Name: Évaluation de langiogenèse thérapeutique dans un modèle murine de lischémie hindlimb (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Découvrez l'évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murin d'ischémie du membre postérieur. Cette méthode permet d'analyser les effets fonctionnels, histologiques et moléculaires des agents angiogéniques.

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Nous remercions José Rino et Tânia Carvalho, respectivement responsables de l'installation de bioimagerie et d'histologie et de pathologie comparée de l'Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, respectivement. Nous remercions également Vyacheslav Sushchyk du Département d'Anatomie de la Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Référence de financement : projet financé par UID/IC/0306/2016 Fundaçao para a Ciência e a Tecnologia. Paula de Oliveira est soutenue par une bourse (SFRH/BD/80483/2011) de Fundaçao para a Ciência e Tecnologia.

<ol><li>Becker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+I%3A+Definitions%2C+epidemiology%2C+clinical+presentation+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).</li>
<li>Fowkes, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+artery+disease%3A+epidemiology+and+global+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives.</a> Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).</li>
<li>Abu Dabrh, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+untreated+severe+or+critical+limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The natural history of untreated severe or critical limb ischemia.</a> Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).</li>
<li>Lejay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+murine+model+of+sustainable+and+durable+chronic+critical+limb+ischemia+fairly+mimicking+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).</li>
<li>Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+therapy+in+patients+with+critical+limb+ischemia+without+surgical+options%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options.</a> Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).</li>
<li>Lotfi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+relevant+hind+limb+model+of+muscle+ischaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia.</a> Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).</li>
<li>Masaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+gene+therapy+for+experimental+critical+limb+ischemia%3A+acceleration+of+limb+loss+by+overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+but+not+of+fibroblast+growth+factor-2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2.</a> Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).</li>
<li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).</li>
<li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Vascular+and+Endovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).</li>
<li>Brevetti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+hyperemia+unmasks+regional+blood+flow+deficit+in+experimental+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia.</a> Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).</li>
<li>Ministro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+ionizing+radiation+induces+therapeutic+neovascularization+in+a+pre-clinical+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia.</a> Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).</li>
<li>Pereira, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+angiogenesis+induced+by+human+umbilical+cord+tissue-derived+mesenchymal+stromal+cells+in+a+murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia.</a> Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145(2016).</li>
<li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Modèles Murine de CLI ont principalement consisté en ligature de l'artère fémorale juste distal à l'origine de la femoris profunda 4,6,6,7,8,9. Cela a montré de laisser la plupart de la circulation collatérale intacte, ce qui restaure le flux sanguin vers le membre dans les 7 jours 9. L'enlèvement du l...

La maladie artérielle périphérique (PAD) affecte principalement les membres inférieurs. La DAP est causée par l'athérosclérose, une obstruction artérielle qui peut causer une restriction grave du flux sanguin dans les membres inférieurs1. La claudication intermittente est la première manifestation de PAD et se réfère à la douleur musculaire lors de la marche. CLI est le stade le plus grave de PAD, étant diagnostiqué chez les patients qui montrent des douleurs de repos ischémiques, des ulcères ou de la gangrène2. Les patients atteints d'ICL ont un risque élevé d'amputation, surtout s'ils ne sont pas traités3. La revascularisation des membres inférieurs (soit par chirurgie ouverte, soit par une procédure endovasculaire) est actuellement le seul moyen d'obtenir le sauvetage des membres. Cependant, environ 30% des patients de CLI ne sont pas adaptés à ces procédures, pour des raisons qui incluent l'emplacement des lésions, le modèle de l'occlusion artérielle et la comorbidité étendue4,5. Par conséquent, de nouvelles thérapies sont nécessaires pour ces patients autrement intraitables, avec la promotion de l'angiogenèse étant la stratégie sous l'enquête plus intense.
Avant d'effectuer des essais chez l'homme, l'efficacité et l'innocuité de nouvelles thérapies in vivo doivent être prises en compte dans les modèles animaux. Plusieurs modèles ont été développés pour l'étude de CLI, principalement en induisant l'ischémie postérieure (HLI) chez les souris6,7,8,9,10. Cependant, ces modèles diffèrent dans plusieurs aspects, y compris la nature des artères qui sont ligated et / ou excisée et si les veines et les nerfs environnants sont disséqués ainsi6,7,8, 9,10. Pris ensemble, ces aspects affecteront la sévérité de la lésion ischémique-reperfusion chez chaque animal, ce qui rend les résultats difficiles à comparer. Par conséquent, il est essentiel de développer un protocole efficace dans lequel la procédure d'induire l'ischémie et l'évaluation de différentes cibles devraient être normalisées pour évaluer si une thérapie angiogénique donnée sera efficace. Un protocole expérimental conçu pour couvrir tous ces aspects fournirait une compréhension complète des mécanismes par lesquels les thérapies angiogéniques exercent leurs effets et une mesure de leur efficacité à chacun de leurs résultats. Deux ouvrages distincts récemment publiés par notre équipe sont un bon exemple11,12, dans lequel différentes approches pour induire l'angiogenèse thérapeutique ont été évaluées en utilisant le même protocole qui sera décrit avec plus de détails dans ce protocole.
L'objectif global de ce protocole est de décrire un modèle expérimental reproductible qui peut imiter les effets de CLI et jeter les bases expérimentales pour une évaluation complète des effets fonctionnels, histologiques et moléculaires de l'angiogénique putatif Agents.

<table><tbody><tr><td>7500 PCR rapide en temps réel</td><td>Instrument</td>de <td>biosystèmes</td><td></td> appliqués</tr><tr><td>Réactif 1000141000 acétone</td><td></td><td></td><td> ; Attention - Réactif</td></tr><tr><td>d’adénosine</td><td>Valdepharm</td><td></td><td></td></tr> hautement inflammable <tr><td>Atipamézole</td><td>Réactif OrionPharma</td><td></td><td>Sulfate</td></tr><tr>de<td>baryum (Micropaque)</td><td>Guebert</td><td>8671404 (réf. Infarmed)</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Buprénorphine</td><td>RichterPharma</td><td></td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Opmi-1 FC Microscope chirurgical</td><td>Carl Zeiss Microscopie, Allemagne</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>ADNc RT2 PreAMP Kit de synthèse d’ADNc</td><td>Qiagen</td><td>7335730</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Leica CM</td><td>Leica Microsystems</td><td>3050S</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>DAB kit de substrat de peroxydase</td><td>DAKO ; Vector Laboratories</td><td>K3468</td><td>Réactif</td></tr> de <tr><td>peroxydase d’hydrogène</td><td></td><td>1072090250</td><td>Réactif ; Attention -</td></tr><tr><td>stylo hydrophobe</td> nocif <td>Dako</td><td>411121</td><td>réactif ; Attention - toxique</td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>Richterpharma</td><td>CN :580393,7 630/01/12 Dfvf</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR</td><td>MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td><td>5710</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Leica DM2500 microscope droit à fond clair</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Medetor</td><td>Virbac</td><td>037/01/07RFVPT</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>méthanol</td><td>VWR</td><td>UN1230</td><td>réactif ; Attention - réactif toxique et hautement inflammable</td></tr><tr><td>Papaverine</td><td>Labesfal</td><td></td><td>Pentano</td></tr><tr><td>Isso</td><td>Merk</td><td>1060561000</td><td>réactif ; Attention - hautement inflammable</td></tr><tr><td>Power SYBR&reg ; Green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>purifié anti-souris CD31</td><td>Pharmingen</td><td>550274</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>RNeasy Micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Surgic-Pro 6.0</td><td>Medtronic (Coviden)</td><td>VP733X</td><td>Suture</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxydase, Rat IgG)</td><td>Vectastain ABC kit ; Vector Laboratories</td><td>PK-4004</td><td>Réactif</td></tr><tr><td>Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td><td>Medtronic (Covidien)</td><td>UL202/ UL101</td><td>Suture</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Système de microdissection laser</td><td>Carl Zeiss Microscopie, Allemagne</td><td>1023290916</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Microscope stéréotaxique</td><td>Carl Zeiss Microscopie, Allemagne</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique</td><td>Linux</td><td></td><td>instrument</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murine de l'ischémie hindlimb

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

L'ischémie critique des membres (ICL) est une affection grave qui entraîne un risque élevé d'amputation des membres inférieurs. En dépit de la revascularisation étant la thérapie d'or-standard, un nombre considérable de patients de CLI ne sont pas adaptés pour la revascularisation chirurgicale ou endovasculaire. Les thérapies angiogéniques émergent comme option pour ces patients mais sont actuellement encore à l'étude. Avant l'application chez l'homme, ces thérapies doivent être testées dans des modèles animaux et ses mécanismes doivent être clairement compris. Un modèle animal de l'ischémie postérieure (HLI) a été développé par la ligature et l'excision des artères et veines iliaques et fémorales externes distales chez les souris. Un panel complet d'essais a été assemblé pour évaluer les effets de l'ischémie et des thérapies angiogéniques putatives aux niveaux fonctionnel, histologique et moléculaire. Laser Doppler a été utilisé pour la mesure du débit et l'évaluation fonctionnelle de la perfusion. La réponse de tissu a été évaluée par l'analyse de la densité capillaire après coloration avec l'anticorps anti-CD31 sur des sections histologiques du muscle gastrocnemius et par la mesure de la densité collatérale de navire après diaphonization. L'expression des gènes angiogéniques a été quantifiée par RT-PCR ciblant des facteurs angiogéniques choisis exclusivement dans les cellules endothéliales (EC) après microdissection de capture de laser des muscles gastrocnemius de souris. Ces méthodes étaient sensibles en identifiant les différences entre les membres ischémiques et non ischémiques et entre les membres traités et non traités. Ce protocole fournit un modèle reproductible de CLI et un cadre pour tester les thérapies angiogéniques.

Utilisant le protocole décrit, les cellules souches mésenchymales de cordon ombilical et le rayonnement ionisant de bas-dose (LDIR) ont été examinés en tant que thérapies angiogéniques putatives 11,12. Des lectures de perfusion de Doppler de laser ont été obtenues avant l'induction d'ischémie et aux points de temps pré-spécifiés s'étendant immédiatement après l'induction d'ischémie à 45 jours post-ischémie. Les lectures de perfusion de tissu par Doppler de laser ...

Ici, un modèle expérimental critique d'ischémie de membre postérieur est présenté suivi d'une batterie de tests fonctionnels, histologiques et moléculaires pour évaluer l'efficacité des thérapies angiogéniques.

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

L’objectif global de cette expérience, notre modèle d’ischémie postérieur est d’éclairer l’expérience une base pour une évaluation complète des effets fonctionnels, histologiques et moléculaires des agents angiogéniques putatifs. Ce protocole permet d’obtenir une norme pour l’essai de thérapies angiogéniques possibles dans un modèle de petit animal avec le potentiel d’applications futures dans le contexte clinique. Comme la revascularisation n’est pas appropriée dans vingt à trente pour cent des patients critiques ischémie angiogenèse thérapeutique a émergé comme une nouvelle stratégie pour améliorer la profusion de sang au site ischémique.Ce protocole expérimental pourrait fournir une compréhension complète des mécanismes par lesquels les thérapies angiogéniques exercent leurs effets dans la mesure de leur efficacité à chacun de leurs résultats. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris noire de six femelles C57 de 22 semaines, rasez les cheveux de l’arrière-plan droit et fixez l’animal dans la position dorsale à cubitus sur un coussin chauffant. Placez l’animal sous un microscope disséquant.Et utilisez une lame de scalpel chirurgicale numé

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La procédure chirurgicale pour l'induction d'une ischémie unilatérale des membres postérieurs est démontré, avec confirmation d'ischémie par imagerie laser Doppler perfusion.

Modèle murin d&#39;ischémie des membres postérieurs

Adulte normale vascularisé tissus de mammifères qui manque de l'angiogenèse physiologique et qui n'a pas été exposé à une intervention chirurgicale est utilisée pour étudier: (i) l'initiation et le développement de l'angiogenèse après administration intrapéritonéale d'agents de test, et (ii) la modification de l'angiogenèse après l'administration systémique de certains agents de test.

Assay Rat angiogenèse Mésentère

Commençons par un rat soumis à une occlusion de l’artère cérébrale moyenne, une intervention chirurgicale qui bloque temporairement le flux sanguin vers le tissu cérébral.Cela induit un accident vasculaire cérébral ischémique, entraînant des lésions des tissus cérébraux.Ensuite, retirez le blocage pour rétablir la circulation sanguine.Sélectionnez des rats qui présentent des déficits neurologiques pour assurer la pertinence de l’étude.Ensuite, administrez le médicament testé au groupe...

Évaluation des effets de l’angiogenèse d’un médicament à l’essai dans un modèle d’AVC ischémique chez le rat

Nous démontrons un modèle de ligature artérielle roman dans le muscle spinotrapezius murin, y compris une procédure étape par étape et une description de l'instrumentation nécessaire. Nous décrivons la chirurgie et la mesure des résultats pertinents relatifs au remodelage du réseau vasculaire et une vasodilatation fonctionnelle en utilisant la microscopie confocale et intravitale.

Modèle murin Spinotrapezius pour évaluer l&#39;impact de la ligature artériolaire sur la fonction microvasculaire et Rénovation

Osmotique Drug Delivery à hindlimbs ischémiques et la perfusion de la vascularisation avec Microfil pour Micro-en tomodensitométrie

Nous décrivons la méthode des cellules souches de programmation pour surexprimer des facteurs thérapeutiques pour l'angiogenèse en utilisant des nanoparticules polymériques biodégradables. Les procédés décrits comprennent la synthèse du polymère, la transfection de cellules souches du tissu adipeux in vitro, et de valider l'efficacité des cellules souches programmées pour favoriser l'angiogenèse dans un modèle d'ischémie des membres postérieurs de souris.

Les cellules souches de programmation pour angiogenèse thérapeutique utilisant polymère biodégradable nanoparticules

L’induction chirurgicale de l’ischémie des membres postérieurs chez la souris est utile pour examiner l’angiogenèse, mais celle-ci est compromise chez certaines souches de souris consanguines qui présentent une nécrose tissulaire marquée induite par l’ischémie. Des méthodes sont décrites pour induire une ischémie subaiguë des membres à l’aide de constricteurs améroïdes pour contourner ce problème par l’induction d’une occlusion artérielle progressive.

Méthodes de aiguë et subaiguë murin Ischémie membres postérieurs

Les monocytes sont des médiateurs importants d’arteriogenesis dans le contexte de la maladie artérielle périphérique. En utilisant une matrice de type membrane basale et la microscopie intravitale, ce protocole étudie monocyte autoguidage et axés sur la tumeur de l’angiogenèse après injection de monocytes dans le modèle murin de la ligature de l’artère fémorale.

Microscopie intravitale de Monocyte Homing et axés sur la tumeur de l’angiogenèse dans un modèle murin de la maladie artérielle périphérique

Nous décrivons une intervention chirurgicale utilisée pour induire une ischémie périphérique chez les lapins atteints d’hyperlipidémie et de diabète. Cette chirurgie agit comme un modèle préclinique pour les conditions rencontrées dans la maladie des artères périphériques chez les patients. L’angiographie est également décrite comme un moyen de mesurer l’étendue de l’ischémie introduite et la récupération de la perfusion.

Modèle préclinique d’ischémie des membres postérieurs chez les lapins diabétiques

Cet article démontre une approche chirurgicale efficace pour établir une ischémie aiguë chez la souris avec une petite incision. Cette approche peut être appliquée par la plupart des groupes de recherche sans aucune mise à niveau du laboratoire.

Un modèle chirurgical modifié de l’ischémie du membre postérieur chez des souris ApoE-/- utilisant une incision miniature

Le présent protocole décrit un modèle unique et cliniquement pertinent de maladie artérielle périphérique qui combine l’électrocoagulation de l’artère fémorale et des veines avec l’administration d’un inhibiteur de l’oxyde nitrique synthase pour induire la gangrène des membres postérieurs chez les souris FVB. La perfusion intracardiaque DiI est ensuite utilisée pour l’imagerie tridimensionnelle à haute résolution du système vasculaire du coussinet plantaire.

Imagerie tridimensionnelle haute résolution de la vascularisation du repose-pieds dans un modèle murin de gangrène postérieure

Découvrez l'évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murin d'ischémie du membre postérieur. Cette méthode permet d'analyser les effets fonctionnels, histologiques et moléculaires des agents angiogéniques.

Évaluation de l'angiogenèse thérapeutique dans un modèle murine de l'ischémie hindlimb

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