Name: Mouvement de la fusillade du traceur CFDA chargé dans les tissus de l’évier inférieur de l Arabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez le chargement du traceur CFDA dans les racines et hypocotyles d'Arabidopsis pour étudier le transport intercellulaire. Cette méthode révèle les mécanismes de mouvement du carboxyfluorescéine dans les tissus végétaux.

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Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de la Chine (31671257) et le centre d’innovation collaborative Hubei pour l’industrie céréalière (LXT-16-18).

1. Arabidopsis croissance verticale dans le milieu MS
<ol><li>L’intérieur de l’armoire à écoulement laminaire doit être traité avec 30 min de lumière UV et 15 min d’air avant utilisation. Assurez-vous de fermer la porte vitrée lorsque la lumière UV est allumé. Vaporisez tous les outils et plaques avec 70% d’éthanol avant de les placer dans l’armoire.</li>
	<li>Préparer le milieu Murashige et Skoog (MS) dans une boîte de Petri standard de 90 mm de diamètre sous une armoire à flux laminaire. NOTE: le médium MS contient les éléments suivants: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7H2o, 3 mm CaCl2· 2H2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 μM na2Moo4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm ZnSO4· 7h2o, 0,1 μM CUSO4· 5h2o, 0,1 μM COCl2· 6H2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μM d’acide éthylenediaminetétraacétique (EDTA), 4,07 μM d’acide nicotinique, 2,44 μM de pyridoxine hcl, 0,15 μm de thiamine hcl, 2,68 mm de glycine, 555 μm de myo-inositol, 87,7 mm de saccharose et 10 g/L de gélose.</li>
	<li>Hydrater les pointes stérilisées ou les cure-dents en touchant la pointe ou les cure-dents au milieu MS, puis tremper les graines stérilisées une par une sur la position fixe de chaque boîte de Petri indiquée par la carte de semis.</li>
	<li>Sceller la boîte de Petri avec du film de paraffine et du ruban adhésif et la placer verticalement sur un stand clair dans une salle de croissance (22 ° c, 70% d’humidité) avec un cycle de jour de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité (éclairage de 6 heures à 22 heures). L’usine Arabidopsis est prête pour le chargement CFDA le jour 9-13 après le semis. Remarque: la procédure suivante est effectuée dans l’après-midi de 14h à 17h.</li>
</ol>2. chargement CFDA avec la procédure de découpe de la racine
<ol><li>Préparez une solution de travail CFDA fraîche immédiatement avant utilisation. Diluer la solution stock de 1 mM de CFDA stockée dans un congélateur de-20 ° c avec de l’eau ultrapure stérile à une concentration de travail de 5 μM.</li>
	<li>Coupez le film microporeux de la membrane de paraffine (voir tableau des matériaux) en petits morceaux de 3 mm x 3 mm de diamètre.</li>
	<li>Découvrez les plantes qui poussent dans la pièce à 22 ° c et effacez l’excès d’humidité avec une serviette en papier. Placez les petits morceaux de film sous chaque racine. NOTE: de ceci à l’étape 2,6, l’ensemble du processus devrait être complété dans les 15 min.</li>
	<li>Soulever les plantes sur le couvercle de la boîte de Petri. Coupez les racines dans une position d’environ 5-10 mm sous la jonction racine-hypocotyle. Replacez la partie de tournage sur le film sur le support.</li>
	<li>Appliquer avec précaution 0,25 μL de CFDA sur l’extrémité de coupe de chaque racine sous un microscope disséant. Évitez d’éclabousser les autres parties de la plante.</li>
	<li>Couvrir la plaque et laisser les plantes sous la lumière pour 2-3 h (22 ° c) dans la salle de croissance.</li>
	<li>Rincez les plantes colorées trois fois séquentiellement dans trois béchers distincts remplis d’eau distillée, puis observez les plantes sous un microscope stéréo-fluorescence avec un zoom de 1,4 x à 3,3 x (voir le tableau des matériaux). Pour la détection de fluorescence, utilisez un cube filtrant à haut rendement (excitation 470/20 nm, 495 nm divisé et 525/50 nm émission) monté pour transmettre le signal de fluorescence.</li>
</ol>3. chargement CFDA avec procédure d’hypocotyle-pincement
<ol><li>Préparez une solution de travail CFDA fraîche immédiatement avant utilisation. Diluer la solution de stock de 1 mM de CFDA stockée dans un congélateur de-20 ° c avec de l’eau ultrapure stérile (voir le tableau des matériaux) à une concentration de travail de 5 μm.</li>
	<li>Coupez le film microporeux de la membrane de paraffine (voir tableau des matériaux) en petits morceaux de 3 mm x 3 mm de diamètre.</li>
	<li>Découvrez les plantes qui poussent dans la pièce à 22 ° c et effacez l’excès d’humidité avec une serviette en papier. NOTE: de ceci à l’étape 3,7, l’ensemble du processus devrait être complété dans les 15 min.</li>
	<li>Poser un petit morceau de film sous la jonction racine-hypocotyle de chaque plante.</li>
	<li>Utiliser forceps pour pincer doucement l’hypocotyle près de la jonction racine-hypocotyle sous un microscope disséçant.</li>
	<li>Appliquer avec précaution 0,1 μL de CFDA sur le site de la plaie sous un microscope disséant. Évitez d’éclabousser les autres parties de la plante.</li>
	<li>Recouvrir la plaque et laisser les plantes sous la lumière (22 ° c) pour 2-3 h.</li>
	<li>Rincez les plantes colorées trois fois séquentiellement dans trois béchers distincts remplis d’eau distillée, puis observez les plantes sous un microscope stéréo-fluorescence avec un zoom de 1,4 x à 3,3 x (voir le tableau des matériaux). Pour la détection de fluorescence, montez un cube filtrant à haut rendement (excitation 470/20 nm, 495 nm divisé et 525/50 nm émission) pour transmettre le signal de fluorescence.</li>
</ol>

<ol><li>Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((6%285%29Carboxyfluorescein+as+a+tracer+of+phloem+sap+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation.</a> American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).</li>
<li>Wright, K. M., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+probe+HPTS+as+a+phloem-mobile%2C+symplastic+tracer%3A+an+evaluation+using+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy.</a> Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+Lucifer+Yellow+CH+in+potato+tuber+storage+tissues%3A+A+comparison+of+symplastic+and+apoplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport.</a> Planta. 176 (4), 533-540 (1988).</li>
<li>Knoblauch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+Phloem-Mobile+Probes%3A+Properties+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications.</a> Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).</li>
<li>Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+phloem+unloading+in+the+root+tip+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).</li>
<li>Viola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberization+in+Potato+Involves+a+Switch+from+Apoplastic+to+Symplastic+Phloem+Unloading%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading.</a> The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).</li>
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<li>Péron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Insights+into+Phloem+Unloading+and+Expression+of+Sucrose+Transporters+in+Vegetative+Sinks+of+the+Parasitic+Plant+Phelipanche+ramosa+L+%28Pomel%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel).</a> Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).</li>
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<li>Complainville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodule+initiation+involves+the+creation+of+a+new+symplasmic+field+in+specific+root+cells+of+medicago+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species.</a> The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).</li>
<li>Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+fluorescent+dyes+Lucifer+Yellow+%28LYCH%29+and+carboxyfluorescein+%28CF%29+in+Medicago+truncatula+Gaertn.+roots+and+root+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Symbiosis%22%5BJournal%5D)">Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules.</a> Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).</li>
<li>Robards, A. W., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Physiology+and+Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).</li>
<li>Roberts, A. G., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+and+the+control+of+symplastic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Plant%2C+Cell+%26+Environment%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata and the control of symplastic transport.</a> Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).</li>
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<li>Erwee, M. G., Goodwin, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplast+domains+in+extrastelar+tissues+of+Egeria+densa+Planch%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch.</a> Planta. 163 (1), 9-19 (1985).</li>
<li>Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symplastic+communication+between+primary+and+developing+lateral+roots+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana.</a> Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).</li>
<li>Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Unidirectional+Flow+through+Plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata.</a> Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).</li>
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<li>Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+Arabidopsis+spreads+from+the+root+to+the+shoot%2C+through+a+gating+barrier%2C+by+template-dependent%2C+non-vascular%2C+cell+to+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement.</a> Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).</li>
<li>Radford, J. E., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tissue-preparation-induced+callose+synthesis+on+estimates+of+plasmodesma+size+exclusion+limits%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits.</a> Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).</li>
<li>Kollist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Responses+to+Abiotic+Stress%3A+Priming+the+Landscape+for+the+Signal+Transduction+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network.</a> Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).</li>
<li>Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Symplastic+Phloem+Unloading+in+Sink+Leaves+of+Barley%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley.</a> Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).</li>
<li>Botha, C. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xylem+sap+retrieval+pathway+in+rice+leaf+blades%3A+evidence+of+a+role+for+endocytosis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?</a> Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Des études émergentes ont montré que les plantes peuvent réagir rapidement aux stimuli externes23, y compris la manipulation introduite dans les procédures expérimentales22. Dans notre expérience initiale, notre surveillance de cette connaissance conduit souvent à l’échec de coloration. Avec ces leçons, nous suggérons que les précautions suivantes doivent être maintenues à l’esprit lors de l’exécution de cette expérience: (1) les semences après la récolte doivent être conse...

De nombreux traceurs fluorescents avec une gamme de propriétés spectrales, comme l’acide 5 (6)-carboxyfluorescéine (CF) 1,8-hydroxypyrène-1, 3, 6-trisulphonique2, Lucifer Yellow ch (Lych)3, esculine et cter4, ont été développés et appliqué dans les plantes pour surveiller le mouvement symplastique et l’activité de phloème. En général, un colorant symplastique est chargé dans une coupe dans le tissu cible et la dispersion séquentielle du reporter dans d’autres parties de la plante démontrera la communication intercellulaire. Bien que le mécanisme d’absorption des colorants ne soit pas pleinement compris, le principe sous-jacent du mouvement des FC à l’intérieur des cellules vivantes a été largement reconnu. La forme ester de CF (diacétate des FC, CFDA) est non-fluorescente, mais perméable à la membrane. Cette propriété permet la diffusion rapide de la membrane du colorant dans les cellules. Une fois à l’intérieur des cellules vivantes, les estérases intracellulaires éliminent les groupes d’acétate à la position 3 'et 6 'de la CFDA, libérant les CF fluorescentes et imperméables à la membrane (figure 1, alternativement, Wright et al.2); Les FC peuvent alors se déplacer à travers les plasmodesmes vers d’autres parties de plantes.
Une procédure bien établie avec CFDA est qu’il peut être chargé dans les feuilles de source et utilisé pour surveiller le streaming phloème et le déchargement du phloème dans les tissus de l’évier de nombreuses espèces, par exemple, comme le déchargement des FC dans la racine Arabidopsis 5, le déchargement phloème pendant la tuberisation de la pomme de terre6, le déchargement du phloème dans l’évier Nicotiana laisse7, et ainsi de suite. Par des approches de chargement similaires, d’autres études ont adopté ce colorant pour démontrer la liaison symplasique entre l’hôte et le parasite8,9, ou pour révéler les relations symbiotiques10,11.
Une autre façon de faire usage de ce colorant est de le charger dans des cellules spécifiques ou une seule cellule par microinjection pour déterminer son modèle de distribution. De telles techniques sophistiquées ont grandement facilité notre compréhension plus approfondie de la communication intercellulaire médiée par plasmodesmata, en particulier dans le développement du concept de domaine symplastique12,13. Par exemple, la microinjection de CFDA dans les cellules de cotylédons de l' Arabidopsis a entraîné le modèle de couplage de colorant dans l’épiderme de l’hypocotyle, mais sans couplage dans les cellules sous-jacentes ou dans l’épiderme des racines, par conséquent l’épiderme hypocotyle forme une domaine symplastique14. Des domaines similaires, tels que les cellules de la garde stomatale15, les cellules de l’élément-compagnon16, les cellules capillaires14 et la coiffe des racines17,18 ont été identifiés par la technique de la microinjection. Le plus surprenant, certains domaines permettent aux molécules traceurs de se déplacer dans une certaine direction. Prenez le domaine de trichome par exemple, la microinjection d’une sonde fluorescente dans la cellule épidermique de soutien conduit au flux de traceur dans le domaine de trichome, cependant, l’injection inverse ne tient pas vrai19. Un rapport récent a également trouvé des situations similaires dans les domaines symplasiques de l’embryon Sedum 20. Ainsi, tous les cas ci-dessus impliquent que l’échange de sites de chargement peut conduire à de nouveaux aperçus de la communication symplastique. Notre expérience précédente visant à disséquer la voie du silençage mobile de la racine à la pousse a identifié un nouveau domaine symplastique, ou la zone Hej (hypocotyle-épicotyle), qui a été vérifiée par le chargement des racines (chargement de l’évier non canonique) CFDA l’expérience21. Ici, nous élaborons en outre le mouvement de la racine à la pousse des FC en utilisant une méthode simple et de récupérer un domaine symplastique potentiel en déplaçant les sites de chargement. En outre, cette procédure peut être adaptée pour différencier les antécédents génétiques qui ont modifié le transport de longue distance de la racine à la pousse.

<table><tbody><tr><td>KNO3&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10017218</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4&nbsp ;</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10017608</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot ; 7H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10013018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot ; 2H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>20011160</td><td></td></tr><tr><td>MnSO4&middot ; H2O&nbsp ;</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10013418</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot ; 2H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10019818</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10004818</td><td></td></tr><tr><td>ZnSo4&middot ; 7H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10024018</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4&middot ; 5H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10008218</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot ; 6H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10007216</td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10017160</td><td></td></tr><tr><td>FeSO4&middot ; 7H2O</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10012118</td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp ;</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10009717</td><td></td></tr><tr><td>Réactif chimique NaOH</td><td>Sinopharm</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10017018</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Réactif chimique Sinopharm</td><td>10021418</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol&nbsp ; &nbsp ;</td><td>MACKLIN</td><td>I811835</td><td></td></tr><tr><td>Acide nicotinique&nbsp ;</td><td>MACKLIN</td><td>N814565</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>MACKLIN</td><td>V820447</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>MACKLIN</td><td>T818865</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>MACKLIN</td><td>G800880</td><td></td></tr><tr><td>Poudre de gélose</td><td>Novon</td><td>ZZ14022</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom V16</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à dissection</td><td>SDPTOP</td><td>SRE-1030</td><td></td></tr><tr><td>200&mu ; l pipette</td><td>Dragon Laboratory Instruments</td><td>713111110000-20-200ul</td><td></td></tr><tr><td>2.5&mu ; l pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine&nbsp ;</td><td>PINCE</td><td>ST-15</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Lame double face en acier inoxydable</td><td>Gillette</td><td>Platinum-Plus Lame</td><td></td> à double tranchant</tr></tbody></table>

mouvement de la fusillade du traceur cfda chargé dans les tissus de l’évier inférieur de l' arabidopsis

Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Le traceur symplastique 5 (6)-carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) a été largement appliqué dans les plantes vivantes pour démontrer la connexion intercellulaire, le transport de phloème et le modelage vasculaire. Ce protocole montre le mouvement de la carboxyfluorescéine de bas en haut (CF) dans l' Arabidopsis à l’aide de la procédure de découpage des racines et de l’hypocotyle-pincement respectivement. Ces deux procédures différentes résultent en différentes efficacités du mouvement des FC: environ 91% de l’apparition de CF dans les pousses avec la procédure d’hypocotyle-pincement, alors que seulement environ 70% de l’apparition de CF avec la procédure de coupe des racines. Le simple changement des sites de chargement, entraînant des changements significatifs dans l’efficacité mobile de ce colorant symplastique, suggère que le mouvement des FC pourrait être soumis à la régulation symplasique, probablement par la jonction racine-hypocotyle.

Le mouvement symplastic est souvent soumis à des fluctuations environnementales. Perturbation de l’état de culture de la plante, et même le processus de préparation tissulaire affectera la limite d’exclusion de la taille des plasmodesmes, affectant ainsi le transport symplastique22. Pour améliorer l’efficacité de coloration, nous limitons notre fonctionnement dans la salle de croissance, où la température et l’humidité est étroitement contrôlée, et aussi effectuer ...

Le but de ce protocole est de montrer comment charger la CFDA dans différents sites des parties inférieures de l' Arabidopsis. Nous présentons ensuite le modèle de distribution de CF dans les pousses.

Mouvement de la fusillade du traceur CFDA chargé dans les tissus de l’évier inférieur de l' Arabidopsis

The symplastic tracer 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) has been widely applied in living plants to demonstrate the intercellular connection, ...

La sonde largement utilisée CFDA, ou apr. JFC, ou apr. JADA, est non fluorescente. Les deux groupes H3 et la position de 3'6'sur ce composé le rendent perméant à la membrane. Lorsqu’une fois à l’intérieur des cellules, les acétates cellulaires internes élimineront les groupes d’acétate et libéreront la nouvelle forme de CFDA.C’est une carboxyfluorescéine, ou les FC, qui est fluorescente. Et parce que cette nouvelle forme est moins membrane-perméante, le poids, toutes les cellules est de se déplacer à travers les pores intercellulaires, ou le plasmodesmata dans les plantes, qui fait de ce diacétate la sonde idéale pour étudier le transport intercellulaire dans l’activité phloème. Dans la vidéo d’aujourd’hui, nous allons démontrer la charge de CFD dans la racine et l’hypocotyl des usines d’Arabidopsis, respectivement, et nous montrerons comment les deux procédures légèrement différentes affecteront le mouvement de bas en haut de cette sonde fluorescente.Obtenir des résultats de coloration de façon cohérente, nous stockons les graines d’Arabidopsis récoltées dans quatre degrés Celsius, 40% armoire d’humidité. Les graines nouvellement récoltées stockées dans cet état pendant plus de sept jours sont facilement utilisées pour le semis. Pour nous assurer que chaque plante est cultivée dans un espace relativement similaire dans la boîte de Petri, nous utilisons une carte de qualité zone de semences.Maintenant, mouiller la pointe stérilisée, tremper dans les graines stérilisées, et semer les graines un par un sur la position désignée. Après avoir fini de semer, sceller la boîte de Petri avec du parafilm et un ruban adhésif, les mettre sur un support de boîte de Pétri pour le laisser pousser verticalement. Voici les outils que nous allons utiliser dans cette expérience.S’il vous plaît noter que nous serions mieux de charger le colorant aussi rapidement que nous le pouvons. Normalement, vous terminez l’ensemble du processus en 10 à 15 minutes. Avant d’effectuer l’expérience de chargement CFDA, nous préparons toujours une nouvelle solution CFDA.Ici, diluer le CFDA d’un millimlaire en cinq concentrations de micromolaires avec de l’eau avant d’être immédiatement utilisé. Couper le parafilm en petits morceaux de trois par trois millimètres. Parce qu’il y a de la condensation sur le couvercle et le fond de la boîte de Pétri, nous devons les dégager avec du papier absorbant pour éviter que le colorant ne circule.Une petite pièce de parafilm est mise sous la racine. Soulevez les plantes et mettez-les sur le couvercle. Couper les racines d’environ cinq à 10 millimètres sous l’hypocotyle.Reprendre les pousses sur les petits morceaux de parafilm. Maintenant, appliquez soigneusement un microlitre CFDA sur l’extrémité de coupe de la racine. Essayez d’éviter de contaminer toutes les proto-plantes.Couvrez ensuite le couvercle, puis laissez-les dans la salle de croissance pendant deux heures. La méthode hypocotyl-pinçant. La petite pièce de parafilm, comme précédemment préparé, est mise sous la jonction racine-hypocotyl.Nous utilisons un forecep pour pincer doucement l’hypocotyl près du tissu racinaire, et appliquer soigneusement 0,1 microlitre CFDA sur le côté pincé et laisser la plante pendant deux heures. Les photos de neuf à 12 jours après la zone de coloration des plantes. Ils montrent tous le modèle vasculaire de coloration dans les cotyléons et les vraies feuilles.Seulement dans un cas très rare, la feuille de cotyledon a montré un modèle de coloration de demi-feuille. Donc, fondamentalement, les deux méthodes n’ont pas fait de différence dans le modèle de coloration des FC, mais si nous effectuons le chargement des colorants dans de plus en plus d’usines, nous constatons que les deux procédures donnent une différence significative dans l’efficacité. Avec la méthode de coupe des racines, environ 70% des plantes montrent le signal fluorescent dans la pousse.Mais l’efficacité peut être augmentée à 91% en utilisant la méthode hypocotyl-pincement. Nous avons également essayé la méthode de pincement des racines, mais cette méthode se traduire par l’efficacité encore plus faible, c’est environ 30%Par conséquent, il semble que la façon de charger le colorant ne tient pas compte de la différence de coloration. La différence réside très probablement dans les sites de chargement, qui pourraient être séparés par une barrière symplastique.Nous avons montré comment nous chargeons le CFDA dans les racines arabidopsis et l’hypocotyl. Nous avons utilisé deux procédures légèrement différentes, et ces deux procédures légèrement différentes entraînent une différence significative dans ce mouvement de sonde de bas en haut. Nous suggérons que cette méthode pourrait nous aider à identifier une barrière symplastique potentielle pour les signaux de tir dérivés des racines.

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