Multiplexage et transfection d'ADN à haut débit à l'aide de la technologie de nanodispensation acoustique

Le protocole de transfection basé sur NanoDispenser sur développé pour décrire dans cette vidéo représente la première méthode de transfection conviviale et à haut débit permettant même aux débutants sur le terrain de réussir. Ceci est facile sur la technique à haut débit permet la transfection de la cellule avec 384 état indépendant. À partir de maintenant, la méthode est faible coût en raison du nano volume de reagent nécessaire.

Pour définir les meilleurs paramètres de transfection pour tout le type de cellule, nous suggérons de maintenir la concentration d’ADN source constante, et en utilisant des quantités variables d’ADN transfecté, réagent de transfection, et le nombre de cellules. Pour la distribution de la suspension cellulaire de 40 microlitres, montez une cassette de 10 microlitres sur le dispositif peristaltic de gestionnaire liquide, et préparez un programme approprié. Tout d’abord, ajuster le paramètre du débit à faible pour distribuer les cellules à basse vitesse afin d’éviter de favoriser les dommages potentiels aux cellules par le stress et l’impact élevé sur le fond des puits.

Ensuite, réglez la hauteur de distribution à 11,43 millimètres. La hauteur doit être suffisamment élevée pour réduire l’impact de la cellule sur le fond des puits pendant le processus de distribution, mais suffisamment basse pour éviter la rétention des gouttelettes sur la tête de distribution. Ensuite, ajustez la hauteur claire de la plaque à 16 millimètres pour permettre le déplacement libre de la tête de distribution au-dessus de la plaque après la distribution de chaque rangée.

Contrôlez visuellement les réglages appropriés de la hauteur de la tête du gestionnaire liquide périssaltique. Assurez-vous qu’aucune goutte n’est conservée sur les conseils de distribution pendant la distribution. Vérifiez également que la tête est suffisamment haute pour permettre le déplacement de la tête après la distribution de chaque rangée.

Afin de générer des listes de sélection pour conduire la dispensation de l’ADE, une macro de feuille de calcul conviviale a été développée pour gérer les quantités d’ADN et mélanger jusqu’à quatre plasmides dans un format de plaque de puits 384. Les volumes optimaux sont pré-remplis dans certaines cellules de la feuille de calcul, mais peuvent être modifiés. Dans les champs roses, le réaccente de transfection, ou valeur du mélange TR, est fixé à 500 nanolitres.

La valeur de volume minimale dans les puits de plaque source est définie à quatre microlitres, et le volume maximal dans les puits de plaque source à 11,25 microlitres. Entrez 100 nanogrammes par ADN microlitre à partir des concentrations dans les champs bleus correspondant à l’ADN sous-jacent. Ensuite, entrez la quantité d’ADN désirée dans les champs gris et verts correspondant aux 384 puits de la plaque.

Entrez les quantités et les noms plasmides et assurez-vous que la même orthographe est utilisée si le même plasmide doit être transfecté dans plusieurs puits. Cliquez sur générer des listes de sélection pour vérifier les valeurs saisies et, sur demande, corrigez les cellules remplies d’orange indiquant les erreurs ou les volumes qui ne peuvent pas être manipulés par le NanoDispenser. Si aucun n’est détecté, la macro générera le guide de distribution de puits 384, le fichier de liste de sélection d’ADN, et le fichier de liste de sélection TR à partir des données recueillies sur les feuilles correspondantes.

Imprimez le modèle à partir de la feuille de plaque source pour visualiser les puits à remplir avant de le distribuer. Des noms plasmides et des volumes de remplissage minimes sont indiqués. Les volumes de mélange de réaccfection transfection qui seront remplis dans les puits suivants, sont indiqués comme TR et mis en évidence en vert.

Pour préparer la plaque source d’ADN, diluer le plasmide d’ADN stocké à 100 nanogrammes par microlitre à l’aide d’eau distillée. Maintenant, calibrer la grille de puits 384 aux dimensions de la plaque. Ouvrez l’application 384 Well Pipetting Guide sur une tablette.

Placez la place source sur la grille sur l’écran inférieur. Dans le menu d’étalonnage supérieur gauche, cliquez plus ou moins pour améliorer ou réduire la taille de la grille et des puits afin d’ajuster les puits verts aux quatre puits d’angle de la plaque. À l’aide de ruban adhésif à double face, montez l’adaptateur de plaque imprimé 3D sur l’écran pour éviter les mouvements des plaques sources pendant la distribution.

Si nécessaire, déplacez la grille calibrée à l’aide des flèches de rotation et des boutons vers le haut, vers le bas, à droite et à gauche pour ajuster la grille à la position de la plaque. Une fois que la grille et la taille des puits sont correctement calibrées et localisées, cochez la case d’étalonnage de verrouillage. Cliquez sur le fichier et ouvrez le 384-Wells-Pipetting-Guide.

fichier csv. Suivez les instructions de l’écran pour distribuer manuellement le volume indiqué de plasmide à la concentration spécifiée dans le puits blanc surligné qui correspond à la destination cible appropriée de la plaque prévue. Utilisez moins ou plus de flèches pour revenir en arrière ou plus loin dans le processus de distribution d’ADN.

Arrêtez de distribuer en atteignant la première solution de réaccente de transfection à charger. Une fois les dispensations d’ADN terminées, retirez la plaque source de l’adaptateur. Si plusieurs plaques sources doivent être remplies, placez une nouvelle plaque source sur l’adaptateur et suivez les instructions de distribution.

Centrifugeuse les plaques sources remplies d’ADN pour assurer un nivellement adéquat du liquide et éliminer les bulles conduisant à l’inexactitude dans les transferts de base ADE. Maintenant, exécutez une enquête pour contrôler les volumes distribués manuellement. Sur le PC NanoDispenser, exécutez le programme NanoDispenser.

Allez à l’onglet de diagnostic, cochez la boîte de réception de la plaque source, chargez la plaque source sur le porte-plaques et cochez pour entrer dans la plaque. Lorsqu’il est invité, sélectionnez 384LDV_AQ_B2 pour définir le NanoDispenser sur le mode de distribution tampon aqueux et appuyez sur OK. Sélectionnez l’enquête dans le menu divers. Et cliquez sur le lancement.

Sélectionnez les puits pré-remplis pour analyser et cliquez sur le bouton aller. Vérifiez que les volumes mesurés correspondent aux volumes attendus et assurez-vous qu’aucun puits n’a été chargé avec des volumes de plus de 12 microlitres. Primez le tube avec le milieu libre de sérum en remplissant un nouveau récipient stérile avec 10 millilitres de milieu libre de sérum préchauffé et en vantant l’organisateur de tube dedans.

Appuyez sur le bouton principal du gestionnaire liquide périssaltique pendant environ 10 secondes. Assurez-vous que la pointe n’est pas obstruée en inspectant visuellement le débit de la tête de distribution. Placez une plaque stérile 384 bien culture sur le porte-plaques de manutention liquide périssaltique, et retirez son couvercle.

Exécutez le programme pré-calibré pour distribuer un microlitre dans chaque puits de la plaque de puits 384. Le temps de distribution est d’environ huit secondes. Remplacez ensuite le couvercle de la plaque de puits 384.

Pour configurer la distribution d’ADN pilotée par ADE, exécutez le logiciel picklist. Réglez les 384 puits provenant de 384LDV. Réglez l’appareil en mode de distribution tampon aqueux en sélectionnant 384LDV_AQ_B2.

Et les types de plaques de destination à Greiner_384PS_781096. Débit de transfert optimisé non coché. Sélectionnez l’onglet liste de sélection.

Cliquez sur l’importation. Et sélectionnez le DNA_Picklist_CSV fichier. Ensuite, cliquez sur jouer et enregistrer le protocole.

Cliquez sur simuler pour effectuer une simulation des dispensations du programme pour vous assurer que la liste de sélection correspond à la conception expérimentale attendue. Cliquez sur le bouton exécuter et démarrer le programme de distribution. Lorsqu’on vous le demande, insérez la plaque source demandée.

Et puis la plaque de destination dans le NanoDispenser. Pour mettre en place la dispensation de réaccélération transfection, travailler dans un cabinet de biosécurité pour diluer le réagent transfection lipopolyplex dans le sérum moyen libre à une concentration finale d’un x et vortex le tube. Distribuez immédiatement le mélange TR selon la plaque source prédéfinie daignée par la macro et à l’aide de l’application pré-calibrée de guide de pipetage de puits 384.

Après la distribution de TR, effectuez un levé pour contrôler les volumes chargés tr comme cela a été fait auparavant pour l’ADN chargé. Sélectionnez le mélange de réaction de transfection précalé des puits à analyser. Et cliquez sur le bouton aller.

Vérifiez que les volumes mesurés correspondent aux volumes attendus. Et assurez-vous qu’aucun puits n’a été chargé avec des volumes de plus de 12 microlitres. Effectuez maintenant une réinitialisation de la liste de sélection d’ADN dans le logiciel picklist.

Vérifiez que les paramètres de l’appareil sont toujours définis sur des tampons aqueux. Entrez les bons types de plaques de source et de destination. Sur l’onglet liste de sélection, cliquez sur réinitialiser pour effacer la liste d’échantillons.

Cliquez ensuite sur l’importation et choisissez le TR_Picklist. Fichier CSV. Cliquez sur jouer.

Enregistrez le protocole si cela est demandé et effectuez une simulation des dispensations du mélange de réaccfection transfection du programme afin d’assurer une conception appropriée en cliquant sur le bouton simuler. Comme cela a été fait précédemment, après avoir cliqué sur le bouton d’exécuter et de commencer le programme de distribution placer la plaque source, puis la plaque de destination dans le NanoDipsenser comme demandé. Pour distribuer les cellules, remplissez un nouveau vaisseau stérile avec la suspension cellulaire préparée et remuez-la pour éviter la sédimentation menant à l’inexactitude et à la densité cellulaire.

Insérez l’organisateur du tube dans la solution. Ensuite, appuyez sur le bouton principal jusqu’à ce que la suspension cellulaire commence à rincer de la tête de distribution. Assurez-vous que la pointe n’est pas obstruée en inspectant visuellement le débit de la tête de distribution pendant la chasse d’eau et assurez-vous que chaque tube est chargé de suspension cellulaire.

Maintenant, chargez l’ADN et tr rempli 384 plaque de destination de puits sur le transporteur peristaltic plaque gestionnaire liquide et enlever son couvercle. Exécutez le programme pré-calibré pour distribuer 40 microlitres de la suspension cellulaire sur la plaque complète de 384 puits. Le temps de distribution est d’environ 45 secondes.

Enfin, remplacez le couvercle de la plaque de puits 384. La transfection des cellules d’HeLa utilisant le reagent lipopolyplex a été réussie. Les quantités d’ADN allant de cinq à 30 nanogrammes ont montré la même efficacité et jusqu’à 90% de transfection cellulaire à un volume de diluant microlitre.

En revanche, des quantités plus élevées ont entraîné une diminution brutale du pourcentage de cellules transfectées. Divers volumes de diluants allant de 15 nanolitres à quatre microlitres ont été testés et un microlitre a été identifié comme la meilleure condition. Afin d’améliorer davantage le débit de ce protocole, deux méthodes efficaces de stockage de l’ADN ont été testées, à savoir le stockage à sec de la plaque ou l’entreposage congelé.

Les deux méthodes de stockage n’ont pas conduit à des résultats significativement différents de la solution d’ADN fraîchement distribuée stockée pendant jusqu’à sept jours. Comme la transfection plasmatique emploie habituellement au moins deux plasmides différents, la capacité de multiplexage d’ADN de ce protocole a été examinée en utilisant les conditions les mieux identifiées. La protéine fluorescente rouge tdTomato précédemment utilisée exprimant le plasmide a été modifiée pour exprimer mVenus une protéine fluorescente jaune vif et les deux ont ensuite été employées dans des tentatives de cotransfection.

L’analyse des cellules positives fluorescentes rouges ou vertes a montré que l’efficacité de la transfection était d’environ 80 %Cependant, près de 100 % des globules rouges ont également été cotransfectés, les mVenus exprimant le plasmide comme on peut le voir dans l’analyse représentative de l’image basée sur les logiciels. Une fois que les AD ont été distribués dans la plaque source. Effectuez un sondage pour vous assurer que les volumes prévus ont été chargés et ne dépassent pas 12 microlitres.

Tout en distribuant le réaccfection transfection dans la plaque source, essayez d’éviter les bulles car les sous-plaques centrifugeuses entraîneront une perte complète de l’efficacité de la transfection. Cette méthode peut être appliquée à l’expérience biologique, les crimes et la transfection et convient pour la plupart qui peut être effectuée dans un format de plaque de puits 384. Une transfection à toute épreuve ouvre la voie à de nouvelles applications telles que le plasmide basé sur des approches de non-criblage plus nettes permettant de surveiller l’effet intermittent actuellement incapable d’être triés dans des stratégies médiocres.