Expression et purification de nuclease-Free Oxygen Sccatechuate 3,4-Dioxygenase

Notre protocole produit un PCD très actif exempt de nucléase détectable, qui peut être utilisé dans n’importe quelle solution où l’oxygène aqueux est un contaminant. Les techniques que nous utilisons sont faciles à reproduire et garantissent qu’aucun contaminant nucléase n’est présent dans le produit. Pour commencer, combinez un microlitre de plasmide d’expression PCD pVP91A-pcaHG et 20 microlitres d’E.coli BL21 disponible dans le commerce dans un tube.

Feuilleter le tube pour mélanger et placer le tube sur la glace pendant cinq minutes. Pour poursuivre la réaction de transformation, placez le tube dans un bain d’eau à 42 degrés Celsius pendant 30 secondes, puis sur la glace pendant deux minutes. Ajouter 80 microlitres de soc média, et secouer à 225 rpm et 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, versez le mélange de réaction de transformation sur une agar lb-ampicilline, et utilisez un ép étaleur de plaques pour étendre le mélange. Couvrir la plaque d’un couvercle et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Après cela, choisissez une colonie de la plaque, et inoculer dans 50 microlitres de LB-ampicilline dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres.

Placez le flacon sur un shaker à 225 rpm pour incuber à 37 degrés Celsius pendant 16 à 18 heures. Ensuite, transférez 20 millilitres de la culture incubée dans une fiole de quatre litres remplie d’un litre d’ampicilline LB. Agiter à 225 rpm à 37 degrés Celsius.

Chaque heure, dessinez un millilitre de la culture dans une cuvette pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres sur un photomètre. À mesure que la densité optique de la culture augmente de près de 0,5, augmentez la fréquence des mesures toutes les 15 minutes, jusqu’à ce que l’OD600 atteigne 0,5. Ensuite, transférez le flacon de quatre litres dans un bac de glace.

Faites tourbillonner le flacon dans le bain de glace pour réduire la température de culture. Transférer le flacon de quatre litres dans un incubateur à 17 degrés Celsius et 180 rpm. Continuez à surveiller l’OD600 toutes les 20 minutes.

À 0,7 OD600, ajouter des solutions de stock d’hexahydrate d’hexahydrate de fer IPTG et ammonium pour atteindre une concentration finale de 0,5 millimolar et 10 milligrammes par litre, respectivement. Secouez la culture à 180 rpm et 17 degrés Celsius pendant 18 heures. Après l’incubation, placer le flacon de culture dans la glace pendant deux minutes.

Récoltez un millilitre des cellules induites dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de 1,5 millilitre pour l’analyse SDS-PAGE. Ensuite, versez la culture bactérienne dans des bouteilles, 500 millilitres par bouteille, pour centrifugation. Pelleter la culture à quatre degrés Celsius et 3000 fois g pendant 20 minutes.

Décanter les surnatants. Pipette pour résuspendre les granulés, chacun dans 12,5 millilitres de PBS froid, et combiner toutes les deux resuspensions dans un tube conique de 50 millilitres. Pelleter les cellules à nouveau comme précédemment.

Ensuite, jetez les supernatants, et utilisez une pipette pour ajouter 10 millilitres de tampon de lyse dans chaque tube pour résuspendre les cellules. Après avoir sonné les tubes avec des cellules induites, verser le lysate bactérien dans une bouteille de polycarbonate pré-refroidi. Centrifugeuse pendant 60 minutes à 120 000 fois g et quatre degrés Celsius, et verser le supernatant dans un tube conique froid de 50 millilitres.

Après avoir préparé l’instrument FPLC avec la colonne de résine chargée de nickel, chargez l’échantillon jusqu’à la colonne à 0,15 millilitres par minute. Lavez la colonne avec 20 millilitres de tampon de nickel à l’imidazole de 20 millimlaires. Conserver le lavage dans un tube de 50 millilitres pour analyse.

Ensuite, lavez la colonne avec 15 millilitres de tampon de nickel à 125 millimolar imidazole. Recueillir l’élitution en 19 fractions de 0,8 millilitres chacune. Lavez à nouveau la colonne avec 15 millilitres de tampon B à 100 % nickel, et recueillez 75 fractions supplémentaires de 0,2 millilitre chacune.

Poursuivre l’analyse des fractions collectées sur des gels SDS-PAGE à 12 % pour confirmer la présence de PCD. Tout d’abord, ajouter 35 microlitres de tampon de réaction à un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de 1,5 millilitre. Dans le tube, combiner cinq microlitres des fractions de chromatographie de pointe et 500 nanogrammes de paire de trois kilobases supercoiled plasmide pXba.

Placez le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant une heure. Après avoir préparé du gel d’agarose selon le manuscrit, ajouter 30 microlitres de chaque réaction dans les puits du gel. Électrophorese à 10 volts par centimètre à température ambiante pendant environ une heure.

Maintenant, le colorant orange G a atteint la fin du gel. Immédiatement, utilisez un scanner de fluorescence pour imager le signal de bromure d’éthidium du gel. Avec la fonction de l’intensité et de la taille des pixels d’image, déterminez le volume de pixels des différentes espèces d’ADN, telles que les cercles supercoilés, linéaires et entaillés.

Pour déterminer le pourcentage de chaque espèce d’ADN, divisez le volume de pixels d’une seule espèce d’ADN par le volume total de pixels pour toutes les espèces individuelles. L’analyse SDS-PAGE montre que le deuxième pic d’élitution contient une contamination minimale des protéines, ce qui représente un heterodimer PCD presque pur et une activité nucléase minimale à indétectable. Ainsi, combinez ces 10 fractions de la deuxième elution pcd dans un tube conique de cinq millilitres pour une analyse plus approfondie.

Après la purification chromatographie d’exclusion de taille du PCD, dans une pièce froide de quatre degrés Celsius, combinez dans un tube de microcentrifugeuse le volume approprié de chlorure de sodium, d’hydrochlorure de Tris, de chlorure de magnésium, de dithiothreitol, de PCA, et de pXba plasmide supercoiled pour faire un stock de 5X. Placez une plaque à fond plat de 96 puits sur la glace et transférez 10 microlitres de la solution 5X combinée aux puits. Immédiatement avant l’analyse, ajouter à chaque puits 10 microlitres des fractions individuelles de la SEC PCD.

Réglez le lecteur de plaque à une température interne de 37 degrés Celsius, et transférez la plaque de 96 puits au porte-plaques. Rétractez le porte-plaques dans l’instrument et mesurez l’absorption à 290 nanomètres à intervalles de 20 secondes pendant une heure. Réglez l’instrument pour secouer la plaque cinq secondes avant chaque lecture.

Après une heure, ajouter 10 microlitres de solution d’arrêt à chaque puits pour mettre fin aux réactions. Effectuez l’électrophoresis de gel pour les fractions de SEC de PCD. Sélectionnez les fractions ayant le plus d’activité d’oxydation de l’APC, indiquées par une diminution de l’absorption et aucune contamination par les nucléases observée.

Mesurez l’absorption à 280 nanomètres et calculez la concentration totale de PCD en fonction de l’absorption et du coefficient d’extinction. Conservez les fractions sélectionnées pour un stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius. Dans cette expérience, il a été constaté que le PCD recombinant, un heterodimer de hexahistidine marqué pcaH et pcaG, a été exprimé dans E.coli.

L’heterodimer a d’abord été purifié par chromatographie d’affinité de nickel. L’absorption est indiquée en bleu, et la concentration en pourcentage de nickel tampon B est indiquée en rouge. Le flow-through montre les protéines bactériennes solubles qui ne se lient pas à la résine de nickel.

Certains PCD se sont écoulés en présence de l’imidazole de 125 millimolaires, mais la majorité de la protéine s’est élisée dans l’imidazole de 250 millimolar. L’analyse représentative du SDS-PAGE indique que les fractions de l’étape d’élitution étaient exemptes de contaminants. Le gel agarose de l’analyse de nucléase révèle la contamination en comparant avec le contrôle négatif sans protéine ajoutée et un contrôle positif contaminé par une nucléase d’ADN.

La quantitation des diverses espèces d’ADN observées dans l’analyse de nucléase de gel d’agarose montre que les fractions 29 à 38 ont eu peu d’activité de nucléase, qui ont été choisies pour être combinées, concentrées, et encore purifiées par SEC. Les données de trois fractions représentatives de SEC ont prouvé que pcd purifié a réduit l’absorption à 290 nanomètres, indiquant oxydation de PCA. Suite à cette procédure, le PCD purifié peut être utilisé et optimisé dans le système de cisaillé d’oxygène désiré.

Cela déterminera la quantité exacte de PCD requise pour le système. Cette technique a été utilisée pour prolonger la durée de vie du fluorophore dans le cadre d’expériences de microscopie à molécule unique, ce qui a permis de plus longues périodes de collecte de données. L’ultracentrifugeuse utilisée est dangereuse.

Assurez-vous que les centrifugeuses sont bien équilibrées avant de tourner. Le bromure d’éthidium est un réaccéléologue dangereux. Évitez tout contact en portant de l’équipement de protection individuelle et éliminez-le de façon appropriée.