Utilisation de Microtiter Dish Radiolabeling pour plusieurs mesures in vivo d'Escherichia coli (p)ppGpp Suivi par thin Layer Chromatography

Cette méthode mesure les niveaux du ppGpp régulateur mondial dans différentes conditions de croissance et situations de stress. PpGpp peut être trouvé dans les bactéries gram positives et négatives, ainsi que dans le chloroplaste. PpGpp a un début rapide en quelques secondes, ce qui conduit à une deuxième relation rapide une fois que le stress est produit.

En même temps, il a une courte demi-vie, jusqu’à 30 secondes. Par conséquent, il est nécessaire de surveiller de nombreuses cultures à intervalles de temps qui peuvent varier de 10 secondes à heures, y compris les transitions stressées. Nous radioétiquetons également les cultures bactériennes dans les plats de microtiter facilite les échantillonnages à haut débit qui permettent de multiples répliques techniques et biologiques.

Assurez-vous de suivre les mesures de sécurité appropriées lorsque vous travaillez avec des matières radioactives. Pour commencer cette procédure, préparez tous les supports tels qu’ils sont décrits dans le protocole texte. Cultiver des cultures du jour au lendemain dans les médias MOPS avec trois millimolaires de phosphate de sodium.

Ajouter 550 microlitres de mops, 0,2 porteur de phosphate de sodium micromolaire et 30 microlitres de chaque inoculum bactérien aux puits d’une plaque de puits de 24 puits. Il en résultera un inoculum initial avec un OD600 de 0,1. Ajoutez des supports frais à un ainsi qu’un contrôle de stérilité.

Placez la plaque dans un incubateur secouant à 37 degrés Celsius, en secouant à 900 RPM pendant 30 minutes. La croissance peut être surveillée à l’aide d’un lecteur de plaque avec une plaque de répétition en parallèle dans les médias dépourvus de p32 à l’aide d’un lecteur de plaque tout en couveant dans les mêmes conditions. Ensuite, ajoutez 100 micro-curies d’orthphosphate p32 à chaque puits de la plaque.

Faire pousser les cultures dans un incubateur de secousses pour un à deux doublements pour permettre à l’étiquette externe d’équilibrer en grande partie avec des piscines nucléotides intercellulaires. Pour une visualisation correcte, aucun du matériel actif n’a été utilisé dans cette vidéo. Dans une expérience réelle, un blindage adéquat est nécessaire ainsi qu’une surveillance constante de la contamination par un compteur d’arpentage.

Tout d’abord, induire le stress en utilisant une méthode appropriée pour le type de stress étudié. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de chaque échantillon de cellules étiquetées à un tube PCR séparé de 0,2 millilitre, contenant 20 microlitres d’acide formic molaire froid six molaires. Placez immédiatement les échantillons sur de la glace sèche.

Améliorer l’efficacité de l’extraction cellulaire par trois cycles de congélation et de décongélation. Juste avant de repérer les chromatogrammes à couche mince de cellulose de l’Île-du-Prince-Édouard, centrifuger les échantillons pendant une minute à une vitesse maximale pour pelleter les débris cellulaires. Tout d’abord, établissez une plaque TLC de cellulose de 20 par 20 centimètres de l’Île-du-Prince-Édouard.

Utilisez des ciseaux pour enlever les cinq centimètres les plus hauts. Et utilisez un crayon doux pour marquer une ligne d’origine à un centimètre du bord. Appliquer une gouttelette de cinq microlitres de chaque échantillon à la surface de l’Île-du-Prince-Édouard.

Avant que l’endroit puisse sécher, transférez la plaque dans un réservoir contenant une couche de phosphate monopotassium molaire de 1,5 molaire suffisamment peu profonde pour ne pas toucher la tache de l’échantillon d’origine. Couvrez le réservoir d’un joint hermétique et laissez l’ascension liquide vers le haut de la feuille garnie de 15 centimètres. Après cela, retirez le chromatogramme entièrement développé et séchez-le à température ambiante.

Couper et jeter la partie supérieure du chromatogramme contenant le P32 libre dans les déchets radioactifs. Utilisez un écran de phosphore pour exposer les films audioradigraphiques du jour au lendemain. Le lendemain, développez le film et utilisez un phosphorimager pour capturer et quantifier le signal vert du phosphore.

Ensuite, utilisez le logiciel ImageJ pour quantifier les taches radioactives. Après avoir provoqué le stress ou la famine pendant un temps suffisant pour permettre l’accumulation ppGpp, utiliser une méthode appropriée pour inverser le stress. Prélevez des échantillons toutes les 20 à 30 secondes jusqu’à deux minutes et traiter les échantillons comme décrit précédemment.

Une fois que le TLC est développé, et les niveaux de ppGpp sont obtenus au cours du cours du temps, tracer le contenu ppGpp résiduel sur une parcelle semilogarithmic par rapport au temps. Dans cette étude, les cellules cultivées en MOPS contenant tous les acides aminés à l’exception de l’ILV sont étiquetées avec du P32. Une fois étiqueté, L valine est ajouté pour produire la famine isoleucine.

Après cinq minutes, une augmentation de deux ans et deux ans et demi des niveaux de tétra et de pentaphosphate de guanosine s’est produite. Un contrôle négatif d’un échantillon étiqueté sans cellules est utilisé pour détecter les composés possibles qui ne sont pas orthophosphorés dans la source P32. L’inversion de la famine d’isoleucine peut être réalisée par chloramphenicol, un inhibiteur de la synthèse de protéine, qui réduit la consommation de tRNA chargé d’isoleucine, et restaure à son tour des rapports élevés de tRNA chargé à non chargé.

L’activation de la synthétase ppGpp rela-médiatisée forte est abolie, ce qui permet une mesure de la dégradation ppGpp non perturbée par la synthèse résiduelle. Dans ce cas, ppGpp se décompose avec une demi-vie d’environ 64 secondes. Il est important de laisser les cellules se développer pendant quelques générations pour obtenir un étiquetage uniforme avant d’induire tout stress ou famine.

Puisque ppGpp est largement répandu parmi des bactéries, cette méthode peut être appliquée à d’autres organismes. La modification de la méthode de développement tlc pourrait permettre la séparation appropriée de tous les nucléotides réglementaires, tels que ppApp. P52 est un meilleur isotope émetteur, il est donc important d’utiliser un blindage approprié et de jeter correctement tout résidu.