Name: Enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microRNA et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microRNA et de leur taux de transfert cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Découvrez un protocole de qRT-PCR pour quantifier le micro-ARN dans les particules de lipoprotéines HDL et LDL. Cette méthode permet d'enrichir les particules et d'évaluer leur taux de transfert cellulaire.

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Ce travail a été appuyé par le projet du Fonds scientifique autrichien P29110-B21, le projet «Hochschuljubiläumsstiftung der Stadt Wien zur Förderung der Wissenschaft» H-3065/2011, le Fonds européen pour le développement régional (EFRE, IWB2020), l’État fédéral de la haute L’Autriche, et le «Land OÖ Basisfinanzierung».

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, l’isolement des fractions de particules de lipoprotéine du sang humain et la détermination de leur contenu individuel de miRNA est décrit étape par étape. Il est essentiel de travailler dans un environnement exempt de RNase tout en manipulant le miRNA isolé et synthétisé — le miRNA incorporé aux particules est manifestement à l’abri de la dégradation enzymatique. Comme le rapport miRNA/particule des particules de lipoprotéines indigènes est assez faible, l’enrichissement artificiel avec miRNA est nécessaire pour étudier l’absorption des particules Holo des cellules. Ainsi, la reconstitution des particules de HDL comme décrit précédemment7 est modifiée pour incorporer les brins de mirna. En outre, la séparation de la fraction lipidique et protéique au cours de cette procédure permet aux scientifiques d’examiner les composants associés aux lipides et aux protéines de la particule de lipoprotéine19. De la même manière, la procédure d’étiquetage des particules de LDL est adaptée. Il est intéressant de noter que l’addition de spermine — un stabilisateur naturel des nucléotides — n’a pas influencé le rapport miRNA/particule. Il convient de noter que, en principe, la méthode permet l’inpliage d’autres substances que le miRNA dans une particule de lipoprotéine. Bien sûr, il y a une limite en ce qui concerne la taille physique de la substance en fonction de la taille globale du HDL (diamètre: 5-12 nm) et des particules de LDL (diamètre: 18-25 nm).
En ce qui concerne le contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines reconstituées/étiquetées, HS-AFM est une méthode applicable pour caractériser les particules de HDL/LDL au niveau de la particule unique. Par rapport à l’EM, il permet des temps de préparation plus courts et des conditions quasi-physiologiques (humides, température ambiante).
En raison de sa sensibilité inhérente et de son amplification, la qPCR est la méthode de choix pour détecter les faibles concentrations de miRNA. Alternativement, la microscopie à fluorescence à une seule molécule, qui est capable de détecter même des molécules individuelles, ne serait pas appropriée en raison des faibles concentrations, par exemple, de brins de miRNA marqués par fluorescence par particule. Ainsi, le ratio des brins de miRNA par particule de lipoprotéine native s’est révélé être 10-8. L’enrichissement artificiel augmente le ratio d’un facteur de 10 000, ce qui facilite l’estimation du taux d’absorption des lipoprotéines cellulaires (aucune différence significative n’est détectée à l’aide de particules de lipoprotéines indigènes 19). La sensibilité élevée de la qPCR permet de déterminer ce taux d’absorption en mesurant le nombre de brins de miRNA après le temps d’incubation et le rapport miRNA/particule. Il convient de noter que la valeur calculée ignore la dégradation cellulaire et la libération de miRNA et, par conséquent, représente au moins une limite inférieure pour le ratio d’absorption des particules de lipoprotéine.
À l’avenir, la méthode peut être adaptée pour transférer des substances pharmaceutiques (notamment des lipophiles) dans les cellules et corréler leur effet biologique à la concentration intracellulaire (déterminée par le taux d’absorption des particules de lipoprotéines).

Les particules de lipoprotéines sont composées d’une monocouche de lipides amphiphiles et de cholestérol renfermant un noyau d’esters cholestérylés et de graisses triglycérides. La particule entière est stabilisée par des apolipoprotéines intégrées à la membrane, qui définissent la fonctionnalité biologique de la particule. Les particules de lipoprotéines peuvent être distinguées en fonction de leur densité croissante respective et, par conséquent, de la taille décroissantes, à savoir les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), les LDL et les particules de HDL. Malgré le transport de composants insolubles dans l’eau dans la circulation sanguine, il a été démontré que les particules de HDL transportent des brins non codant de mirna1,2. Les micro-RNAs sont une classe de brins d’ARN courts (généralement deux douzaines de nucléotides), qui dégradent les brins d’ARNm complémentaires intracellulares et, par conséquent, modifient le profil d’expression de certaines protéines3,4,5, le 6. En outre, les modifications du profil miRNA ont été trouvées dans une variété de maladies et, par conséquent, le profil est applicable en tant que biomarqueur pour le diagnostic et le pronostic. Le transport extracellulaire de miRNAs entre les cellules par l’intermédiaire de particules de lipoprotéines peut servir de mécanisme supplémentaire pour la modulation de niveau d’ARNm intercellulaire. Pour estimer quantitativement l’effet biologique, il est nécessaire de connaître la teneur en miRNA absolue et relative des particules de lipoprotéines.
La PCR quantitative en temps réel est une méthode appropriée et relativement rapide pour obtenir cette information. Par conséquent, la valeur relative de quantification (RQ) peut être calculée, et les différences relatives entre les différents échantillons et les fractions de lipoprotéine sont estimables. Les cartes multipuits microfluidiques sont une méthode rapide et facile à utiliser pour déterminer la présence relative (équivaut à la valeur RQ) des miRNAs dans un échantillon. Les cartes multipuits microfluidiques sont constituées de 96 ou 384 chambres de réaction individuelles pour les réactions de qPCR individuelles incorporées dans un dispositif microfluidique. Chaque chambre contient la sonde d’hydrolyse requise et des amorces spécifiques de qPCR pour un miRNA individuel. Les avantages sont un temps de manipulation court en raison de la normalisation, un workflow simple, et un nombre réduit d’étapes de pipetage. De plus, le volume d’échantillonnage requis est minimisé. Contrairement à la quantification relative, le contenu absolu de miRNA nécessite une comparaison des résultats de l’échantillon de qPCR avec des courbes standard de nombres absolus connus de brins de miRNA. Il convient de noter que, en raison de leur teneur relativement faible en miRNA, la norme et, en outre, même les techniques d’imagerie sensibles à une seule molécule ne sont pas réalisables — l’enrichissement artificiel des particules de lipoprotéine avec miRNA est inévitable pour étudier les cellules cellulaires l’interaction des particules de lipoprotéines et le transfert de miRNA. En ce qui concerne cette, la déconcentration de la particule de HDL suivie de la relipidation subséquente7 permet l’incorporation de et, par conséquent, l’enrichissement avec des brins de mirna. L’enrichissement similaire des particules de LDL avec le miRNA n’est pas réalisable en raison de l’hydrophobicité de la protéine apoB-100, qui est le constituant principal de la particule de LDL. Cependant, par addition du diméthyl sulfoxyde de solvant polaire (DMSO), qui est capable de pénétrer les membranes lipidiques, les particules de LDL peuvent être chargées artificiellement avec des brins de miRNA aussi bien.
La microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) est un outil puissant pour la caractérisation des spécimens biologiques offrant une résolution temporelle de subnanomètre spatiale et sous-seconde8. Par conséquent, il s’agit d’une technique bien adaptée pour le contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines modifiées, car les particules de lipoprotéines natives/reconstituées/étiquetées peuvent être imagées dans un environnement quasi physiologique.
Ici, un protocole basé sur qPCR est présenté étape par étape pour déterminer la teneur absolue/relative en miRNA des particules de lipoprotéines et des échantillons de cellules, ce qui permet une estimation du taux de capture des particules de lipoprotéines cellulaires. En outre, une méthode pour l’enrichissement des particules de lipoprotéine avec miRNA est démontrée. Cette méthode peut être adaptée pour la manipulation générale de la teneur en lipoprotéines et, par conséquent, démontre l’applicabilité des particules de lipoprotéines comme cibles pour la délivrance de médicaments.

<table><tbody><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>Rotor d’ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>TI 55.2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer (EDTA)</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2110</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>Tubes</td> <td>ultracentrifugesBeckman</td><td>342414</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>Scelleuse de tubes à ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>342428</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>Sodiumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0650/50</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td>Tubes de dialyse, MWCO 12 - 14k</td><td>Spectra</td><td>132700</td><td>Isolation des lipoprotéines</td></tr><tr><td></td><td></td><td>miARN synthétique</td><td>microTampon</td></tr> <tr>TRIS <td>AM9850G</td><td>synthétique</td><td>Ambion</td><td>Tampon TRIS</td></tr><tr><td>pH 8</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>microARN synthétique</td>Tampon TRIS</tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH</td><td>ENE8.1</td><td>Photomètre à miARN synthétique</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Biophotomètre</td><td>Bradford</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>XK20</td><td>Bradford assay</td></tr><tr><td>Coomassie G-250 Stain</td><td>BioRad GmbH</td><td>161-0786</td><td>Bradford</td></tr><tr><td>sean Sodiumchlorid</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957.1</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fluka Analytical</td><td>03690-100ML</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>TRIS buffer pH 8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td>Delipitation</td></tr><tr><td>Éthanol 100 %</td><td>AustrAlco</td><td>Ethanol Absolut 99.9 %</td><td>Délipitation</td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3942.1</td> Centrifugeuse à <td>délipitation</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Multifuge X3R</td><td>Délipitation</td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3313.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4627.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Phosphatidylcholine</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>P3556-25mg</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Oléate de cholestérol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C-9253-250mg</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>du cholestérol</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>C8667-500mg</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>tubes en verre</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K226.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>spermine</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>S3256-1G</td><td>reconstitution</td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer comfort</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Désoxycholate</td><td>de sodium Sigma Aldrich GmbH</td><td>3097-25G</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>Barre d’agitation magnétique</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0955.2</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>100&micro ; Micropipettes L</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A762.1</td><td>Reconstitution</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9143.2</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>Amberlite XAD-2 billes</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>10357</td><td>Dialysis</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer casette (coupure 20 kDa)</td><td>Thermo Scientific</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td> de <td>dialyse</td><td>Braun</td><td>9161406V</td></tr><tr>Seringue de dialyse<td> aiguille</td><td>Braun</td><td>465 76 83</td><td>Dialyse</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3054.2</td><td>Marquage des particules LDL</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>life technologies</td><td>D12345</td><td>Marquage des particules LDL</td></tr><tr><td>Microscope à force atomique</td><td>RIBM</td><td>SS-NEX</td><td>Contrôle qualité des particules de lipoprotéines reconstituées/marquées</td></tr><tr><td>Muscovite Mica (grade V-1)</td><td>Christine Gr&ouml ; pl</td><td>G250-1/V1</td><td>Contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines reconstituées/marquées</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Cantilever Nanoworld</td><td>USC-F1.2-k0.15</td><td>Contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines reconstituées/marquées</td></tr><tr><td>Gwyddion 2.49</td><td>Institut tchèque de métrologie</td><td>http://gwyddion.net</td><td>Contrôle de la qualité des particules de lipoprotéines reconstituées/marquées</td></tr><tr><td>Lames de chambre, Nunc Lab-Tek</td><td>VWR</td><td>734-2122</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9117.1</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Omni Life Science GmbH</td><td>Casy</td><td>Culture cellulaire</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>217004</td> extraction <td>de miARN</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>extraction de miARN</td></tr><tr><td>20G aiguille</td><td>Braun</td><td>Sterican 465 75 19</td><td>miARN seringue d’extraction</td></tr><tr><td>5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309050</td><td>Extraction de miARN</td></tr><tr><td>Armoire PCR</td><td>Esco</td><td>PCR-3A1</td><td>Transcription inverse</td></tr><tr><td>TaqMan Reverse Transcription Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td>Reverse Transcription</td></tr><tr><td>Eau sans Rnase</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T143</td><td>Transcription inverse</td></tr><tr><td>Tubes de 0,2 ml</td><td>Marque</td><td>781305</td><td>Centrifugeuse à transcription inverse</td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Microcentrifugeuse AL</td><td>Thermocycleur à transcription inverse</td></tr><tr><td></td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>Transcription inverse</td></tr><tr><td>TaqMan Primer</td><td>Thermo</td><td></td> <td>Scientific-qPCR</td></tr><tr><td>iTaq Sonde universelle supermix</td><td>BioRad GmbH</td><td>1725131</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Corbett</td><td>Rotor-Gene RG-6000</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4366596</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex RT Amorces, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399966</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Array TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td><td>Applied Biosystems</td><td>4399933</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, sans UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td>TaqMan Array TaqMan</td></tr><tr><td>Advanced miRNA Human A Cards</td><td>Applied Biosystems</td><td>A31805</td><td>TaqMan</td></tr><tr><td>Array Eau sans nucléase</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>MgCl2 (25mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0971</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>TE, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9849</td><td>TaqMan Array</td></tr><tr><td>7900HT Système de PCR rapide en temps réel</td><td>Applied Biosystems</td><td>4351405</td><td>TaqMan Array TaqMan</td></tr><tr><td>Array Card Sealer</td><td>Applied Biosystems-TaqMan</td><td></td> <td>Array</td></tr></tbody></table>

enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microrna et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microrna et de leur taux de transfert cellulaire

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Les particules de lipoprotéines sont principalement des transporteurs de lipides et de cholestérol dans la circulation sanguine. En outre, ils contiennent de petites quantités de brins de microRNA non codant (miRNA). En général, miRNA modifie le profil d’expression protéique en raison des interactions avec l’ARN messager (mRNA). Ainsi, la connaissance de la teneur en miRNA relative et absolue des particules de lipoprotéines est essentielle pour estimer l’effet biologique de l’absorption des particules cellulaires. Ici, un protocole quantitatif en temps réel de réaction en chaîne de la polymérase (qPCR) est présenté pour déterminer la teneur absolue en miRNA des particules de lipoprotéines — illustré pour les particules de lipoprotéines natives et enrichifiées par le miRNA. Le contenu miRNA relatif est quantifié à l’aide de cartes multipuits microfluidiques. En outre, ce protocole permet aux scientifiques d’estimer le miRNA cellulaire et, par conséquent, le taux de capture des particules lipoprotéiques. Une augmentation significative du niveau de miRNA cellulaire est observable lors de l’utilisation de particules de lipoprotéines de haute densité (HDL) chargées artificiellement avec le miRNA, tandis que l’incubation avec des particules de HDL indigènes ne donne aucun effet significatif en raison de leur teneur assez faible en miRNA. En revanche, l’absorption cellulaire des particules de lipoprotéines de basse densité (LDL) — ni avec le miRNA natif, ni avec elle, ne modifie pas le niveau de miRNA cellulaire.

Ici, un protocole quantitatif en temps réel basé sur la réaction en chaîne de la polymérase est présenté pour la détermination de la teneur en micro-ARN native (absolue/relative) des particules de lipoprotéines. En outre, une méthode pour augmenter le niveau de micro-ARN, ainsi qu’une méthode pour déterminer le taux d’absorption cellulaire des particules de lipoprotéines, est démontrée.

Enrichissement de particules de lipoprotéines indigènes avec microRNA et détermination subséquente de leur teneur absolue/relative de microRNA et de leur taux de transfert cellulaire

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Les particules de lipoprotéine sont des véhicules de transport indigènes. L’enrichissement de substances étrangères facilite leur utilisation comme transporteur de voies. L’étiquetage spécifique des molécules ou des particules entières permet de mesurer l’absorption cellulaire.Les deux méthodes d’enrichissement sont rapides et faciles à utiliser, et peuvent être adaptées pour un large éventail de substances. Markus Axmann et Andreas Karner, deux postdocs de mon labo, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer la délipidation dans un capot de fumée, mélangez un à deux millilitres de solution HDL préparée contenant cinq milligrammes de particules HDL avec 50 millilitres de mélange pré-refroidi de trois à deux mélanges d’éther de détyle d’éthanol dans un tube de centrifugation conique.Incuber pendant deux heures à 20 degrés Celsius négatif. Centrifugeuse à 2500 fois g pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius négatifs. Jetez le supernatant, resuspendez la pastille en 50 millilitres de mélange d’éther de détyle d’éthanol pré-refroidi, et vortex brièvement.Incuber une deuxième fois pendant deux heures à 20 degrés Celsius négatifs. Centrifugeuse à nouveau à 2500 fois g pendant 10 minutes à 10 degrés Celsius négatifs. Insérez ensuite des tubes qui fournissent le flux de gaz azoté pour sécher la pastille.Et le resuspendre en 250 microlitres de tampon A.Déterminer la concentration de protéines en utilisant l’analyse de la protéine Bradford ou un autre approprié. Il est essentiel d’éliminer les restes du mélange d’éther de diéthyle d’éthanol, car ces solvants inhiberaient la relipidation des apolipoprotéines. Ensuite, diluer à une concentration finale d’un milligramme de protéines par 250 microlitres de tampon A.Insérer un tube fournissant du gaz inerte dans la partie solution dans le tube.Au besoin, conserver la solution pendant la nuit à quatre degrés Celsius sous l’atmosphère inerte du gaz. Pour commencer la reconstitution, dans un tube de verre propre, mélanger 100 microlitres de CO, 13,5 microlitres de C et 500 microlitres de PC. Faites ensuite pivoter le tube de verre tout en rinçant le gaz azoté à l’intérieur du tube pour sécher le mélange afin de produire une couche de surface homogène. Dans un tube de réaction de 0,5 millilitre, préparer une solution de spermine fraîche de 30 millimlaires dans le tampon A.Then mélanger 100 microlitres de microARN synthétique de 10 micromlaires avec 100 microlitres de solution spermine dans un tube de réaction de deux millilitres.Et incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius. Ensuite, transférez la solution incubée de 200 microlitres dans le tube de verre pour réhydrater la couche de surface préparée du mastermix PC-CO-C. Et puis ajouter 50 microlitres d’une solution de désoxycholate de sodium de 30 millilitres par millilitre.Remuer à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Après cela, ajouter 250 microlitres de la solution HDL délipidée dans le tube de verre. Et remuer à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Pour commencer la dialyse, ajoutez d’abord 50 grammes de perles adsorbentes à 800 millilitres d’eau double distillée. Et utilisez un agitateur magnétique pour remuer pendant une minute. Attendez 15 minutes pour que les perles se déposent et décantent le surnatant.Répétez la procédure avec du PBS pré-refroidi. Cassettes de dialyse pré-humides en PBS. Utilisez une seringue pour ajouter le mélange préalablement préparé dans les cassettes selon les instructions du fabricant.Ajouter les perles adsorbent traitées par PBS à trois litres de PBS et placer les cassettes dans le PBS pour les dialyser à quatre degrés Celsius. Les perles maintiennent le gradient de densité le long de la membrane de dialyse constante. Changer le tampon et les perles après une heure et deux heures.Après 24 heures, avec une seringue, extraire la solution de la cassette dans un tube de réaction de 1,5 millilitre pour récupérer la solution de particules HDL reconstituée. Déterminer la concentration de protéines à l’aide de l’analyse bradford. Fournissez du gaz inerte au tube de réaction, scellez-le et stockez la solution de particules HDL reconstituée sous une atmosphère de gaz inerte à quatre degrés Celsius.Tout d’abord, préparer une solution de spermine fraîche de 30 millimlaires dans de l’eau sans RNAse. Mélangez 100 microlitres de 10 micromolaires de microARN synthétique avec 100 microlitres de solution spermine dans un tube de réaction de deux millilitres. Et incuber pendant 30 minutes à 30 degrés Celsius.Ajoutez ensuite 100 microlitres de DMSO et 1,2 millilitres de tampon 1X LDL à la solution de spermine microARN préparée. Diluer la solution de particules LDL préparée précédemment avec PBS à une concentration finale d’environ quatre milligrammes par millilitre. Puis dessiner 450 microlitres de la solution diluée dans un tube de réaction de 1,5 millilitre, et mélanger avec 50 microlitres de tampon LDL 10X.Incubez-le pendant 10 minutes sur la glace. Après l’incubation, combinez la solution de particules LDL de 500 microlitres et la solution microARN-spermine-DMSO de 1,5 millilitre, et incubez-la pendant deux heures à 40 degrés Celsius. Effectuez une dialyse similaire à celle décrite précédemment et stockez la solution de particules LDL étiquetée sous atmosphère de gaz inerte à quatre degrés Celsius.Pour commencer, diluer la solution de particules HDL ou LDL dans PBS entre un à 100 et un à 1000. Fendre le mica en appuyant sur le ruban adhésif contre le substrat de mica, et en tirant le ruban pour enlever les couches supérieures de mica. Utilisez une pipette pour déposer deux microlitres sur du mica fraîchement fendue pour incuber pendant cinq minutes.Les particules de lipoprotéine ont tendance à former des membranes de liaison continues sur les surfaces. Par conséquent, il est important d’ajuster la concentration de particules sur la surface du mica pour obtenir des concentrations individuelles. Après l’incubation, rincer l’échantillon avec du PBS.Remplissez la cellule liquide AFM à grande vitesse avec PBS et montez le scanner porteur de mica jusqu’au stade afm à grande vitesse. Dans le logiciel de contrôle, démarrer le processus d’approche du porte-à-faux à la surface mica. Utilisez des tailles d’analyse inférieures à un micromètre carré et maintenez les forces d’imagerie aussi faibles que possible.Imagez l’échantillon en mode taraudage. Chargez les données dans le Gwyddion et détectez les particules via les grains de marque par fonction de seuil. Ajustez la valeur du seuil de hauteur pour masquer les particules individuelles.Habituellement, un niveau d’environ 50% est un bon point de départ. Supprimez l’arrière-plan polynomial pour aplatir l’image et activez l’option exclure la région masquée. Exportez les valeurs maximales de hauteur des particules détectées en utilisant la distribution de diverses caractéristiques céréalières et répétez ces étapes pour toutes les images enregistrées.Dans cette expérience, la reconstitution des particules de HDL a été exécutée par la délipidation des particules de HDL, suivie de la relipidation et de la dialyse. Un rendement de 50 % des particules HDL reconstituées peut être atteint. Cependant, le même étiquetage avec microARN n’était pas faisable pour l’étiquetage des particules de LDL, en raison de l’hydrophobicité de la protéine B100 d’apolipoprotéine.Ainsi, DMSO a été utilisé pour la pénétration de la monocouche lipidique des particules LDL, avec un rendement proche de 100% Pendant le contrôle de la qualité, la dilution est critique pour l’analyse. L’image du haut montre une densité de particules trop élevée. L’image du bas convient à l’analyse.Les fonctions de densité de probabilité des hauteurs de particules ont été calculées pour la comparaison des distributions de taille des particules lipoprotéines de contrôle indigènes, étiquetées et étiquetées. Le changement relatif avant et après la procédure d’étiquetage est négligé. Lorsque vous manipulez des oligonucléotides d’ARN, travaillez sans RNAse.Utilisez des consommables en plastique jetables frais et portez toujours des gants. N’utilisez que des solutions sans nucléase. L’AFM à grande vitesse n’est qu’une méthode pour déterminer la forme générale des lipoprotéines.Une autre méthode serait la microscopie électronique. Portez l’équipement approprié de protection personnelle, et travaillez dans une hotte de fumée tout en manipulant l’éther de dithyle.

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