Name: Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez un protocole pour évaluer la stabilité de stockage des vésicules extracellulaires en utilisant la glucuronidase comme marqueur exogène et l'AF4 pour la purification. Cette méthode permet de comparer la conservation des vésicules issues de différentes cellules parentes.

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Le programme de recherche Junior NanoMatFutur du ministère fédéral de l’éducation et de la recherche, Allemagne (Grant number 13XP5029A) a appuyé ce travail. Maximilian Richter a été soutenu par la Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fondation allemande des bourses d’études académiques) par le biais d’une bourse de doctorat.

1. culture cellulaire et production de milieu cellulaire
<ol><li>En général, cultiver des cellules dans les conditions individuelles requises pour la lignée cellulaire respective.</li>
	<li>Cultiver les cellules pendant 24-72 h dans des conditions exemptes de sérum ou dans un milieu contenant du sérum bovin foetal (FBS) appauvri en EV. Remarque: si le FBS appauvri en EV est utilisé, utiliser une méthode éprouvée pour épuiser efficacement le sérum, afin de prévenir la contamination par des EVs de bovins dérivés du sérum26.</li>
	<li>Recueillir le support des flacons. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min pour pellets les cellules. Recueillir soigneusement le milieu cellulaire (CCM), sans déranger les cellules granulées. De préférence, utilisez le CCM directement ou rangez-le une nuit à 4 ° c. Remarque: il est toujours préférable d’utiliser des CCM fraîchement produites. Si le stockage pour des périodes plus longues ne peut pas être contourné, tous les paramètres pertinents doivent être consignés conformément aux directives MISEV201826, et les biais potentiels des résultats obtenus doivent être pris en considération.</li>
	<li>Exemple de protocole pour HUVECs<ol>
<li>Cultiver des cellules HUVEC pour 120 h dans le milieu EGM-2 contenant FBS et d’autres suppléments.</li>
		<li>Cultiver les cellules HUVEC pour 48 h dans le milieu de base EBM-2 exempt de suppléments supplémentaires.</li>
		<li>Prélever le support des flacons et effectuer l’étape de centrifugation comme indiqué ci-dessus (étape 1,3). En général, utilisez 100 mL de milieu pour une isolation EV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ultracentrifugation de CCM
<ol><li>Immédiatement avant l’ultracentrifugation (UC), Centrifugez le CCM pendant 15 min à 3 000 x g et 4 ° c pour éliminer les débris cellulaires et les grands agglomérats.</li>
	<li>Transférez délicatement le surnageant aux tubes UC. Si vous utilisez un rotor à angle fixe, marquez l’orientation des tubes dans la centrifugeuse pour faciliter la récupération du pellet EV après l’UC. Centrifuger pendant 2 h à 120 000 x g, avec un facteur k de 259,4.</li>
	<li>Après UC, jetez soigneusement le surnageant à l’aide d’un pipetage sérologique, pour éviter la perturbation des EVs pelletés. Remarque: le culot peut être invisible.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) filtrée à 0,2 μm dans le premier tube et utiliser le PBS et le surnageant résiduel pour Resuspendre le culot en pipetant de haut en bas. Transférer la suspension EV résultante au tube suivant de l’échantillon respectif et l’utiliser pour la remise en suspension. Procédez de cette façon pour resuspendre tous les véhicules électriques de l’échantillon dans un volume final d’environ 300-350 μL.</li>
	<li>Après la remise en suspension, confirmer la présence de particules par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Utilisez les paramètres optimisés pour le type EV donné, tels que les paramètres ci-dessous (étape 2.5.1). NOTE: les documents de Gardiner et coll.27 et vestad et al.28 contiennent des informations précieuses sur la façon d’optimiser les paramètres de mesure des véhicules électriques.<ol>
<li>Pour reproduire les résultats décrits ci-dessous, utilisez des instruments (par exemple, NanoSight LM14) équipés d’un laser vert. Enregistrez trois vidéos de 30 s avec un gain d’écran de 1,0 et un niveau de caméra de 13. Pour l’analyse, utilisez un gain d’écran de 1,0 et un seuil de détection de 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilisez le pellet immédiatement, si possible; Sinon, rangez-le à 4 ° c pendant la nuit.</li>
</ol>3. encapsulation de glucuronidase en EVs
<ol><li>À la granule resuspendue, ajouter la bêta-glucuronidase (10 mg/mL dans le PBS) à une concentration finale de 1,5 mg/mL et de saponine (10 mg/mL en H2O) à une concentration finale de 0,1 mg/ml. Mélangez bien par vortex pour 3 s.</li>
	<li>Incuber pendant 10 min à température ambiante avec un mélange interadmis en faisant doucement clignoter le tube. Après incubation, purifier directement par chromatographie d’exclusion de la taille (SEC) (voir rubrique 5). Remarque: ne pas recongeler les échantillons de glucuronidase une fois décongelés, afin de prévenir la dégradation des enzymes due au gel.</li>
</ol>4. production de liposomes
<ol><li>Pour préparer des liposomes pour comparaison avec EVs, dissoudre la 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DMPC) et la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) dans une ration molaire 2:3 dans le chloroforme jusqu’à une concentration finale de 5 mm. Préparer des aliquotes de 1 mL dans des flacons de chromatographie liquide haute performance (HPLC) et les laisser sécher pendant la nuit pour former un film lipidique. ATTENTION: le chloroforme est toxique et soupçonné d’être cancéreux. Prenez les précautions appropriées lors de la manipulation.</li>
	<li>Réhydrater le film lipidique avec 1 mL de PBS contenant 1,5 mg/mL de glucuronidase. Chauffer à 42 ° c et faire tourbillonner pendant 1 min. chauffer l’ensemble de l’extrudeuse à 42 ° c et extrudeuse la suspension lipidique 11x à travers une membrane en polycarbonate de 200 nm. Purifier directement par SEC (voir rubrique 5).</li>
</ol>5. purification par SEC
<ol><li>Préparez la colonne SEC à l’aide du protocole suivant.<ol>
<li>N’utilisez que de l’eau fraîche purifiée et des tampons fraîchement préparés. Filtrer tous les tampons à travers un filtre à membrane de 0,2 μm et les dégazer pour empêcher la formation de bulles d’air dans la colonne.</li>
		<li>Pour la préparation d’une colonne SEC, utiliser la matrice de filtration à base de gel d’d’agarose (par exemple, Sepharose CL-2b) ou un autre milieu SEC approprié pour séparer les EVs et les liposomes des impuretés protéiques et de l’excès d’enzyme. Tout d’abord, retirez la solution de 20% EtOH le milieu est stocké dans, pour empêcher la formation de bulles d’air dans la colonne. À cette fin, Centrifugez le milieu SEC à 3 000 x g pendant 10 min, enlevez l’EtOH et remplacez-le par de l’eau dégazée.</li>
		<li>Remplissez une colonne de verre (avec un diamètre intérieur de 10 mm) avec le milieu SEC à la marque de 15 mL. Remarque: les volumes diffèrent pour les colonnes de dimensions différentes. Assurez-vous de laisser le gel s’arranger complètement.</li>
		<li>Avant une course, Equilibrer la colonne avec au moins deux volumes de colonne de PBS. Pour stocker la colonne, lavez-la d’abord avec une colonne de volume d’eau, suivie d’au moins deux volumes de colonne de 20% EtOH. Après le stockage, laver la colonne d’abord avec un volume d’eau de colonne avant d’équilibrer avec PBS.</li>
		<li>Utiliser jusqu’à 400 μL de suspension EV ou Liposome en une seule séparation. Prélever des fractions de 1 mL. Après la SEC, stockez les EVs purifiés (voir rubrique 7) ou les soumettre à un dosage de glucuronidase (voir rubrique 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirmer la séparation des EVs et des liposomes des protéines contaminantes et de la glucuronidase libre. À cette fin, corréler les concentrations de particules des fractions recueillies avec la concentration protéique et l’activité de la glucuronidase.<ol>
<li>Evaluer la concentration de particules par NTA (voir 2,5)</li>
		<li>Évaluez la teneur en protéines par dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) ou un autre dosage approprié de quantification des protéines. Effectuer le dosage selon le protocole du fabricant.</li>
		<li>Évaluer l’activité de la glucuronidase par dosage de la glucuronidase (voir rubrique 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si vous le souhaitez, évaluez la morphologie des EV par microscopie électronique à transmission (TEM) et microscopie électronique à balayage (SEM).<ol>
<li>Pour la préparation des échantillons TEM, ajouter 10 μL de suspension EV à une grille TEM, incuber pendant 10 min, puis éponger tout excès de liquide à l’aide d’un papier filtre. Effectuer la fixation pendant 10 min avec 10 μL de 4% de paraformaldéhyde et éponger tout excès. Laver 3x avec de l’eau. Tacher les vésicules par 20 s d’incubation avec 30 μL d’hydrate d’acide Phosphor-tungstique à 1%. Après avoir effacé l’excès, sécher les vésicules pendant la nuit. Visualisez par TEM. ATTENTION: l’acide phospho-tungstique est très caustique; ainsi, protéger la peau et les yeux.</li>
		<li>Pour le SEM, fixez les échantillons TEM préalablement préparés sur des disques de carbone et pulvérisez-les avec une couche d’or épaisse de 50 nm. Visualisez par SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. dosage de la glucuronidase
<ol><li>Pour permettre une comparaison entre les différents échantillons et les conditions de stockage par corrélation entre le nombre de particules et l’activité enzymatique, mesurez d’abord la concentration particulaire de l’échantillon par NTA (Voir l’étape 2,5).</li>
	<li>Préparer une solution de travail de la fluorescéine di-β-D-glucuronide en ajoutant 1 μL du composé (10 mg/mL en H2O) à 199 ΜL de PBS. Ajouter 25 μL de cette solution à 125 μL d’EVs purifiés pour obtenir une concentration finale de 8,3 μg/mL. Pipetonner l’échantillon dans une plaque noire 96-well. Mesurer le point de temps 0 h avec un lecteur de plaque, en utilisant 480 nm comme excitation et 516 nm comme longueur d’onde d’émission.</li>
	<li>Recouvrir fermement la plaque (par exemple, avec une feuille de plastique transparente utilisée pour les plaques PCR) pour minimiser l’évaporation et incuber dans l’obscurité pendant 18 h à 37 ° c. Mesurez la production de fluorescéine à l’aide des paramètres du lecteur de plaque énumérés à l’étape 6,2.</li>
</ol>7. stockage des EVs et des liposomes
Remarque: pour tous les besoins de stockage, il est conseillé d’utiliser des tubes à faible liaison pour réduire la perte de EV due à l’adsorption.
<ol><li>Suivez les paramètres de cette section pour reproduire les résultats représentatifs donnés ci-dessous. Utiliser des échantillons constitués de 400 μL de suspension EV.<ol>
<li>Conserver à 4 ° c ou-80 ° c ou passer aux étapes énumérées ci-dessous.</li>
		<li>Lyophiliser les véhicules électriques.<ol>
<li>Ajouter le tréhalose (40 mg/mL en H2O) jusqu’à une concentration finale de 4 mg/ml pour les EVS purifiés. Congeler les échantillons à-80 ° c pendant au moins 1 h.</li>
			<li>Lyophiliser les échantillons en utilisant les paramètres suivants. Pour le séchage principal, réglez la température de l’étagère à 15 ° c et la pression à 0,180 mbar et laissez les échantillons sécher pendant 46 h. Pour le séchage final, régler la température de l’étagère à 25 ° c et la pression à 0,0035 mbar et laisser les échantillons sécher pendant 2 h. conserver les échantillons lyophilisés à 4 ° c.</li>
			<li>Pour réhydrater les échantillons, ajouter H2O, égal à la quantité de suspension ev présente au début (typiquement, 400 μl). Ne pas utiliser de tampon pour la réhydratation.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. analyse après stockage
<ol><li>Pour évaluer l’activité enzymatique, retirez d’abord la glucuronidase libre, qui peut avoir fui les EVs pendant le stockage. Réaliser ceci par une étape supplémentaire de purification qui est effectuée soit par SEC (voir étape 5) ou par fractionnement de flux de champ asymétrique (AF4) (Voir l’étape 8.1.2). Remarque: Veuillez noter que les deux méthodes conduisent à une dilution de l’échantillon EV; ainsi, utiliser suffisamment de concentrations EV avant le stockage pour éviter de se déplacer en deçà de la limite de quantification NTA. Attendez-vous à une dilution 1:10 des particules en raison de SEC ou AF4.<ol>
<li>Pour la purification SEC, suivre le protocole décrit ci-dessus (voir section 5).</li>
		<li>Effectuer la purification AF4.<ol>
<li>Installer l’instrument à l’aide d’un petit canal avec une entretoise de 350 μm et une membrane de cellulose de 30 kD à coupure de poids moléculaire. Placez un filtre de taille de pores de 0,1 μm entre la pompe HPLC et le canal AF4. Utilisez du PBS filtré à 0,1 μM fraîchement préparé comme phase mobile pour réduire la charge de particules et le bruit dans les détecteurs de diffusion de la lumière.</li>
			<li>Détectez les protéines à l’aide d’un détecteur UV réglé sur 280 nm. Pour détecter les particules, utilisez la diffusion de la lumière multiangulaire avec le laser réglé à 658 nm.</li>
			<li>Utilisez la méthode d’exécution suivante. Pré-Focus pendant 1 min avec un flux de mise au point de 1 mL/min; Ensuite, injecter 300 μL de l’échantillon à un taux de 0,2 mL/min et maintenir le flux de mise au point pendant 10 min. Après l’injection, éluer l’échantillon à 1 ml/min pendant l’application d’un flux croisé qui diminue de 2 ml/min à 0,1 ml/min au cours de 8 min. éluer pour une autre 10 min sans écoulement croisé. Prélever des fractions de 1 mL, en commençant après 12,5 min et en continuant jusqu’à 27 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Effectuer le dosage de la glucuronidase comme décrit ci-dessus (voir rubrique 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour évaluer la taille et la concentration, utilisez le NTA comme décrit ci-dessus (Voir l’étape 2,5).</li>
	<li>Éventuellement, exécutez TEM et SEM pour évaluer la morphologie des EVs après le stockage (voir 5,3).</li>
</ol>

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<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole complet pour étudier la stabilité des véhicules électriques dans des conditions de stockage différentes. Avec la combinaison de glucuronidase encapsulée comme lecture fonctionnelle et l’évaluation des paramètres physicochimiques des EVs, le protocole permet une évaluation simple de la stabilité du stockage des véhicules électriques et la comparaison des EVs de différentes cellules Lignes. SEM et TEM en tant que méthodes complémentaires permettent un aperçu des changements d...

Les EVs sont des nanoparticules liées à la membrane produites par presque tous les types de cellules. Pour les cellules de mammifères, EVS peut être subdivisé en deux groupes principaux avec des voies de production distinctes1,2. Les vésicules membranaires, d’une taille allant d’environ 100 à 1000 nm, sont produites par le bourgeonnement direct de la membrane cellulaire. Les exosomes, de taille 30-200 nm, sont dérivés de corps multivésiculaires formés par le bourgeonnement vers l’intérieur en endosomes qui fusionnent ensuite avec la membrane cellulaire pour libérer plusieurs exosomes à la fois. La fonction principale de ces vésicules est le transport de l’information entre les cellules3. À cette fin, les cargaisons tels que l’ARN, l’ADN et les protéines sont activement triés en eux. EVs peut transmettre une variété d’effets sur leurs cibles, avec des implications pour la santé et l’état de la maladie. D’un côté, ils médient des effets positifs tels que la régénération tissulaire, la présentation de l’antigène ou les effets antibiotiques, ce qui en fait des cibles propices à leur développement en tant que thérapeutique4,5. De l’autre côté, EVs peut favoriser la vascularisation tumorale6, induire des effets de spectateur dans les réponses de stress7, et pourrait jouer un rôle dans les maladies auto-immunes8 et les maladies inflammatoires9. Ainsi, ils pourraient être un élément clé pour une meilleure compréhension de nombreux effets pathologiques. Cependant, la présence de EVS altérés dans les maladies multiples, comme le cancer10,11,12 et les troubles cardiovasculaires13, et leur accessibilité facile dans le sang et l’urine les rend idéales Biomarqueurs. Enfin, leur bonne biocompatibilité14 et leur capacité de ciblage intrinsèque rendent les EVS aussi intéressants pour la livraison de médicaments15. Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole pour l’évaluation de la stabilité de stockage des EVs dérivées de cellules de mammifères, une propriété importante qui est encore peu étudiée.
Pour le développement clinique des EVs, il y a encore beaucoup d’obstacles à surmonter16, y compris l’évaluation de leurs effets thérapeutiques, la production, la purification, et le stockage17. Alors que-80 ° c est largement considéré comme la norme d’or pour le stockage EV18, les congélateurs requis sont coûteux, et le maintien de la chaîne de froid requis de la production au patient peut être difficile. De plus, certains rapports indiquent que le stockage à-80 ° c ne préserve pas encore de manière optimale EVS et induit une perte dans la fonctionnalité ev19,20. D’autres méthodes, comme le lyophilisation21,22 ou le séchage par pulvérisation23, ont été proposées comme alternatives potentielles au stockage congelé des véhicules électriques.
La meilleure façon d’évaluer la stabilité du stockage serait de tester les EVs dans les essais fonctionnels ou par l’évaluation d’un marqueur spécifique, par exemple, leur activité antibactérienne19. Ceci est possible lorsque l’effet désiré des vésicules est connu et quand un groupe distinct d’EVs doit être étudié. Si des EVs provenant de différentes sources cellulaires doivent être comparées (p. ex. pour l’encapsulation de médicaments) ou s’il n’y a pas de lecture fonctionnelle connue, il n’est plus possible d’évaluer les changements dus au stockage de manière directe.
D’autre part, l’évaluation simple des changements dans leurs paramètres physicochimiques, tels que la taille, la récupération des particules et la concentration des protéines, ne prédit pas toujours les changements dans l’activité EV, comme cela a été démontré dans un brevet récent20.
Ici, nous fournissons un protocole facilement applicable pour mesurer la stabilité de stockage des EVs en évaluant leurs paramètres physicochimiques combinés avec l’activité d’une enzyme bêta-glucuronidase encapsulée comme substitut pour la cargaison du EVs. Le chargement de l’enzyme se fait par incubation de saponine, une méthode légère établie avec des EVS provenant de différentes sources21,24,25. La saponine forme des pores transitoires dans la membrane EV, ce qui permet l’absorption enzymatique dans la vésicule. Comme les enzymes sont sujettes à perdre leur activité si elles sont soumises à des conditions de stockage défavorables, elles constituent un substitut idéal pour l’évaluation de la préservation des cargaisons fonctionnelles des véhicules électriques.
Nous avons démontré que l’application de ce protocole à des EVs dérivées de cellules souches métréchymateuses humaines (MSCs), de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) et d’adénocarcinome des cellules épithéliales alvéolaires (A549), en effet, entraîne de grandes différences dans stabilité de stockage entre les différentes lignées cellulaires, qui doivent être prises en considération lors du choix de la source EV21.

<table><tbody><tr><td>1,2 dimyristoyl-sn glycéro-3-phospho-choline (DMPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2663-25MG</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4329-25MG</td><td></td></tr><tr><td>225 cm&sup2 ; flacons de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>431082</td><td>Utilisé avec 25 ml de milieu</td></tr><tr><td>30 kDa membrane cellulosique régénérée</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td>1854</td><td></td></tr><tr><td>350 et micro ; m spacer</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collecteur de fractions automatisé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-glucuronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7646-100KU</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher scientific</td><td>C/4966/17</td><td></td></tr><tr><td>Four à colonne</td><td>Hitachi High-Technologies Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531-10G</td><td></td></tr><tr><td>DAWN HELEOS II, Détecteur de diffusion de lumière multi-angle</td><td>&nbsp ; Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore Filtre à membrane, PVDF,&nbsp ; 0,1&nbsp ; et micro ; m, 47&nbsp ; mm</td><td>Merck</td><td>VVLP04700</td><td>Utilisé pour la préparation de tampons pour AF4</td></tr><tr><td>EBM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3156</td><td>Milieu basal de croissance des cellules endothéliales, utilisé pour la culture sérique libre de cellules HUVEC</td></tr><tr><td>Eclipse dualtec</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>CC-3162</td><td>Milieu de croissance cellulaire endothéliale, utilisé pour la culture normale de cellules HUVEC</td></tr><tr><td>ELISA Plate Sealers</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>utilisé pour l’étanchéité de plaques à 96 puits pour le dosage de la glucuronidase</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher scientific</td><td>E/0665DF/17</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extrudeur avec support/bloc chauffant</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Support de filtre</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014-1EA</td><td>utilisé pour la préparation des liposomes</td></tr><tr><td>Fluorescéine di-&beta ;-D-glucoronide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F2915</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS-tablets+CA10 :F36</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Universal 320 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Utilisé pour la granulation de cellules à 300 g</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 420 R</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co.KG</td><td></td><td>Utilisé pour la granulation de débris plus gros à 3000 g</td></tr><tr><td>de cellules HUVEC</td><td>Lonza Verviers, S.p.r.</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>Kimble&nbsp ; FlexColumn 1X30CM</td><td>Kimble</td><td>420401-1030</td><td></td></tr><tr><td>Lyophiliseur ALPHA 2-4 LSC</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse Tubes, Polypropylène</td><td>VWR international</td><td>525-0255</td><td>les tubes utilisés pour la manipulation de tous les VE, se sont avérés plus favorables que les produits comparables d’autres fournisseurs en ce qui concerne la récupération des particules</td></tr><tr><td>Nanosight LM14 équipé d’un laser vert</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight-software version 3.1</td><td>Malvern Pananalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleopore 200 nm track-etch membranes polycarbonate</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>110406</td><td>utilisé pour la préparation des liposomes</td></tr><tr><td>PEEK Porte-filtre en ligne</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrate d’acide phosphotungstique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25G</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en polycarbonate pour l’ultracentrifugation</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>QuantiPro BCA Assay Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>QPBCA-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à balayage Zeiss EVO HD 15</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sepharose Cl-2b</td><td>GE Healthcare</td><td>17014001</td><td></td></tr><tr><td>Cuivre MEB grilles avec film carbone</td><td>Plano</td><td>S160-4</td><td></td></tr><tr><td>Petit canal AF4</td><td>Wyatt Technology Europe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sputter-coater Q150R ES</td><td>Quorum Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopie électronique à transmission JEOL JEM 2011</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti rotor d’ultracentrifugation</td><td>Beckman Coulter</td><td>339160</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Passeur d’échantillons Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Pompe isocratique Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 Dégazeur sous vide en ligne Dionex</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Détecteur UV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman 0.2 et micro ; Filtre en cellulose mixte de taille de pores</td><td>Whatman/GE Healthcare</td><td>10401712</td><td>Utilisé pour la filtration de tous les tampons utilisés avec les VE et en SEC</td></tr></tbody></table>

Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des cibles prometteuses dans la recherche actuelle, à utiliser comme médicaments, porteurs de médicaments et biomarqueurs. Pour leur développement clinique, non seulement leur activité pharmaceutique est importante, mais aussi leur production doit être évaluée. Dans ce contexte, la recherche se concentre sur l’isolement des véhicules électriques, leur caractérisation et leur stockage. Le présent manuscrit vise à fournir une procédure facile pour l’évaluation de l’effet des différentes conditions de stockage sur les véhicules électriques, sans manipulation génétique ou essais fonctionnels spécifiques. Cela permet d’obtenir rapidement une première impression de la stabilité des véhicules électriques sous une condition de stockage donnée, et les EVs dérivées de différentes sources de cellules peuvent être comparées facilement. La mesure de stabilité est basée sur les paramètres physicochimiques des EVs (taille, concentration des particules et morphologie) et la préservation de l’activité de leur cargaison. Ce dernier est évalué par l’encapsulation médiée par la saponine de l’enzyme bêta-glucuronidase dans les EVs. La glucuronidase agit comme un substitut et permet une quantification facile par le clivage d’une molécule de reporter fluorescente. Le présent protocole pourrait être un outil pour les chercheurs dans la recherche de conditions de stockage qui conservent de manière optimale les propriétés EV pour faire progresser la recherche EV vers l’application clinique.

La figure 1 affiche les caractéristiques de stockage des véhicules électriques isolés des HUVECs. Les EVs ont été isolés par UC, la glucuronidase a été encapsulée et après la SEC, les EVs purifiées ont été évaluées pour leurs propriétés physicochimiques par NTA. Un échantillon des vésicules a ensuite été soumis à la purification AF4 et l’activité de la glucuronidase a été mesurée.
Les vésicules ont ensuite été entreposées pour 7 d à 4 ° c ou-80 ° c et à 4 ° c sous forme lyophi...

Nous présentons ici un protocole facilement applicable pour évaluer la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires, un groupe de nanoparticules naturelles produites par les cellules. Les vésicules sont chargées de glucuronidase en tant qu’enzyme modèle et stockées dans des conditions différentes. Après le stockage, leurs paramètres physicochimiques et l’activité de l’enzyme encapsulée sont évalués.

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

La stabilité de stockage des vésicules cellulaires supplémentaires est un paramètre important pour leur utilisation thérapeutique prospective. Notre protocole fournit un outil facilement applicable pour évaluer comment le stockage a des effets sur les vésicules. Le principal avantage de notre technique est qu’en introduisant la glucuronidase comme marqueur exogène, les vésicules extracellulaires dérivées de différentes cellules mères sont facilement comparées en ce qui concerne leur storabilité.La fractionnement asymétrique du débit du champ d’écoulement, ou AF4, est une alternative douce à la purification de la chromatographie d’exclusion de taille pour les composés très sensibles. Parce que les composés rencontrent moins de stress dans le canal. Comme la glucuronidase est une enzyme sensible, la qualité de la réside bénéficie d’une planification approfondie et la réalisation des étapes pour la purification et l’analyse dos à dos.Après avoir cultivé la ligne d’intérêt cellulaire selon les conditions standard pour ces cellules, remplacer le supernatant par du sérum libre ou extra cellulaire vésicule épuisé moyen et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Il s'agit d'un protocole visant à isoler les vésicules extracellulaires tissulaires (VE) du foie. Le protocole décrit un processus en deux étapes impliquant la perfusion de collagène suivie de l'ultracentrifugation différentielle pour isoler les véhicules électriques du tissu hépatique.

Isolement des vésicules extracellulaires de tissu du foie

Le protocole décrit une méthode reproductible, conçue pour être utilisé avec les surnageants de culture de cellules pour détecter des épitopes de surface sur petites vésicules extracellulaires (EV). Il utilise l’immunoprécipitation de EV spécifique à l’aide de billes couplées avec des anticorps qui reconnaissent l’antigène de surface CD9, CD63 et CD81. La méthode est optimisée pour l’analyse en cytométrie en flux en aval.

Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Le présent rapport souligne les exigences chronologiques pour l’isolement extracellulaire de vésicule (EV) des microglies ou des macrophages de sang. Les véhicules électriques dérivés de microglies ont été évalués en tant que régulateurs de la excroissance neurite tandis que les véhicules électriques dérivés du macrophage sanguin ont été étudiés dans le contrôle de l’invasion de cellules de glioma C6 dans les essais in vitro. L’objectif est de mieux comprendre ces fonctions EV en tant que...

Caractérisation des vésicules extracellulaires dérivées d’une cellule immunitaire et étude de l’impact fonctionnel sur l’environnement cellulaire

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les vésicules extracellulaires dérivées du lysat plaquettaire afin de surveiller leur migration et leur absorption dans les explants cartilagineux utilisés comme modèle pour l’arthrose.

Marquage des vésicules extracellulaires pour surveiller la migration et l’absorption dans les explants cartilagineux

Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement, la concentration et la caractérisation des vésicules extracellulaires provenant de cultures cyanobactériennes. Les approches pour purifier les vésicules de cultures à différentes échelles, les compromis entre les méthodologies et les considérations pour travailler avec des échantillons de terrain sont également discutés.

Isolement et caractérisation des vésicules extracellulaires cyanobactériennes

Nous présentons un protocole pour l’isolement et la congélation-fracturation des vésicules extracellulaires (VE) provenant de cellules urothéliales cancéreuses. La technique de congélation-rupture a révélé le diamètre et la forme des véhicules électriques et, en tant que caractéristique unique, l’organisation interne des membranes des véhicules électriques. Ceux-ci sont d’une importance capitale pour comprendre comment les véhicules électriques interagissent avec les membranes réceptrices.

Microscopie électronique par congélation-fracture pour l’analyse des vésicules extracellulaires

Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.

Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

Ce protocole fournit une description détaillée du tri des vésicules extracellulaires (VE) libérées par les cellules stromales mésenchymateuses. Il se concentre en particulier sur le réglage de l’instrument et l’optimisation des conditions de tri. L’objectif est de trier les vésicules extracellulaires tout en préservant leurs caractéristiques.

Mise en place d’un tri réussi pour l’isolement des vésicules extracellulaires

Ici, nous décrivons les conditions de culture in vitro , l’isolement et la génération accrue de vésicules extracellulaires (VE) à partir d’Echinococcus granulosus. Les petits VE ont été caractérisés par une diffusion dynamique de la lumière et une microscopie électronique à transmission. L’absorption par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse et leur modulation phénotypique ont été étudiées à l’aide de la microscopie confocale et de la cytométrie en flux.

Isolement et absorption par des cellules dendritiques de petites vésicules extracellulaires d’Echinococcus granulosus

Ici, nous démontrons la méthode de caractérisation des vésicules extracellulaires (VE) collectées à partir de fluides biologiques, tels que les larmes et la salive, de sujets humains. Le scanner utilisé dans cette méthode est capable de détecter le phénotype, la taille et le nombre total de particules des VE à partir de 1 μL de l’échantillon.

Caractérisation des vésicules extracellulaires à partir de fluides biologiques

Découvrez un protocole pour évaluer la stabilité de stockage des vésicules extracellulaires en utilisant la glucuronidase comme marqueur exogène et l'AF4 pour la purification. Cette méthode permet de comparer la conservation des vésicules issues de différentes cellules parentes.

Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

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