Name: Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Apprenez les protocoles d'essai de migration in vitro et de chambre cutanée dorsale chez la souris pour analyser la cicatrisation des plaies. Ces méthodes permettent d'évaluer les effets pharmacologiques sur la migration cellulaire.

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Nous remercions la Dre Petra Weissgerber et l'Unité Transgène de l'établissement animalier SPF (projet P2 de la SFB 894) de la Faculté de médecine et l'établissement animalier de l'Institut de chirurgie clinique et expérimentale de la Faculté de médecine de l'Université de Sarre, à Hombourg. Nous remercions le Dr Andreas Beck pour la lecture critique du manuscrit. Cette étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Sonderforschungsbereich (SFB) 894, projet A3 à A.B. et V.F.).

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées et exécutées conformément aux règlements d'éthique et aux comités de protection des animaux de la Sarre et de l'Université de la Sarre.
1 Culture cellulaire primaire et transfection de siRNA
REMARQUE : Dans la méthode décrite, des fibroblastes primaires sont utilisés. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. Dans cette expérience, le gène Cacnb3, codant la sous-unité Cav3 des canaux calciques à haute tension12 a été régulé vers le bas, montrant ainsi son rôle dans la migration cellulaire in vitro et la réparation des plaies cutanées in vivo4.
<ol><li>Préparation de l'ARNre : Avant de reconstituer les siRNAs, centrifuger brièvement les tubes pour s'assurer que le contenu est en bas. Reconstituer les siARN dans un tampon sans RNase de 100 L (100 mM d'acétate de potassium, 30 mM HEPES, pH 7,5) fourni par le fabricant à une concentration de 20 m. Il s'agit d'une solution de stock de siRNAs.</li>
	<li>Aliquot cette solution de stock à 10 l par tube (20 M de concentration) et stocker à -20 oC jusqu'à utilisation.</li>
	<li>À l'aide d'un marqueur permanent ultrafin, marquez une plaque de 6 puits avec une ligne horizontale au fond de chaque puits afin de pouvoir toujours identifier la même région d'égratignure d'intérêt et de suivre sa fermeture. REMARQUE : Des plaques de culture de 6 puits ont été utilisées dans cet analyse parce qu'elles sont assez grandes, pour fournir suffisamment d'espace et de flexibilité pour appliquer une égratignure cohérente, reproductible et verticale à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l sur la monocouche cellulaire. Si un nombre limité de cellules sont disponibles, une autre façon et probablement rentable serait d'utiliser des plaques de culture de 12 ou 24 puits.</li>
	<li>Fibroblastes primaires de plaque, isolés des souris sauvages-type et de 3-déficients4,dans une plaque de 6 puits à une densité de 5 x 105 cellules/puits en présence du milieu modifié d'aigle de 2 ml de Dulbecco (DMEM) complété avec le sérum bovin foetal de 10% (FCS). REMARQUE : 5 x 105 cellules par puits ont été établies pour la plaque de culture de 6 puits et pour les fibroblastes primaires de souris. Des tests peuvent être nécessaires si l'utilisation de plaques de culture cellulaire de 12 ou 24 puits ou d'autres types de cellules, qui pourraient être de taille différente. Les cellules doivent être manipulées dans un environnement stérile tel que les armoires de sécurité biologique s'occupent de classe II.</li>
	<li>Étiquetez la plaque de 6 puits avec le type de cellule, le génotype et la date.</li>
	<li>Déplacer la plaque de 6 puits dans l'incubateur de culture cellulaire et maintenir les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Le lendemain, sortez la plaque de l'incubateur, aspirez le milieu de culture cellulaire du puits, jetez-la et remplacez-la par un milieu de culture frais de 2,25 ml en l'ajoutant soigneusement contre la paroi du puits.</li>
	<li>Afin de transfect fibroblastes avec des siRNAs, utilisez un réactif de transfection à base de lipides comme recommandé par le fabricant.</li>
	<li>Pour chaque transfection, étiqueter deux tubes de microcentrifuge. Dans le premier, ajouter 9 L du réactif de transfection et le diluer avec un milieu sérique réduit de 150 l. Dans le deuxième tube, ajoutez 1,5 L siRNA(Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA brouillé comme un contrôle négatif) et diluez-le avec un milieu de sérum réduit de 150 l.</li>
	<li>Ajouter le siRNA dilué dans le tube contenant un réactif de transfection dilué et un vortex pendant 2 s. Incuber le mélange pendant 5 min à 21 oC.</li>
	<li>Étiquetez les puits avec Cacnb3 siRNA-1, Cacnb3 siRNA-2 ou siRNA brouillé. Ajouter 250 L du mélange de réactifs siRNA-transfection dans le sens de la chute aux cellules.</li>
	<li>Remettre la plaque de culture de 6 puits dans l'incubateur et maintenir les cellules à 37 oC et 5 % de CO2 pendant 72 h.</li>
	<li>Afin de vérifier l'efficacité du silençage des gènes Cacnb3, de recueillir des cellules transfectées et d'effectuer une analyse immunoblot tel que décrit précédemment4.</li>
</ol>2. Test de guérison des plaies in vitro (test de migration à gratter)
<ol><li>Sortez la plaque de culture cellulaire de l'incubateur et examinez les cellules au microscope à l'aide de l'objectif 10x. Commencez par l'égratignure seulement quand ils ont atteint 100% confluence. REMARQUE : Pour la précision et la reproductibilité, la confluence à 100 % est un facteur obligatoire pour commencer l'analyse de migration des rayures. Par conséquent, il est important de semer le même nombre de cellules dans les puits de culture, d'examiner chaque puits pour la confluence et d'appliquer la rayure au même moment (jour 0 confluence). Attendre plus longtemps après que les cellules atteignent 100% de confluence peut évoquer des réponses différentes.</li>
	<li>Une fois que la cellule atteint 100% de confluence, aspirez le milieu de culture hors du puits et jetez-le.</li>
	<li>Utilisez une pointe de pipette (200 l) pour créer manuellement une égratignure verticale à la ligne horizontale marquée au fond du puits, à travers la monocouche de cellules confluentes au milieu du puits.</li>
	<li>Rincer chaque puits deux fois avec 2 mL de saline tamponnée par phosphate (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mKHKH 2PO4, 8,1 mM Na2HPO4, pH 7,4) pour éliminer les facteurs libérés des cellules endommagées, des cellules lâches et des débris de la zone rayée. Ajouter 2 ml de PBS soigneusement contre la paroi du puits pour éviter de détacher les cellules de la culture cellulaire bien.</li>
	<li>Ajouter 2 ml de milieu de culture cellulaire contenant soit 10% de sérum ou 1% de sérum soigneusement à chaque puits. REMARQUE : Il est recommandé d'effectuer l'essai de rayure sous 10% de sérum et moins de 1% de sérum pour confirmer que l'effet observé est provoqué par la prolifération et la migration de cellules ou par la migration cellulaire seulement.</li>
	<li>Déplacez la plaque au stade du microscope et capturez des images lumineuses de la zone sans cellules (deux zones par puits) immédiatement après le grattage (t-0h) à un grossissement de 10x à l'aide d'un microscope léger. Pour imager toujours la même région de l'éraflure, utilisez la ligne horizontale, qui a été préparée par étape (1.3), et prenez une image au-dessus de cette ligne et une image au-dessous de cette ligne. Enregistrez des images comme TIFF ou JPEG.</li>
	<li>Étant donné que le stade du microscope ne maintient pas l'état de croissance cellulaire, déplacez la plaque vers l'incubateur de culture cellulaire et maintenez les cellules à 37 oC et 5 % de CO2.</li>
	<li>Après 6, 10 et 30 h, déplacez la plaque à nouveau au stade du microscope et capturez les images de la même manière que décrite à l'étape 2.6. REMARQUE : Ces points de temps ont été établis pour la procédure décrite et pour les fibroblastes primaires. Au cours de la première expérience pilote, plus de points de temps ont été testés pour voir à quelle vitesse les fibroblastes repeuplent l'écart. Bien que 0, 6, 10 et 30 h soient des points de départ raisonnables, les enquêteurs devraient optimiser et établir les points de temps appropriés pour chaque application et pour chaque type de cellule. L'alternative la plus précise, si elle est disponible, serait d'utiliser la microscopie en accéléré.</li>
	<li>À l'aide de L'imageJ13, quantifiez la zone initiale exempte de cellules (100 %) et la zone restante après 6, 10 et 30 h (figure 1). Le pourcentage de la zone d'égratignure repeuplée par les cellules migratrices est ensuite calculé par rapport à la zone initiale de rayures.</li>
</ol>3. Analyse de la zone de rayures
<ol><li>Ouvrez le logiciel ImageJ13.</li>
	<li>Téléchargez la première image en tant que JPEG (par exemple, 24 bits images RGB 1360x1024) en laissant tomber l'image dans la barre de menu ImageJ.</li>
	<li>Sélectionnez le bouton de sélection à main levée et marquez la zone sans cellules</li>
	<li>Cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesure. Une fenêtre avec les résultats apparaîtra contenant la valeur de la zone.</li>
	<li>Transférez cette valeur dans une feuille de calcul d'analyse.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.2-3.5 pour chaque image à partir du point de temps 0 h, puis recommencez pour la prochaine fois les points 6, 10 et 30 h.</li>
	<li>Calculez le pourcentage de zone de rayures repeuplée par les cellules migratrices après 6, 10 et 30 h pour chaque égratignure en utilisant l'équation suivante : <img alt="Équation de test scratch pour l’analyse de la migration cellulaire. Formule : pourcentage de repeuplement cellulaire." src="/files/ftp_upload/59608/59608eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> une zone libre de cellules de l'égratignure initiale, b - zone libre de cellules après 6 h</li>
	<li>Calculer la moyenne et l'erreur standard de la moyenne (S.E.M.) pour le pourcentage de zone de rayurere repeuplée par les cellules de migration après 6 h. Afficher les données sous forme de graphique à barres de colonne ou de parcelle de dispersion.</li>
</ol>4. In vivo peau plaie curatif d'analyse
REMARQUE : Les mâles de type sauvage C57BL/6 (8-12 semaines avec un poids corporel de 22-26 g) et les souris de Type Cav3 comme contrôle sont utilisés pour cette étude.
<ol><li>Un jour avant de commencer l'expérience, autoclavetous les instruments chirurgicaux, vis, écrous et cadres en titane à utiliser pour la préparation de la chambre de skinfold. REMARQUE : Le cadre en titane est composé de deux moitiés complémentaires symétriques et il dispose d'une fenêtre d'observation circulaire où la plaie sera appliquée et suivie d'une microscopie (voir Figure 2a).</li>
	<li>Anesthésiez une souris sauvage ou déficiente de 3 (22-26 g de poids corporel) par injection intrapéritonéale (i.p.) de 0,1 mL de saline/10 g de poids corporel contenant un mélange de kétamine (75 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (25 mg/kg de poids corporel). Vérifiez la profondeur de l'anesthésie par l'absence de réponse à une pincée d'orteil. REMARQUE: Cette injection donne environ 30 min d'anesthésie chirurgicale et la profondeur de l'anesthésie doit être contrôlée par la procédure chirurgicale, en vérifiant les réflexes de la souris.</li>
	<li>Pour éviter la sécheresse ou les dommages des yeux, appliquez l'onde ophtalmique sur les deux yeux et répétez l'application si nécessaire.</li>
	<li>Raser soigneusement le dorsum souris, à l'aide d'un rasage électrique suivie de l'application d'une crème de dépillation à la zone rasée pour enlever les cheveux restants. Veillez à ne pas blesser la peau de la souris. Laisser la crème de dépillation pendant environ 10 min pour enlever complètement tous les cheveux.</li>
	<li>Préparer la chambre en titane en prenant une partie du cadre symétrique de la chambre en titane et fixer les vis de connexion avec des noix sur un côté. Ces écrous serviront d'espaceur pour garder 400-500 m entre les deux parties symétriques de la chambre pour éviter la compression des vaisseaux sanguins dans la peau.</li>
	<li>Retirer la crème de l'arrière de la souris et nettoyer la région sans poils avec de l'eau chaude du robinet (35-37 oC).</li>
	<li>Assurez-vous que l'endroit où effectuer la chirurgie est propre, chaud (37 oC) et humidifié.</li>
	<li>Désinfecter la zone sans poils de la souris avec un désinfectant pour la peau. Prenez un pli de la peau arrière de la souris devant une source lumineuse et placez la ligne médiane de la double couche de la peau où la chambre en titane sera implantée. Après cela, fixer le skinfold avec une suture de polypropylène cranially et caudally et serrer l'autre côté de la suture sur une grille en métal pour soulever la peau pliée de souris. Ajustez la hauteur du support pour permettre à la souris de s'asseoir confortablement.</li>
	<li>Implantez la chambre de titane dans le pli de la peau arrière de la souris de manière à sandwich la couche de peau dorsal pliée entre les deux moitiés symétriques du cadre de titane. Attachez la première moitié du cadre en titane par des sutures en polypropylène sur son bord supérieur à l'arrière du skinfold dorsal. REMARQUE: Sur le cadre en titane, il ya 8 trous sur le bord supérieur (Figure 2a) et la peau pliée doit être bien fixé par des sutures en polypropylène sur chacun des huit trous.</li>
	<li>Avant de passer à l'étape suivante, vérifiez les réflexes de la souris pour vous assurer que la profondeur de l'anesthésie est maintenue.</li>
	<li>À la base du skinfold, passer les deux vis de connexion, attachées à la première moitié de la chambre en titane, pour pénétrer le skinfold de l'arrière vers le côté avant. Faire de petites incisions sur la peau (à l'aide de ciseaux fins) pour aider à lisser la pénétration des vis de connexion.</li>
	<li>Détachez la souris de la grille et placez-la sur une position latérale. Placez la deuxième moitié complémentaire de la chambre en titane sur les 3 vis de connexion (voir Figure 2a) et appliquez une légère pression avec les doigts afin de passer ces vis à travers la seconde moitié du cadre en titane. Ensuite, fixer les deux pièces symétriques avec des noix en acier inoxydable.</li>
	<li>Portez une attention particulière à l'étanchéité des vis à cette étape, car elle pourrait se détacher, si elle est trop lâche. En revanche, s'il est trop serré, il serrera le skinfold, réduira le flux sanguin et peut mener à l'affaiblissement de tissu et à la nécrose. REMARQUE : Les écrous préparés à l'étape 4.5 servent d'espaceur pour garder une distance de 400-500 m entre les deux moitiés symétriques de la chambre en titane. Les écrous doivent être serrés jusqu'à ce qu'une légère résistance soit ressentie.</li>
	<li>Couper la partie restante des vis à l'aide de pinces. REMARQUE : Il est nécessaire à cette étape d'utiliser des lunettes de sécurité de laboratoire pour la protection des yeux au cas où la vis se détache dans le mauvais sens.</li>
	<li>Marquer la zone de la plaie par un poinçon de biopsie standardisé (2 mm de diamètre), au centre de la peau dans la fenêtre d'observation (voir Figure 2a) de la chambre de pli de peau afin d'assurer la taille des plaies reproductibles.</li>
	<li>En utilisant des forceps et des ciseaux fins, créer une plaie circulaire dans la zone marquée en enlevant la peau complète avec l'épiderme et le derme. La zone de la plaie finale sera d'environ 3,5-4,5 mm2, voir Figure 2b. Nettoyer la plaie à l'air salin de 0,5 ml (0,9 % NaCl, 37 oC).</li>
	<li>Couvrez la plaie d'un bordereau en verre et fixez ce bordereau en verre avec un anneau en claquettes à l'aide de la pince à anneau sur la chambre en titane.</li>
	<li>Immédiatement après la fin de l'intervention chirurgicale, placez la souris au stade d'imagerie d'un stéréomicroscope équipé d'une caméra et prenez des images (jour 0) sous illumination. Utilisez le grossissement 40X et enregistrez les images pour l'analyse hors ligne future. REMARQUE : L'enquêteur doit examiner les images immédiatement après la capture pour s'assurer que la qualité est suffisante pour de futures analyses hors ligne. La préparation de la chambre de skinfold et la performance de la blessure de peau prend environ 30 minutes.</li>
	<li>Gardez la souris à un endroit chaud pendant la récupération de l'anesthésie pendant au moins 2 h. Par la suite, transférez les souris dans des cages individuelles à l'établissement animalier (cycle lumière/obscurité de 12 h) et assurez-vous que les souris ont accès à la nourriture et à l'eau.</li>
	<li>Trois jours après la blessure placer la souris dans un anti-souris et fixer la correction sur le dessus de l'étape d'imagerie.</li>
	<li>Placez la scène sous un stéréomicroscope équipé d'une caméra. Prenez des images sous l'éclairage avec le grossissement 40x, enregistrez toutes les images et enregistrez-les pour de futures analyses hors ligne</li>
	<li>Répétez les étapes 4.20 et 4.21 encore au jour 6, 10 et jour 14 post-blessure.</li>
	<li>Utilisez les images de la plaie, pour l'analyse hors ligne dans ImageJ13. La zone de la plaie au jour 0 est considérée comme 100 % et la fermeture de la plaie au fil du temps est tracée par rapport à la zone de la plaie initiale. Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 2c,d.</li>
	<li>Calculer le pourcentage (%) de la zone de la plaie à chaque moment en utilisant l'équation suivante : <img alt="Formule de calcul de la cicatrisation, pourcentage de la surface de la plaie au fil du temps dans l’équation mathématique." src="/files/ftp_upload/59608/59608eq2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> x: point de temps (jour 0, 3, 10 ou 14), a: zone de blessure au jour 0, b: zone de blessure au point de temps x</li>
</ol>

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<li>Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transparent+access+chamber+for+the+rat+dorsal+skin+fold%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold.</a> Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).</li>
<li>Deoliveira, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ear+punch+model+for+studying+the+effect+of+radiation+on+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing.</a> International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> Journal of Visualized Experiment. (75), e50265(2013).</li>
<li>Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juglone+ameliorates+skin+wound+healing+by+promoting+skin+cell+migration+through+Rac1%2FCdc42%2FPAK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway.</a> Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Dans ce manuscrit, nous décrivons un analyse de guérison in vitro et in vivo de blessure et corrélons les résultats obtenus. Pour l'analyse in vitro, nous avons utilisé les fibroblastes primaires de souris4,14,15 qui jouent un rôle important dans la cicatrisation des plaies et le remodelage des tissus11. D'autres types de cellules adhérentes qui poussent sous forme de monocouches (p. ex. cellules épithéli...

La cicatrisation des plaies cutanées commence immédiatement après la blessure cutanée afin de restaurer l'intégrité de la peau et de protéger l'organisme contre les infections. Le processus de cicatrisation des plaies passe par quatre phases qui se chevauchent; coagulation, inflammation, nouvelle formation de tissu, et tissu transformant1. La migration cellulaire est cruciale pendant ces phases. Les cellules inflammatoires, les cellules immunitaires, les kératinocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes sont activés à différents moments et envahissent la zone de la plaie2. Les méthodes d'enquête sur la cicatrisation des plaies in vitro et in vivo sont d'un grand intérêt non seulement pour comprendre les mécanismes sous-jacents, mais aussi pour tester de nouveaux médicaments et pour développer de nouvelles stratégies visant à améliorer et à accélérer la cicatrisation des plaies cutanées.
Pour surveiller et analyser la migration cellulaire, l'analyse de la migration des rayures peut être utilisée. On l'appelle souvent l'in vitro, l'invitro, comme l'exemple de guérison des plaies. Cette méthode nécessite une installation de culture cellulaire3. Il s'agit d'une procédure simple, il n'y a pas besoin d'équipement haut de gamme et l'analyse peut être effectuée dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Dans cet analyse, une zone sans cellules est créée par la perturbation mécanique d'une monocouche cellulaire confluente, de préférence des cellules ou des fibroblastes épithélials ou endothéliaux. Les cellules sur le bord de l'éraflure migreront afin de repeupler l'espace créé. La quantification de la diminution de la zone exempte de cellules au fil du temps ressemble au taux de migration et indique le temps dont les cellules ont besoin pour combler l'écart. À cette fin, les chercheurs peuvent utiliser soit des cellules très isolées de souris WT ou des souris dépourvues d'un gène d'intérêt4, ou des cellules immortalisées disponibles à partir de dépôts cellulaires fiables. L'exemple de rayure permet d'étudier l'influence des composés pharmacologiquement actifs ou l'effet des CDNA ou des siARN transfectés sur la migration cellulaire.
In vivo, la cicatrisation des plaies est un processus physiologique complexe, nécessitant différents types de cellules, y compris les kératinocytes, les cellules inflammatoires, les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales afin de restaurer l'intégrité physique de la peau aussi rapidement que possible1 . Différentes méthodes pour étudier la cicatrisation in vivo des plaies ont été développées et utilisées au cours des5,6,7,8. La chambre de skinfold dorsal décrite dans cet article a été précédemment employée pour des essais de guérison de blessure9. Il est utilisé comme une préparation de chambre de skinfold dorsal modifiée pour des souris. Le modèle de chambre peau replié modifié présente plusieurs avantages. 1) il minimise la contraction de peau, qui empêche d'observer le processus de guérison de blessure et pourrait influencer la réparation de blessure chez les souris. 2) Cette chambre fait usage de couvrir la plaie avec un couvercle en verre, réduisant des infections de tissu et dessiccation, qui pourrait retarder le processus de guérison. 3) Le flux sanguin et la vascularisation peuvent être directement surveillés. 4) Il permet l'application topique répétitive des composés pharmacologiquement actifs et des réactifs afin de traiter la blessure et d'accélérer la guérison9,10.
Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à haute tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies cutanées à l'aide de deux protocoles indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Pour l'évaluation in vitro, nous avons utilisé des fibroblastes primaires, ces cellules expriment le gène Cacnb3 codant la protéine Cav3, mais manquent d'afflux De Ca2 ou de courants Ca2 dépendants de la tension. Nous avons décrit une nouvelle fonction de Cav-3 dans ces fibroblastes : Cav-3 se lie au récepteur inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3R) et les contraintes de libération de calcium du réticulum endoplasmique. La suppression du gène Cacnb3 chez la souris conduit à une sensibilité accrue de l'IP3R pour IP3, la migration cellulaire améliorée et la réparation accrue des plaies cutanées4.

<table><tbody><tr><td>0,9 % NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml seringues</td><td>BD Plastipak</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>6 puits plaque</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie</td><td>Kai Industries</td><td>48201</td><td>2 mm</td></tr><tr><td>Cacnb3 siRNA de souris Oligo Duplex (Locus ID 12297)</td><td>Origene</td><td>SR415626</td><td></td></tr><tr><td>Crème</td><td></td><td></td> d’épilation <td>toute épilation crème</td></tr><tr><td>Dexpanthénol 5 % (BEPANTHEN)</td><td>Bayer</td><td>3400935940179.00</td><td>(BEPANTHEN)</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de dihydroxylidinothiazine (Xylazine)</td><td>Bayer Health Care</td><td></td><td>Rompun 2 %</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco par life technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gibco par life technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Hexagone full nut</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de kétamine</td><td>Zoetis</td><td></td><td>KETASET</td></tr><tr><td>Microscope optique</td><td>Keyence, Osaka, Japon</td><td>BZ-8000 Des</td><td>microscopes similaires pourraient être utilisés</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778075</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pinces</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-ciseaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souris de contention</td><td>Maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td></td><td></td><td></td>normaux</tr><tr><td>Objectif</td><td>Nikon</td><td>plan apo 10x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco by life technologies</td><td>51985-026</td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td></td><td></td><td></td>en polypropylène</tr><tr><td>Peau de tournevis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> désinfectant (octeniderm)</td><td>Sch&uuml ; lke & Mayr GmbH</td><td>118212</td><td></td></tr><tr>Vis <td></td><td></td><td></td>à<td>tête cylindrique fendue</td></tr><tr><td>Anneau</td><td></td><td></td><td></td>élastique</tr><tr><td>Pince</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>à anneau élastique Microscope chirurgical avec caméra</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>Cadres en titane pour la chambre de pliage cutané</td><td>IROLA</td><td>160001</td><td>Halteblech</td></tr><tr><td>M Pieux</td><td></td><td></td> de fil<td></td></tr></tbody></table>

scratch migration assay et dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing scratch migration assay and dorsal skinfold chamber for in vitro and in vivo analysis of wound healing scratch migration

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

La cicatrisation des plaies cutanées est une préoccupation majeure pour les patients souffrant de diabète et pour les personnes âgées, et il est nécessaire d'un traitement efficace. Des approches in vitro et in vivo appropriées sont essentielles pour l'identification de nouvelles molécules cibles pour les traitements médicamenteux afin d'améliorer le processus de guérison des plaies cutanées. Nous avons identifié la sous-unité no 3 des canaux calciques à rayons de tension (Cav-3) comme une molécule cible potentielle pour influencer la cicatrisation des plaies dans deux essais indépendants, c'est-à-dire l'analyse de migration des rayures in vitro et le modèle de chambre de pli de peau dorsal in vivo. Fibroblastes embryonnaires primaires de souris (MEFs) aiguement isolés des souris sauvages (WT) et Cav 3-déficientes (Cav3KO) ou fibroblastes aiguement isolés des souris de WT traitées avec siRNA pour réguler vers le bas l'expression du gène de Cacnb3 , l'encodage Cav3,ont été utilisés. Une égratignure a été appliquée sur une monocouche de cellules confluentes et la fermeture d'écart a été suivie en prenant des images microscopiques aux points de temps définis jusqu'à repeupler complètement l'écart par les cellules migrantes. Ces images ont été analysées, et le taux de migration cellulaire a été déterminé pour chaque condition. Dans un analyse in vivo, nous avons implanté une chambre de pli de peau dorsal sur des souris WT et Cav3 KO, appliqué une plaie circulaire définie de 2 mm de diamètre, couvert la plaie avec un couvercle en verre pour la protéger contre les infections et la dessiccation, et surveillé la fermeture macroscopique de la plaie au fil du temps. La fermeture des plaies était significativement plus rapide chez les souris cicnb3-gène-déficientes. Étant donné que les résultats des essais in vivo et in vitro sont bien corrélés, l'analyse in vitro peut être utile pour le dépistage à haut débit avant de valider les coups in vitro par le modèle de guérison des plaies in vivo. Ce que nous avons montré icipour les souris ou les cellules de type sauvage et cav3-déficients pourrait également être applicable pour des molécules spécifiques autres que Cav3.

L'égratignure a été réalisée sur un monocouche de cellules confluentes de type sauvage et de MEF déficients(figure 1c). Après avoir effectué le « scratch » à l'aide d'une pointe de pipette de 200 l, les cellules des deux génotypes migrent dans la zone de rayures et comblent l'écart. Les images ont été prises après 6, 10 et 30 h (Figure 1a). La migration cellulaire a été quantifiée en pourcentage (%) de la zone de rayurere repeup...

Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.

Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Le besoin des insurgés pour le traitement des blessures de la peau. Pour identifier vos molécules cibles pour les traitements médicamenteux, des systèmes de test in vitro et in vivo sont nécessaires. Les systèmes appropriés sont l’essai in vitro d’éraflure, et la chambre dorsale in vivo de pli de peau.Les deux sont des procédures simples pour surveiller la migration cellulaire et la cicatrisation des plaies cutanées, en l’absence et la présence de composés pharmacologiquement actifs. Bien que les deux techniques soient simples, les chercheurs devraient pratiquer l’application de rayures. Et l’implantation dorsale de chambre pliante de peau, et blessante pour obtenir des résultats fiables et reproductibles.La démonstration des interventions sera effectuée par le Dr Matthias Laschke, chirurgien et professeur à l’Institut de chirurgie clinique et expérimentale. Avant de commencer la procédure, utilisez un marqueur permanent ultra fin pour marquer une plaque de six puits par type de cellule, avec une ligne horizontale au bas de chaque puits pour délimifier la région de rayures pour chaque culture. Les explosions primaires de fibres de plaque suivante isolées de type sauvage et bêta 3 souris déficientes, dans une plaque de six puits à 5 fois 10 à la cinquième fibre souffle par concentration de puits.Dans 2mL de DMEM complété avec le sérum bovin foetal de 10%. Étiquetez les plaques avec le type de cellule, le génotype et la date. Et placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.Le lendemain matin, ajoutez 9 micro litres de chaque réaccélément de transfection à base de lipides d’intérêt, à des tubes individuels de micro centrifugeuse contenant 150 micro litres de sérum moyen réduit par tube. Ajouter 1,5 micro litres de siRNA à un deuxième tube de micro centrifugeuse par réaugnant transfection contenant 150 micro litres de sérum moyen réduit par tube. Et mélanger chaque solution siRNA avec un seul tube de solution de réaccente de transfection.Après avoir brièvement vortexing placer les mélanges à 21 degrés Celsius pendant 5 minutes. Pendant l’incubation, remplacer soigneusement le superné dans chaque puits. Avec 2,25 mL de culture fraîche sur le côté des puits.À la fin de l’incubation ajouter 250 micro litres du mélange approprié de réaccfection transfection siRNA, laisser tomber sage dans chaque puits correspondant de cellules. Et retourner les plaques à l’incubateur de culture cellulaire pendant 72 heures. Lorsque les cellules ont atteint 100% confluent, jeter la culture supernatant de chaque puits.Et utilisez une pointe pipette de 200 micro litres pour créer une égratignure dans le monocouche à cellules confluentes. Verticale à la ligne horizontale marquée au bas de chaque puits. Rincez ensuite soigneusement chaque puits blessé 2 fois avec 2mL de PPS par lavage.Pour éliminer tous les facteurs libérés des cellules endommagées, des cellules lâches ou des débris de la zone rayée. Après le deuxième lavage ajouter 2mL de culture cellulaire fraîche moyenne complétée par 1 ou 10 pour cent sérum à chaque puits. Et capturer des images des blessures dans chaque plaque sur la scène d’un microscope léger.Immédiatement après le grattage à un grossissement 10X. Retournez ensuite la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Continuer à capturer des images aux points de temps expérimentaux appropriés pour les prochaines 30 heures.À la fin de l’expérience quantifier la zone initiale libre de cellules et la zone restante après 6, 10 et 30 heures de culture. Déterminer le pourcentage de la zone d’éraflure repeuplée par les cellules migrées par rapport à la zone de éraflure initiale. Après avoir confirmé un manque de réponse à pincement d’orteil, dans le type sauvage ou bêta trois KO C57 noir six souris, raser soigneusement le dorsum.Et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. Appliquer de la crème depilatory pour éliminer les cheveux restants. Retirer la crème après 10 minutes.Pour préparer la chambre en titane, fixez une partie du cadre symétrique de chambre en titane, avec les vis de raccordement avec des écrous. Maintenir de 400 à 500 micromètres entre les deux parties symétriques de la chambre. Pour éviter la compression des vésicules sanguines dans la peau.Désinfecter la peau exposée avec 70% d’éthanol. Et saisir un pli de la peau en face d’une source de lumière. Placez la ligne médiane de la double couche de peau à l’endroit où la chambre de titane sera implantée.Et cranially et caudally fixer le pli de la peau avec une suture en polypropylène. Serrer l’autre côté de la suture sur une grille métallique pour soulever la peau pliée. Et ajustez la hauteur de la grille pour permettre à la souris de s’asseoir confortablement.Suture le premier cadre de la chambre de titane par sutures de polypropylène sur elle bord supérieur à l’arrière du pli de la peau dorsale. Après la reconfirmation de la sedation utiliser des ciseaux fins pour faire de petites incisions dans la peau. Et passer les deux vis de connexion attachées à la première moitié de la chambre de titane à travers la base du pli de la peau.Retirez la souris de la grille et placez l’animal dans une position latérale. Placez la deuxième moitié gratuite de la chambre en titane sur les 3 vis de raccordement. Et appliquez manuellement une légère pression pour passer ces vis à travers la seconde moitié du cadre en titane.La couche de peau pliée est maintenant prise en sandwich entre les deux moitiés symétriques du cadre en titane. Fixez ensuite les deux parties symétriques avec des écrous en acier inoxydable. À l’aide d’un poinçon normalisé de biopsie de 2 mL de diamètre, marquer la zone de la plaie au centre de la peau, dans la fenêtre d’observation de la chambre pliante de la peau.Et utilisez des forceps fins et des ciseaux pour enlever l’épiderme et le derme entiers dans la marque. Pour créer une plaie circulaire. Nettoyez la plaie carrée de 3 ans et demi à 4 milometer avec 0,5 mL de salin de stérilisation.Et couvrez la plaie d’un couvre-verre. Utilisez la pince à anneau snap sur la chambre en titane pour fixer le coverslip en place. Et transférez immédiatement la souris au stade d’imagerie d’un stéréomicroscope.Puis l’image de la plaie à un grossissement 40X. Avant de placer la souris dans une cage avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Après avoir créé une égratignure à l’aide d’une pointe de pipette de 200 micro litres comme démontré, dans cette expérience représentative, les cellules des deux génotypes ont migré dans la zone d’égratignure et fermé l’écart.La migration cellulaire a ensuite été quantifiée en pourcentage de la zone d’éraflure repeuplée par les cellules migrables 6 heures après l’exécution de l’égratignure. Par exemple, dans cette expérience, la migration des souffles de fibres déficientes Cav beta 3 a fermé la zone d’éraflure beaucoup plus tôt que les explosions de fibres provenant de souris de type sauvage. Pour confirmer l’effet dépendant de la bêta 3 cav observé dans les explosions de fibres déficientes cav beta 3, des explosions de fibres de type sauvage ont été transfectées avec du siRNA pour réguler vers le bas la protéine Cav beta 3.Les explosions de fibres traitées avec les siARN spécifiques de la bêta cav 3 se sont comportées comme des explosions de fibres déficientes bêta 3. Pour comparer la cicatrisation des plaies cutanées entre les deux génotypes, la zone de la plaie dans la chambre pliante de la peau a été photographiée directement après avoir été blessée. Et la blessure a été photographiée au cours des 2 semaines suivantes.La taille des blessures a été mesurée sur les images et la zone de la plaie, un jour donné a été exprimée comme, le pourcentage de la zone de la plaie initiale. Comme prévu, le taux de fermeture des plaies a été augmenté chez les souris déficientes Cav beta 3 par rapport aux témoins de type sauvage. Assurez-vous d’appliquer une pression égale sur la pointe pipette, pour chaque égratignure et de faire correspondre les rayures aux lignes marquées sur le fond de la plaque aussi étroitement que possible.La fenêtre d’observation de la chambre dorsale pliante de la peau peut être ouverte à tout moment pendant le processus de guérison. Permettant l’application topique de différents composés pharmacologiques actifs. Il est également possible d’exciser la zone blessée à différents stades du processus de guérison.Pour l’analyse biochimique ou histologique des protéines moléculaires.

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