disodium (Na2HPO4) en dH2O Filtrer dans une bouteille stérile</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution Lysine (magasinà à 4 oC jusqu'à 3 semaines)</td>
			<td>50% de la solution monohydrochlorure L-Lysine de 0,3 M 50% de la solution de 0,1M Sorensen pH7.6 pH 7.4, filtre dans une bouteille stérile</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Paraformaldéhyde (PFA) 8% (préparer sous le capot de fumée et le conserver à 4 oC jusqu'à 1 mois)</td>
			<td>2,6 M PFA en dH2O (à 55 oC, ne dépasse pas 60 oC pour éviter la formation d'acide<nr> formique) filtre dans une bouteille stérile</nr>
</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Tampon de phosphate 2x (magasinà à 4 oC jusqu'à 6 mois)</td>
			<td>6% De phosphate monosodique (NaH2PO4) solution 45% phosphate de disodium (Na2HPO4) solution en dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution fixative PLP (préparer pour le moment, sous le capot de fumée )</td>
			<td>25% Paraformaldéhyde 8% 0,01 M sodium (méta)période 75% Lysine solution-lt;</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Monohydrate de phosphate de dihydrogène de sodium (magasin à RT jusqu'à 6 mois)</td>
			<td>0.52M Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate (NaH2PO4-H2O) en dH2O Filtrer dans une bouteille stérile.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
La solution de Sorensen (magasinà à 4 oC jusqu'à 1 mois)</td>
			<td>2,5% Solution de phosphate monosodique 18,7% Solution de phosphate de disodium pH7.6, en dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution de lavage (préparer pour le moment)</td>
			<td>0.25M Base de Trizma 0,26 M NaCl pH7.6, en dH2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Solution de travail (préparer pour le moment)</td>
			<td>50% Solution de blocage 50% Solution de lavage</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Solutions requises. Liste des solutions requises pour le protocole et brève description de la façon de le préparer.

<ol><li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+Tool+for+the+neurologist%27s+Tollbox%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li>
<li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilkinson%2C+PF+%22Skin%22">Skin</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. ISBN 978-0-521-10681-8 49-50 (2009).</li>
<li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+endings+in+mammalian+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+reviews+of+the+Cambridge+Philosophical+Society%22%5BJournal%5D)">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li>
<li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li>
<li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+nerve+fiber+density%3A+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li>
<li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Federation+of+Neurological+Societies%2FPeripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li>
<li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-center%2C+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li>
<li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies%2C+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li>
<li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+%26+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li>
<li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li>
<li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson%27s+disease%3A+a+window+into+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li>
<li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson%27s+disease+from+multiple+system+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li>
<li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li>
<li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li>
<li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+nerve+phosphorylated+%CE%B1-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Skin nerve phosphorylated α-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li>
<li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease%3A+a+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li>
<li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+Disease%22%5BJournal%5D)">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li>
<li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Nous décrivons un analyse d'immunofluorescence flottante pour des biopsies de peau pour le diagnostic de : il exploite l'immunostaining double avec l'anticorps anti-PGP9.5, un marqueur panaxonal, et anti-5G4, un anticorps spécifique de conformation qui reconnaît la forme agrégée de Syn.
Les grands avantages de la biopsie de peau pour le but diagnostique dans la MP et probablement dans d'autres désordres conformationnels de protéine sont : 1) l'accès direct au tissu nerveux enclin à la maladie ...

La biopsie de la peau a acquis une grande importance en tant qu'outil de diagnostic et de recherche dans le domaine des troubles neurologiques1. En effet, l'épiderme et le derme contiennent d'abondantes fibres nerveuses sensorielles somatiques (myélinisés et non myélinistielles), des terminaisons nerveuses sans nociceptive, des récepteurs sensoriels et une innervation autonome des glandes sudoripares, des vaisseaux, des glandes sébacées et des pilorum d'arrector musculaires. 2.
Au milieu du XXe siècle, la configuration de l'immunohistochimie de l'anticorps PGP9.5 a permis l'évidence d'une innervation étendue de la peau humaine de mammifères d'épiderme3. PGP9.5 est un hydrolase carboxyl-terminal également réparti le long des axones du système nerveux central et périphérique (PNS). La disponibilité de cet anticorps a permis non seulement de clarifier la morphologie et l'anatomie de PNS dans la peau, mais a également mis en œuvre l'étude des maladies qui lui sont associées3,4. La biopsie de peau a contribué à définir une nouvelle entité clinique : la neuropathie de petite fibre. Plusieurs groupes internationaux ont démontré l'association entre la perte des fibres nerveuses intraépidermiques et des symptômes/signes de la neuropathie de petite fibre5 par l'analyse de biopsie de peau et ont fourni des protocoles normalisés pour la morphométrie de nerf aussi bien que valeurs de référence normatives à utiliser dans la pratique clinique6,7,8.
Récemment, une grande quantité de preuves a montré que les maladies neurodégénératives, caractérisées par des accumulations de protéines mal repliées dans le système nerveux central, sont des pathologies multi-systèmes9. En effet, la DP se caractérise par une accumulation de Syn dans le neurone dopaminergique de la substantia nigra, mais il a été démontré que le Syn et sa forme pathologique, phosphorylée Syn (P-Syn), pouvaient être détectés également dans les tissus périphériques. La muqueuse gastro-intestinale10, glandes salivaires11, fibres autonomes de la peau entourant les glandes sudoripares et les muscles pilomoteurs12,13,14, montrent l'immunoréactivité aux formes pathogènes de 'Syn, en conformément à l'hypothèse de Braak qui postulent intrigantement que la pathologie de Syn peut commencer dans PNS bien à l'avance, avant son accumulation dans le cerveau15. En outre, la présence de p-Syn a été démontrée dans les nerfs de peau des patients présentant des désordres de comportement de REM qui sont considérés prodromal16,17 ainsi la peau pathologique - Syn peut être considérée un périphérique tôt prometteur marqueur histopathologique de synucleinopathy.
L'association de la neuropathie de petite fibre dans a été démontrée précédemment et il a été constaté que la densité intraepidermal de fibres de nerf reflète la progression de la maladie18,19. Par conséquent, la biopsie de peau est un outil utile pour étudier la neurodégénérescence dans la MP et pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de la maladie. En effet, la biopsie de la peau a un grand avantage d'être une procédure facilement accessible et peu invasive, permettant l'analyse des tissus nerveux enclins à la pathologie. Enfin, la possibilité de répéter la biopsie de la peau au cours du suivi des mêmes patients permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie.
Dans notre laboratoire, l'exploitation d'une double immuno-coloration avec PGP9.5 et l'anticorps monoclonal 5G4 conformation-spécifique, qui reconnaît les formes spécifiques de la maladie de 'Syn y compris les petits agrégats20,21, nous avons pu montrer le présence d'agrégats syn dans les nerfs de la peau avec une efficacité diagnostique élevée prometteuse19. L'analyse d'immunofluorescence de la biopsie de peau dans les maladies conformationnelles se distingue comme source prometteuse de biomarqueurs en combinant à la fois la détection des agrégats protéiques et la mesure de la neurodégénérescence in vivo. Par la suite, nous illustrons un protocole facile et polyvalent sur la manipulation de la biopsie de peau et l'exécution de la coloration d'immunofluorescence flottante libre pour détecter des agrégats de Syn. En outre, ce protocole peut être adapté pour cibler toute autre protéine d'intérêt exprimée dans la peau PNS.
Le protocole d'étude suivant a été utilisé pour évaluer l'utilité diagnostique de l'analyse agrégée de Syn dans le PNS de la MP par biopsie de peau19. Les critères d'inclusion pour la étaient : un diagnostic clinique défini selon les critères diagnostiques de banque de cerveau du R-U, la durée de la maladie au moins 3 ans, aucune histoire de famille, et aucune affaiblissement cognitif majeur ou symptômes dysautonomic principaux dans l'histoire. Les critères d'exclusion étaient des causes connues de neuropathie (hémoglobine glyquée, créatinine, vitamine B12, TSH, immunofixation du sérum, VIH, VHC, syphilis et borréliose). Chaque sujet a subi des biopsies de peau de 3 millimètres de diamètre à trois emplacements anatomiques (cou au niveau dermatomal de C8, cuisse 10 cm au-dessus du genou, jambe 10 cm au-dessus du malleolus latéral) sur le côté, qui a été médicalement plus affecté. En général, le protocole suivant consiste à traiter la biopsie de la peau et à effectuer la coloration et l'analyse de l'immunofluorescence flottante. Par conséquent, il peut être adapté et utilisé pour la détection d'autres protéines d'intérêt dans les tissus cutanés.

<table><tbody><tr><td>5G4 (anti humain &alpha ; Syneclein 5G4)</td><td>Analytik Jena Roboscreen</td><td>847-0102004001</td><td>Souris monoclonale&nbsp ;</td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Chèvre anti Lapin IgG&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>1971418</td><td>2 mg/mL</td></tr><tr><td>AlexaFluor 594 Chèvre anti IgG de souris&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>1922849</td><td>2 mg/mL</td></tr> Solution <tr><td>d’hydrogénophosphate disodique</td><td>Merk Millipore</td><td>106586</td><td></td></tr><tr><td>Éthylène glycol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>Monochlorhydrate de L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Aldrich Chimie</td><td></td><td></td>441244</tr><tr><td>PGP9.5</td><td>Abcam</td><td>ab15503</td><td>Chlorure de sodium polyclonal</td></tr><tr><td></td><td>de lapin Sigma&nbsp ;</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium monohydraté</td><td>Merck Millipore</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>(méta)periodate de sodium&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1878</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tryton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&nbsp ;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Support de montage</td></tr></tbody></table>

cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

À ce jour, pour la plupart des maladies neurodégénératives, seul un diagnostic histopathologique post-mortem définitif est disponible. Pour la maladie de Parkinson (PD), le diagnostic repose toujours seulement sur des signes cliniques de la participation motrice qui apparaissent plus tard dans le cours de la maladie, quand la plupart des neurones dopaminergiques sont déjà perdus. Par conséquent, il y a un fort besoin d'un biomarqueur qui puisse identifier les patients au début de la maladie ou au risque de le développer. Au cours des dernières années, la biopsie de la peau s'est avérée être un excellent outil de recherche et de diagnostic pour les maladies nerveuses périphériques telles que la neuropathie des petites fibres. Fait intéressant, une petite neuropathie de fibre et des dépôts neuronaux alpha synucléines ont été montrés par biopsie de peau dans les patients de. En effet, la biopsie de la peau a le grand avantage d'être une procédure facilement accessible, peu invasive et indolore qui permet l'analyse du tissu nerveux périphérique enclin à la pathologie. En outre, la possibilité de répéter la biopsie de peau au cours du suivi du même patient permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie. Nous avons mis en place un protocole fiable normalisé pour étudier la présence des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses de peau du patient de. Ce protocole implique peu d'étapes courtes de fixation, une section cryotome et puis une double coloration d'immunofluorescence flottante avec deux anticorps spécifiques : anti-produit de gène de protéine 9.5 (PGP9.5) pour marquer les fibres cutanées de nerf et anti 5G4 pour détecter Agrégats Syn. Il s'agit d'un protocole polyvalent, sensible et facile à exécuter qui peut également être appliqué pour cibler d'autres protéines d'intérêt dans les nerfs de la peau. La capacité de marquer les agrégats de Syn est un autre pas en avant à l'utilisation de la biopsie de peau comme outil pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de.

Après la procédure décrite (Figure 1), nous avons détecté des agrégats de Syn, étiquetés avec l'anticorps 5G4, dans les fascicles de nerf dermique intériorisant des structures autonomes des patients de. La morphologie des dépôts d'alpha-synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs dermiques (Figure 2). En effet, en exploitant ce protocole dans 19 patients de et 17 contrôles dans des biopsies de peau à trois emplacement anatomique (c...

Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.

Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Le diagnostic de la maladie de Parkinson repose toujours sur des signes cliniques de participation motrice qui apparaissent plus tard au cours de la maladie, lorsque la plupart des neurones du nigra substantia sont déjà perdus. Ce protocole permet d’utiliser l’analyse des nerfs cutanés par biopsie cutanée, qui représente un nouveau biomarqueur potentiel de la maladie, dans le cadre d’essais cliniques. La biopsie cutanée est une procédure facilement évaluable et non invasive qui permet l’analyse du tissu nerveux périphérique qui est sujette à la pathologie.Alpha synucléine agrégats détection par biopsie de la peau peut être utilisé à des fins diagnostiques, peut-être à des phases précoces, lorsque la guérison potentielle est le plus efficace. Les biopsies de peau de suivi dans le même patient permettent une analyse de temps et de cours spécial de l’agrégat d’alpha synuclein se propageant dans le système nerveux cutané humain. Ceux-ci peuvent faire la lumière sur la pathogénie de la maladie.Pour commencer cette procédure, préparez une nouvelle solution fixative PLP telle qu’elle est décrite dans le tableau un du protocole texte. Immédiatement après la collecte de la biopsie de la peau, submergez-la dans un tube contenant 10 millilitres de la solution fixative. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, dans une hotte de fumée, retirez doucement le fixatif PLP. Dans le même tube, laver la biopsie trois fois pendant cinq minutes chacune, à l’aide de cinq millilitres de la solution de la molaire Sorensen pour chaque lavage. Jetez la solution du Sorensen et ajoutez cinq millilitres de solution cryoprotectrice.Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, stockez la biopsie à quatre degrés Celsius si la coupe avec un cryotome doit être effectuée dans un délai d’une semaine. Tout d’abord, réglez le cryotome à moins 20 degrés Celsius.Prenez un cryomold et remplissez-le avec un milieu cryo-enseurgeant. À l’aide d’une pince à épiler, plonger la biopsie dans le milieu cryo-entéré, avec l’axe longitudinal parallèle au fond du cryomold. Snap congeler l’échantillon avec de l’azote liquide, pour obtenir un cube solide de cryo-intégration milieu contenant la biopsie dans la bonne orientation.Mettez l’échantillon dans le cryostat et attendez 30 minutes pour permettre à la biopsie de s’acclimater. Ensuite, fixez l’échantillon sur le cryostat et coupez-le en sections de 50 micromètres. À l’aide d’une petite brosse, transférer les cryo-sections dans une plaque de 96 puits contenant 200 microlitres de solution antigel dans chaque puits.Après cela, conserver la plaque à moins 20 degrés Celsius. Pour commencer, remplissez certains des puits d’une assiette fraîche de 96 puits avec 100 microlitres de solution de lavage. Transférez les sections à analyser de la plaque de stockage à celle contenant la solution de lavage.Laissez les sections dans la solution de lavage pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez chaque section dans un puits vide contenant la même solution de lavage, et répétez le lavage. Ensuite, ajoutez une solution de lavage aux sections et transférez-les dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de solution de blocage.Incuber à température ambiante pendant au moins 90 minutes, et un maximum de quatre heures. Diluer les anticorps primaires, anti-PGP9.5 et anti-5G4, dans la solution de travail. Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps primaires, et incuber toute la nuit à température ambiante.Le lendemain, lavez les sections dans des puits contenant une solution de lavage comme décrit précédemment. Diluer les anticorps secondaires, chèvre anti-lapin pour détecter PGP9.5, et chèvre anti-souris pour détecter 5G4, dans la solution de travail. Transférer les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps secondaires.Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué à des anticorps secondaires, et incuber à température ambiante pendant 90 minutes. Après cela, laver les sections deux fois dans la solution de lavage comme décrit précédemment. Transférer les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de DAPI pendant cinq minutes à température ambiante.Lavez les sections deux fois dans la solution de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, montez les sections sur une glissière dans la bonne position, en évitant les mauvais déroulements. Ajouter quelques gouttes de milieu de montage à la lame et couvrir la section d’un glissement de couvercle.Laissez sécher les toboggans pendant la nuit. Le lendemain, rangez les glissières dans une boîte appropriée à quatre degrés Celsius, en vous assurant d’éviter l’exposition à la lumière. À l’aide d’un microscope à fluorescence inversé ou d’un microscope confocal, visualisez les sections.Acquérir les images par une caméra connectée au microscope. Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d’intensité du signal tel que décrit dans le protocole texte. Suivant la méthode décrite, des agrégats alpha synucléine étiquetés avec l’anticorps 5G4 sont détectés dans les fascicles de nerf dermique innervant des structures autonomes des patients de.La morphologie des dépôts alpha synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs cutatéaux. L’utilisation représentative de ce protocole chez 19 patients atteints de MP et 17 contrôles dans les biopsies cutanées à trois sites anatomiques montre que la 5G4 a une sensibilité de 81% et une spécificité de 86% par rapport aux contrôles sains. La synucléine alpha phosphorylatée a une sensibilité de 56% et une spécificité de 100%5G4 et des dépôts alpha synuclein-positifs phosphorylatés se trouvent principalement autour des glandes sudoripares, mais sont également trouvés dans le pili d’arriéré de muscle, les petits vaisseaux, et le plexus subepidermal et dermique, mais jamais dans les fibres intraepidermales de nerf.Généralement, dans les glandes sudoripares lumen, il est possible d’observer un signal non spécifique qui pourrait être mal interprété comme 5G4 ou phosphorylated alpha synuclein positivité. Ce type de signal est pointillé, sphérique, et il est probablement dû au matériel autofluorescent intraluminal tel que démontré dans les contrôles techniques sans anticorps primaires et secondaires. La colocalisation avec PGP9.5 qui marque les fibres nerveuses, qui sont morphologiquement filamenteuses et allongées, aide à identifier le signal correct.Par conséquent, la spécificité du signal 5G4 est fortement augmentée par une double immunostaining avec un marqueur axonal. Une fixation précise de la biopsie est nécessaire pour produire une coloration immunofluorescente de bonne qualité et pour l’interprétation fiable des signaux fluorescents. Si le fixatif n’est pas correctement préparé, ou si une sur-fixation s’est produite, le résultat sera une autofluorescence élevée qui masquera le signal des fibres nerveuses traversant la jonction dermique-épidermique, ou innervate les structures cutanées principales.L’étape la plus critique de cette procédure est la fixation des tissus. Faites attention au pH de la solution fixative PLP, et le moment de l’incubation, pour éviter l’autofluorescence et un signal spécifique.

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Ajoutez un tampon de chargement contenant un détergent, un agent réducteur et un colorant de suivi.

Détection de l’alpha-synucléine phosphorylée à l’aide du Western Blot

Cette vidéo présente un test d’immunofluorescence pour détecter les agrégats d’alpha-synucléine spécifiques aux maladies neurodégénératives sur des coupes de biopsie cutanée. L’immunocoloration flottante est utilisée pour marquer par fluorescence l’hydrolase carboxyl-terminale et les agrégats d’alpha-synucléine dans les neurones dermiques. Au microscope confocal, les cellules présentant la fluorescence des deux anticorps indiquent la présence d’agrégats d’alpha-synucléine dans les neurones...

Un test d’immunofluorescence pour détecter les agrégats d’alpha-synucléine dans une section de biopsie cutanée

Cette vidéo démontre l’immunocoloration des neurones traités avec des agrégats d’alpha-synucléine (αS). Les neurones sont d’abord traités avec des agrégats αS. Ils sont ensuite fixés, perméabilisés et traités avec une solution bloquante. Des anticorps primaires sont ajoutés, suivis d’anticorps secondaires marqués par fluorescence et d’une coloration nucléaire. L’échantillon est ensuite monté et observé au microscope.

Immunomarquage de neurones traités avec des agrégats d’alpha-synucléine

Cette vidéo démontre le processus de quantification de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires de souris prétraités avec des fibrilles préformées d’alpha-synucléine. Il décrit les étapes de fixation, de coloration et de quantification des neurones dopaminergiques contenant des agrégats d’alpha-synucléine à l’aide de l’immunofluorescence.

Étude de l’accumulation d’alpha-synucléine dans les neurones dopaminergiques embryonnaires primaires de souris

En utilisant la microscopie à force atomique en combinaison avec la technologie de biopanning, nous avons créé un système de biopanning négatif et positif pour acquérir des anticorps contre les variantes de protéines spécifiques à la maladie présentes dans n’importe quel matériel biologique, même à de faibles concentrations.  Nous avons réussi à obtenir des anticorps dirigés contre des variantes de la protéine TDP-43 impliquées dans la sclérose latérale amyotrophique.

Roman microscopie à force atomique Based biopanning pour l&#39;isolement de la morphologie réactifs spécifiques contre TDP-43 variantes dans la sclérose latérale amyotrophique

Un ELISA offrant une nouvelle approche quantitative est décrit. Il détecte spécifiquement l'α-synucléine associée à la maladie (αSD) dans un modèle de souris transgénique (M83) de synucléinopathie en utilisant plusieurs anticorps contre la forme αS phosphorylée sur la Ser129 ou la partie C-terminale de la protéine.

Détection de α-synucléine maladie associée par ELISA renforcée dans le cerveau de souris transgéniques surexprimant A53T humaine mutée α-synucléine

Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement de l’alpha-synucléine (α-syn) de plus en plus insoluble/agrégée à partir de tissu cérébral humain post-mortem. Grâce à l’utilisation de tampons à la résistance détergente croissante et à des techniques d’ultracentrifugation à grande vitesse, les propriétés variables de l’agrégation α-syn dans les tissus malades et non malades peuvent être examinées.

Extraction séquentielle de soluble et insoluble alpha-synucléine de Brains parkinsoniens

Injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine dans le péritoine ou de la langue de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris qui expriment l' alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T familiale et la luciférase de luciole, peut induire une neuropathologie, y compris la neuroinflammation , dans leur système nerveux central.

Bioluminescence imagerie de la neuro-inflammation chez des souris transgéniques Après périphériques Ensemencement de l&#39;alpha-synucléine Fibrilles

Le but du présent protocole est de fournir un système de base de cellules qui réplique la formation d’alpha-synucléine aggregates in vivo. Des inclusions intracellulaires alpha-synucléine sont ensemencées dans des neurones primaires par l’internalisation et propagation d’exogène administrée natif associées aux microsomes alpha-synucléine agrégats isolés de souris transgénique alpha-synucléine malades.

Administration exogène d’Alpha-synucléine Microsomes associées aux agrégats de neurones primaires comme un modèle de cellulaire puissant de la Formation de fibrilles

L’objectif de cet article est de décrire les étapes requises pour la génération de fibrilles à partir de l’alpha-synucléine monomère, le contrôle de qualité ultérieur, et l’utilisation des fibrilles préformées in vivo.

Génération de fibrilles préformées alpha-synucléine à partir de monomères et utilisation in vivo

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour étudier l’accumulation neuronale de α-synucléine dans les neurones primaires de dopamine de souris. Les agrégats α-synucléine phosphorylés dans les neurones sont induits avec des fibrilles préformées d’α-synucléine. L’imagerie automatisée des cellules immunofluorères et l’analyse impartiale de l’image rendent ce protocole robuste adapté au dépistage moyen à élevé des médicaments qui inhibent l’accumulation de synucléine.

Étude de l’accumulation préforme induite d’α-synucléine par fibrile dans les neurones dopaminergiques de la souris embryonnaire primaire

Découvrez une méthode d'immunofluorescence flottante pour détecter les agrégats d'alpha-synucléine dans les biopsies cutanées. Cette technique permet d'analyser les nerfs dermiques comme biomarqueur potentiel pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson.

Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par lévaluation de limmunofluorescence flottante (Vidéo) | JoVE Journal

Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

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