Matrice entièrement humaine basée sur la tumeur dans l’essai d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions
7 mai 2019
Le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance du cancer et de l’invasion. Pour imiter la progression du carcinome, une matrice humaine biologiquement pertinente est nécessaire. Ce protocole introduit une amélioration pour le test in vitro d’invasion de sphéroïdes en trois dimensions en appliquant une matrice humaine à base de leiomyoma. Le protocole introduit également une analyse d’invasion cellulaire basée sur ordinateur.
Comme nous le savons déjà, le microenvironnement tumoral est une partie essentielle de la croissance et de l’invasion du cancer. Pour imiter la progression du carcinome, nous avons besoin d’une matrice de tumeur humaine biologiquement pertinente. C’est la seule matrice de tumeur humaine basée sur l’essai in vitro d’invasion.
Par rapport à l’analyse sphéroïde classique, cette méthode n’est pas aussi sensible à la température et ne nécessite pas de transfert sphéroïde. Cette technique convient aux échantillons solides de cancer patients-dérivés tels que le carcinome de tête et de cou et peut s’étendre à la médecine personnalisée comprenant des thérapies de chemoradiation. Cette matrice basée sur la tumeur humaine a déjà été employée pour plusieurs applications comprenant le essai de drogue à haut débit, l’analyse de cellules vivantes, la guérison de blessure, et les essais de transfert.
L’étape la plus techniquement sensible est la manipulation de la méthode du fibrinogen est ajouté de sorte que vous voudrez peut-être d’abord pratiquer cette étape avec des puits vides. Il est important de montrer la bonne manipulation de la matrice et il est facile à analyser en montrant la méthode visuellement. Pour la génération sphéroïde multicellulaire de tumeur, distribuez une fois 10 aux cellules tierces de la ligne cellulaire d’intérêt dans 50 microlitres du milieu complet dans chaque puits d’une plaque ronde-bas d’attachement ultra-basse de 96 puits.
Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre jours avant de confirmer visuellement la formation sphéroïde tumorale au microscope inversé. Pour mettre en place un test tridimensionnel d’invasion sphéroïde, décongelez la matrice humaine dérivée du myoma sur la glace et décongelez la solution de stock de fibrinogen dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Lorsque les rééconts se sont réchauffés, mélanger les volumes appropriés de matrice moyenne complète dérivée du myome humain, de thrombine, d’aprotinine et de fibrinogen, en ajoutant le fibrinogène juste avant de distribuer le mélange matriciel dans les cellules.
Ajoutez immédiatement 50 microlitres du gel résultant dans chaque puits de la plaque de culture sphéroïde, en dirigeant la pointe vers la paroi intérieure de chaque puits et en ralentissant sans déplacer le sphéroïde du centre du puits. Puisque le fibrinogène commence à geler après quelques minutes, il exige un pipetting inverse robuste mais précis et le traitement de seulement quelques puits à la fois. Remettre la plaque à l’incubateur de culture cellulaire pendant 30 minutes pour permettre au gel fibrine matriciel dérivé du myoma humain de se solidifier avant d’ajouter doucement 100 microlitres de milieu complet au sommet de chaque gel.
Puis l’image de l’invasion sphéroïde tous les jours. Pour la segmentation d’images avec ilastik, ouvrez le logiciel open-source de classification et de segmentation d’image et sélectionnez le flux de travail Pixel Classification. Enregistrez le projet ilastik sur l’ordinateur.
Les pixels seront classés en fonction des annotations faites par l’utilisateur. Cliquez sur Les données d’entrée et ajoutez-en de nouvelles pour sélectionner des images pour l’analyse. Pour la sélection des fonctionnalités, cliquez sur Sélection de fonctionnalités et Sélectionnez les fonctionnalités.
Cliquez sur les cases appropriées pour sélectionner les fonctionnalités d’intérêt. Les boîtes sélectionnées passeront au vert. Pour une formation, cliquez sur Formation.
Dans la section Formation, il devrait y avoir deux étiquettes, l’étiquette 1 et l’étiquette 2. Marquez l’arrière-plan avec l’une des étiquettes et marquez les cellules avec l’autre étiquette. Lorsque toutes les cellules et l’arrière-plan de la première image ont été étiquetés, sélectionnez l’image suivante à partir de la vue actuelle pour continuer à marquer les cellules et l’arrière-plan jusqu’à ce que 10% des images aient été marquées.
Sélectionnez Ensuite Mise à jour en direct pour analyser toutes les images. Lorsque la formation est terminée et qu’ilastik a analysé toutes les images, cliquez sur Prédiction Export et sélectionnez Segmentation simple à partir de source. Sélectionnez ensuite le format de fichier de sortie souhaité parmi Choisissez les paramètres d’image d’exportation et cliquez sur Export All pour exporter les résultats de l’étiquetage.
Les fichiers seront exportés vers le même dossier avec les images originales. Pour l’analyse de zone, ouvrez d’abord l’image originale avec une barre d’échelle dans Fiji ImageJ, en prenant soin que l’image a la même taille et la même dimension que les images analysées. Utilisez l’outil de sélection des lignes pour tracer une ligne d’une longueur connue et cliquez sur Analyser et définir l’échelle.
Réglez ensuite la distance connue dans le champ de distance connu. Réglez l’unité appropriée et cliquez sur Global. Pour installer le plugin ilastik, cliquez sur Aide et Mise à jour et cliquez sur Gérer les sites de mise à jour dans la fenêtre mise à jour ImageJ.
Cliquez à côté d’ilastik, Fermer et appliquer les modifications. Après plusieurs minutes, une fenêtre d’information apparaîtra disant mise à jour avec succès. Cliquez sur OK et redémarrez ImageJ.
Ensuite, cliquez sur Plugins, Macros, et installer et sélectionner le compteur. fichier ijm. Cliquez ensuite sur Ouvrir.
Pour compléter l’analyse de zone, cliquez sur Plugins et faites défiler pour sélectionner ilastik. Sélectionnez Import HDF5 et sélectionnez le fichier avec le format h5. Cliquez sur Ouvrir et charger et appliquer la table de recherchez.
Cliquez ensuite sur le bouton A sur le clavier et la zone apparaîtra dans la fenêtre de résumé comme zone totale. Dans cette expérience représentative, quatre jours après l’ensemencement métastatique de cellules squameuses de cellules squamous de laryngeal, la matrice a été ajoutée sur les sphéroïdes formés comme démontré et l’invasion a été surveillée quotidiennement sur un microscope inversé. Une fois intégrées, les cellules de la matrice fibrine dérivée du myoma humain ont commencé à envahir rapidement après un jour et se sont étendues dans la matrice au cours des deux jours suivants.
Les cellules de la matrice dérivée du sarcome de souris n’ont pas envahi la matrice environnante, formant plutôt une structure asymétrique. Les cellules dans le collagène ont envahi légèrement mais en raison du rétrécissement de matrice l’analyse est devenue difficile. Dans certains puits, les sphéroïdes ont même disparu au bout de trois jours.
Ici, la quantification de l’invasion d’une carcinome squamous laryngeal primaire et métastatique de cellules squamous dans la matrice fibrine myoma-dérivée humaine est montrée. L’analyse à cellules vivantes de l’invasion sphéroïde de matrice fibrine dérivée du myoma humain révèle le mouvement cellulaire dans les brins dans toute la matrice qui est suivi par d’autres cellules au fil du temps. N’oubliez pas de faire attention de ne pas déplacer le sphéroïde de la position centrale lors de l’ajout de la matrice aux puits.
Cette procédure peut être utilisée pour étudier comment l’irradiation et des molécules spécifiques telles que les médicaments contre le cancer affectent l’invasion. Les cellules peuvent être fixées et tachées pour des études ultérieures. Dans le modèle classique du sarcome de souris, les cellules prolifèrent principalement et l’aspect invasion est minime.
Cette matrice tumorale humaine induit l’invasion, rendant les études d’inhibition plus efficaces.
Aperçu
Cette étude présente un nouvel essai d'invasion in vitro en sphéroïdes tridimensionnels utilisant une matrice dérivée de léiomyome humain, améliorant ainsi la modélisation de la progression du carcinome. La méthode permet une analyse améliorée de l'invasion des cellules tumorales et s'applique à des échantillons de cancers solides dérivés de patients.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie du cancer
- Microenvironnement tumoral
- Essais in vitro
Contexte
- Le microenvironnement tumoral joue un rôle essentiel dans la croissance et l'envahissement des cancers.
- Une matrice tumorale humaine biologiquement pertinente est essentielle pour une modélisation précise de la progression du carcinome.
- Cette méthode est moins sensible à la température par rapport aux essais classiques de sphéroïdes.
- Elle convient aux applications de médecine personnalisée, notamment aux thérapies chimioradiothérapeutiques.
Objectif de l'étude
- Développer un test basé sur une matrice tumorale humaine pour l'étude de l'invasion des cellules cancéreuses.
- Fournir un protocole qui minimise les difficultés techniques associées aux méthodes traditionnelles.
- Permettre des tests de médicaments à haut débit et une analyse en temps réel des cellules vivantes.
Méthodes utilisées
- Génération de sphéroïdes tumoraux multicellulaires dans des plaques à adhérence ultra-faible.
- Préparation d'une matrice dérivée de myome humain et de fibrinogène pour le test d'envahissement.
- Imagerie quotidienne de l'envahissement des sphéroïdes à l'aide d'un microscope inversé.
- Analyse d'images à l'aide d'ilastik pour la segmentation et la quantification de la surface.
Résultats principaux
- Les cellules dans la matrice dérivée de myome humain ont envahi rapidement, démontrant une modélisation efficace du comportement tumoral.
- La comparaison avec d'autres matrices a révélé des profils d'invasion distincts, soulignant les avantages de la matrice d'origine humaine.
- L'analyse de cellules vivantes a mis en évidence des mouvements cellulaires dynamiques et une invasion au fil du temps.
- La méthode peut être adaptée pour étudier les effets de divers traitements sur l'invasion tumorale.
Conclusions
- La matrice dérivée du myome humain fournit une plateforme solide pour l'étude de l'invasion des cellules cancéreuses.
- Cet essai peut faciliter la recherche sur les interventions thérapeutiques contre le cancer.
- Une manipulation appropriée et une méthodologie rigoureuse sont essentielles pour la mise en œuvre réussie de cet essai.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Cet essai comble une lacune critique dans la recherche préclinique sur le cancer en fournissant une matrice dérivée de tumeur humaine qui reproduit mieux le microenvironnement in vivo par rapport aux alternatives d'origine animale. Il permet une modélisation plus prédictive de l'invasion des carcinomes, soutenant ainsi la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques en phase initiale de découverte. La plateforme convient aux applications de criblage et à la continuité translationnelle, en particulier pour les carcinomes de la tête et du cou ainsi que pour les échantillons dérivés de patients.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge des hypothèses thérapeutiques en permettant la validation fonctionnelle de cibles dans un contexte de matrice extracellulaire pertinent pour l'humain.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté mécanistique grâce à l'observation directe de phénotypes d'invasion dans un système biologiquement pertinent.
- Valeur prédictive : Facilite le tri des projets en identifiant les composés capables de moduler l'invasion dans un modèle prédictif du comportement tumoral humain.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit un système tridimensionnel normalisé et reproductible permettant l'évaluation quantitative des effets de composés sur l'invasion cellulaire.
- Valeur opérationnelle : Permet des tests de médicaments à haut débit avec une variabilité technique minimale, grâce à une sensibilité réduite à la température et à l'absence de besoin de transférer les sphéroïdes.
- Extensibilité : Compatible avec des plaques à 96 puits à adhérence ultra-faible, permettant la miniaturisation des tests et le criblage multiparamétrique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Utilise une matrice dérivée de léiomyome humain pour relier les découvertes à la validation préclinique dans un système pertinent pour la maladie.
- Alignement sur les biomarqueurs : Permet l'analyse en temps réel de la dynamique d'invasion, facilitant la corrélation avec des signatures moléculaires ou des réponses au traitement.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller/ne pas aller en quantifiant l'inhibition de l'invasion, un critère phénotypique clé dans la prévention des métastases.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité de la découverte, de la validation de la cible à l'identification de composés candidats, jusqu'aux essais d'efficacité préclinique, en particulier pour les programmes axés sur les métastases.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les facteurs d'invasion et les modificateurs de voies dans un contexte de microenvironnement tumoral humain.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives fondées sur l'imagerie, adaptées à l'analyse automatisée et au profilage de composés.
- Analyse : Génère des mesures de surface d'invasion à l'aide d' ilastik et d' ImageJ, permettant des comparaisons statistiques entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'appuie sur des travaux précliniques en modélisant une étape clé de la métastase à l'aide d'une matrice d'origine humaine.
- Utilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable, applicable à divers types de cancers solides et de modalités thérapeutiques, y compris la chimioradiothérapie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant la dépendance à l'égard de matrices non humaines qui imitent mal le stroma tumoral humain.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation grâce à un protocole défini de préparation de la matrice et à un flux de travail d'imagerie.
- Valeur stratégique : Accroît l'efficacité du capital en améliorant la prédiction précoce de la transposabilité clinique, réduisant ainsi les échecs en phase avancée dus à une modélisation insuffisante des métastases.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques en fonction de leur puissance d'inhibition de l'invasion dans un système pertinent pour l'humain.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire 3D, en manipulation de matrices et en technique stérile pour la préparation du gel de fibrine.
- Dépend de l'accès à des microscopes inversés, à ilastik et à Fiji ImageJ pour l'imagerie et l'analyse.
- Exige une standardisation interéquipes de la formation des sphéroïdes et de la distribution de la matrice afin d'éviter les artefacts de position.
- L'adaptation à d'autres systèmes modèles nécessite une validation de la compatibilité de la matrice et des cinétiques d'envahissement.
- Limite pratique : le fibrinogène déclenche une gélification rapide, exigeant un pipetage précis et chronométré pour préserver l'intégrité des sphéroïdes.
