Basé sur la spectrométrie de masse protéomique des Analyses à l’aide de la base de données OpenProt de dévoiler de nouvelles protéines traduit de cadres ouverts de lecture Non canoniques
11 avril 2019
OpenProt est une base de données librement accessible qui applique un modèle de polycistronique du génome des eucaryotes. Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation des bases de données de OpenProt lors de l’interrogation des ensembles de données de spectrométrie de masse. À l’aide de OpenProt base de données pour l’analyse des expériences de la protéomique permet la découverte du roman et protéines indétectables.
OpenProt est la première base de données qui permet une annotation polysystronic des génomes eucaryotes, reconnaît le potentiel de codage des proto-gènes et permet la découverte de protéines auparavant indétectables. Nous avons conçu ce protocole afin qu’il soit accessible à tous les utilisateurs sans nécessiter de compétences bioinformatiques étendues Il place essentiellement les découvertes protéomiques à la portée de tous. Pour comprendre et relever les défis d’aujourd’hui en médecine, nous devons bien comprendre le paysage protéomique et tous les acteurs et leur dynamique.
OpenProt offre cette possibilité. Bien qu’ici, OpenProt est utilisé pour l’analyse des expériences patonomiques, il peut également être utilisé avec d’autres systèmes car il fournit simplement une définition plus claire du protéome. Commencez par ouvrir le site OpenProt et en utilisant le lien à partir du menu de la page supérieure pour ouvrir la page téléchargements.
Cliquez sur les espèces d’intérêt en fonction des données expérimentales des analyses et du type de protéine souhaité. Cliquez sur AllProts, Isoforms et RefProds pour générer des fichiers contenant tous les types de protéines connus et nouveaux présents dans la base de données OpenProt et si disponible, cliquez sur l’annotation à partir de laquelle les séquences protéiques sont tirées. Cliquez sur le niveau de preuves à l’appui nécessaires à la prise en compte des protéines selon l’objectif de recherche.
Cliquez ensuite, tous les fichiers prévus pour générer des fichiers contenant toutes les prédictions OpenProt et cliquez sur le format de fichier souhaité pour télécharger. Pour les anayses protéomiques, sélectionnez le fichier protéique FASTA. Le fichier readme contiendra toutes les informations nécessaires sur le format du fichier.
Pour le traitement des bases de données, connectez-vous à une instance d’outil protéomique appropriée et créez un nouvel historique. Pour importer la base de données OpenProt téléchargée, cliquez sur Télécharger. Pour saisir le flux de travail de gestion de la base de données, rendez-vous sur la page de flux de travail, cliquez à nouveau sur Télécharger et cliquez sur exécuter le flux de travail.
Sélectionnez ensuite la base de données OpenProt importée comme entrée et renommez le fichier Fasta obtenu en quelque chose de significatif. La base de données est prête à être utilisée pour des analyses protéomiques. Pour la préparation de fichiers de spectrométrie de masse, ouvrez l’outil de conversion MS librement disponible à partir de la suite assistant proteo et téléchargez le fichier de données à analyser.
Sélectionnez l’annuaire pour la sortie et définissez le format de fichier désiré pour mzML, puis utilisez l’algorithme basé sur l’onde sur les niveaux de spectrométrie de masse un et deux pour sélectionner un filtre de sélection de pointe et commencer la conversion. Pour la quantification des protéines, créez une nouvelle histoire et faites glisser et déposez la base de données précédemment créée dans la nouvelle histoire. Cliquez sur Télécharger pour importer le fichier de données mzML transformé.
Ouvrez la page workflow, cliquez à nouveau sur Télécharger pour importer le flux de travail souhaité, et sélectionnez exécuter le flux de travail pour examiner les différents paramètres. Sélectionnez le fichier de données mzML importé et entrez la base de données précédemment créée comme fichier Fasta de base de données. Depuis le flux de travail utilise le X!
Moteur de recherche tandem, cliquez sur Télécharger pour importer le X! Fichier de configuration par défaut tandem. Pour tenir compte de l’augmentation substantielle de la taille lors de l’utilisation de l’ensemble de l’OpenProt databse utiliser un taux rigoureux de fausse découverte.
Pour le contrôle de la qualité, exécutez l’outil d’information de fichier sur la sortie du filtre ID pour fournir des mesures communes des performances, telles que le nombre d’allumettes de spectre peptidique ou le nombre de peptides et de protéines identifiés. Pour l’exploration de bases de données OpenProt, retournez sur le site OpenProt et ouvrez la page de recherche. Cliquez sur les espèces d’intérêt pour lesquelles la protéine a été identifiée et entrez le numéro d’accession protéique dans la boîte de requête en protéines.
Cliquez sur sur la surtension et un tableau contenant des informations de base pour la protéine interrogée apparaîtra. Ensuite, cliquez sur le lien de détails. La page nouvellement ouverte contiendra un navigateur génomique centré sur la protéine interrogée, ainsi que d’autres informations.
Pour obtenir des séquences de protéines ou d’ADN, cliquez sur les liens protéine ou ADN à partir des onglets d’information, respectivement Cliquez sur les onglets pour parcourir les informations détaillées sur la détection de profilage ribosome preuve de spectrométrie de masse, et la conservation et les domaines de protéines identifiées. Dans cette anlyse représentative, la plupart des protéines identifiées dans l’article original ont également été identifiées à l’aide de l’OpenProt 2_pep ou de la base de données OpenProt_all, montrant que les bases de données OpenProt sont capables de produire une identification et une quantification des protéines comparables à celles des procédures actuelles basées sur les bases de données InterPro KB. 11 protéines bien prises en charge qui ne sont pas encore annotées dans les bases de données ont été identifiées dans tous les ensembles de données avec des peptides confiants à l’aide de la base de données OpenProt 2_pep’openprot.
29 nouvelles protéines ont été découvertes dans tous les ensembles de données avec des peptides confiants à l’aide de la base OpenProt_all base de données. Le taux rigoureux recommandé de fausse découverte n’a pas affecté les identifications protéiques les plus confiantes, bien qu’il ait diminué le nombre total de protéines identifiées. Une protéine nouvelle a été découverte en tant qu’interacteur de la protéine Raf-1.
Ces protéines n’avaient pas été précédemment détectées par spectrométrie de masse ou profilage ribosome et ont démontré un spectre de bonne qualité. N’oubliez pas de vous assurer que les paramètres sélectionnés sont adéquats à la conception expérimentale et vérifiez toujours la qualité des preuves sportives lors de la déclaration de nouvelles découvertes de protéines. Ce protocole est adaptable à toutes les expériences de protéomique descendante, notamment lorsqu’il est utilisé avec la protéomique fonctionnelle.
Cela permettra un dépistage et une compréhension beaucoup plus profonds des interactions protéiques et des voies cellulaires. OpenProt souligne la sous-estimation substantielle du paysage protomic relayée par les notations génomiques actuelles et met l’accent sur la nature polysystronic des gènes eucaryotes. C’est une toute nouvelle voie de recherche.
La beauté de ce protocole est qu’il ne nécessite pas de compétences bioinformatiques étendues et que, puisqu’il utilise des serveurs distants, il peut être exécuté sur n’importe quel ordinateur.
Aperçu
OpenProt est une base de données pionnière qui soutient un modèle polycistronique des génomes eucaryotes, facilitant la découverte de protéines auparavant indétectables. Ce protocole décrit comment utiliser les bases de données OpenProt pour analyser des jeux de données de spectrométrie de masse, rendant les découvertes en protéomique accessibles aux chercheurs ne possédant pas de solides compétences en bioinformatique.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Protéomique
- Génomique
- Bioinformatique
Contexte
- OpenProt permet une annotation polycistronique des génomes eucaryotes.
- Il reconnaît le potentiel codant des proto-gènes.
- La base de données améliore la compréhension du paysage protéomique.
- Elle fournit une définition plus claire du protéome pour diverses analyses.
Objectif de l'étude
- Présenter un protocole d'utilisation d'OpenProt dans les analyses protéomiques.
- Permettre l'identification de protéines nouvelles par spectrométrie de masse.
- Rendre l'analyse protéomique accessible aux utilisateurs ayant différents niveaux d'expertise.
Méthodes utilisées
- Accéder à la base de données OpenProt et sélectionner l'espèce d'intérêt.
- Télécharger les fichiers protéiques dans différents formats pour analyse.
- Utiliser l'outil MS Convert pour la préparation des données de spectrométrie de masse.
- Appliquer des flux de travail pour la quantification et l'identification des protéines.
Résultats principaux
- Identification de 29 nouvelles protéines et de 11 protéines bien confirmées auparavant non annotées.
- Démonstration d'une identification comparable des protéines par rapport aux bases de données existantes.
- Mise en évidence de la sous-estimation du paysage protéomique par les annotations génomiques actuelles.
- Montré que le protocole est adaptable à diverses expériences de protéomique.
Conclusions
- OpenProt améliore considérablement la découverte de protéines dans les génomes eucaryotes.
- Le protocole est convivial et ne nécessite pas de compétences approfondies en bioinformatique.
- Il ouvre de nouvelles voies de recherche en protéomique et en études fonctionnelles.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Les annotations génomiques actuelles sous-estiment le protéome eucaryote en imposant des contraintes arbitraires sur la longueur des cadres de lecture ouverts (ORF) et en limitant chaque transcrit à un seul ORF, ce qui restreint la découverte de cibles au stade initial du développement pharmaceutique. OpenProt comble cette lacune en permettant une annotation polycistronique, révélant ainsi de nouvelles protéines issues de cadres de lecture non canoniques qui pourraient représenter des cibles thérapeutiques peu explorées ou des risques d'effets indésirables. Cela élargit le champ de la validation des cibles et améliore la confiance prédictive dans le choix préclinique des cibles en réduisant les faux négatifs lors du criblage protéomique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en identifiant les protéines traduites à partir de régions non codantes, des régions 5'/3' UTR ou des CDS chevauchants, clarifiant ainsi la complexité du protéome.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à la détection de nouvelles protéines appuyée par des preuves de spectrométrie de masse, réduisant l'ambiguïté mécanistique dans le choix des cibles.
- Valeur prédictive : Améliore le tri des portefeuilles en révélant des protéines possiblement impliquées dans des maladies, renforçant la confiance dans les décisions de priorisation des cibles.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés pour des flux de travail en aval en fournissant des bases de données complètes de séquences protéiques reflétant le paysage protéomique réel.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation et la reproductibilité des dosages grâce à l'utilisation de bases de données OpenProt spécifiques aux espèces et hiérarchisées par niveau de preuve dans les flux de travail de spectrométrie de masse.
- Extensibilité : Permet une évaluation fiable des composés en réduisant les faux négatifs dans les criblages protéomiques grâce à un espace de recherche élargi associé à des contrôles appropriés du taux d'erreur.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Soutient les systèmes pertinents pour les maladies en identifiant de nouvelles protéines exprimées dans les modèles utilisés pour la validation préclinique, reliant ainsi la découverte à des résultats fonctionnels.
- Dérisquage mécanistique : Facilite l'alignement des biomarqueurs en détectant des protéines possédant des domaines conservés ou des profils d'interaction similaires, comme l'interacteur de Raf-1, permettant une validation au niveau des voies biologiques.
- Avancement ajusté au risque : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en révélant des protéines manquées dans les annotations conventionnelles, réduisant ainsi les surprises biologiques en phase avancée.
Intégration des pipelines et des flux de travail
OpenProt s'intègre dans le continuum de découverte allant de l'identification de la cible à l'optimisation du composé précurseur, en améliorant le criblage à l'échelle du protéome avec un surcroît minimal de bioinformatique.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies en identifiant des protéines issues d'ORFs non canoniques susceptibles de moduler des réseaux de signalisation pertinents pour les maladies.
- Écrantage : Améliore la préparation des tests et la fiabilité des résultats quantitatifs en permettant des recherches exhaustives dans les bases de données avec un FDR contrôlé, augmentant ainsi la détection de cibles peu abondantes ou nouvelles.
- Analytique : Produit des correspondances entre peptides et spectres, des identifications protéiques et des données de quantification permettant la comparaison entre différentes conditions et la validation de cibles.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la découverte et la continuité préclinique en identifiant des protéines présentant une conservation, une architecture de domaines ou des preuves d'interactions pertinentes pour la biologie humaine.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une base de connaissances protéomiques réutilisable à travers les espèces et les projets, réduisant les efforts redondants de curation des bases de données.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en révélant la nature polycistronique des gènes eucaryotes et en réduisant les faux négatifs dans la découverte protéomique.
- Valeur opérationnelle : Favorise la standardisation et l'évolutivité grâce à des bases de données protéiques spécifiques aux espèces, librement accessibles et compatibles avec les outils protéomiques courants.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une identification plus précoce de nouvelles cibles à haute confiance, réduisant ainsi les investissements dans des pistes erronées.
- Impact sur le portefeuille : Soutient une priorisation ajustée au risque en élargissant l'espace des cibles avec des protéines novatrices étayées par des preuves, éclairant ainsi les décisions d'avancement.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite des compétences de base en protéomique en matière de traitement des données de spectrométrie de masse et de recherche dans des bases de données, bien qu'aucune compétence avancée en bioinformatique ne soit requise.
- Suppose l'accès à des outils de protéomique capables d'importer des bases de données FASTA et d'exécuter des moteurs de recherche comme X!Tandem selon des flux de travail personnalisés.
- Exige une standardisation entre équipes concernant les seuils de FDR et les versions des bases de données (par exemple, OpenProt_all versus OpenProt_2_pep) afin d'assurer la reproductibilité entre les études.
- Implique des adaptations à prendre en compte lors de l'application de la base de données à des organismes non modèles ou à des types d'échantillons spécialisés, en fonction du niveau de preuve sélectionné.
- Comprend des limites pratiques, telles qu'une augmentation de la taille de la base de données nécessitant des réglages stricts du FDR pour maintenir la confiance dans les identifications, comme indiqué dans le protocole.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
OpenProt Database Download
1:53
Database Handling
2:41
Mass Spectrometry File Preparation
3:13
Protein Quantification
4:13
Quality Control and OpenProt Database Mining
5:25
Results: Representative Interactor and Mass Spectrometry Identification of a Novel Protein
6:40
Conclusion
