Name: Étudier linfection à Cryptosporidium dans les systèmes de culture organoïde humaine dérivés de tissus 3D par microinjection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Découvrez la purification de sporozoïtes et la microinjection pour étudier l'infection à Cryptosporidium parvum dans des organoïdes intestinaux et respiratoires humains. Ces protocoles permettent de visualiser les interactions hôte-pathogène avec précision.

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Nous sommes reconnaissants à Deborah A. Schaefer de l'École des sciences biomédicales animales et comparées, College of Agriculture and Life Sciences, University of Arizona, Tucson, AZ, Usa pour nous aider avec la production et l'analyse d'oocyst. Nous remercions également Franceschi Microscopy and Imaging Center et D.L. Mullendore de l'Université d'État de Washington pour la préparation et l'imagerie tem des ovocytes organoïdes isolés.
D.D. est le bénéficiaire d'une subvention VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. est le bénéficiaire d'une subvention VENI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO-ALW, 863.14.002) et a été soutenu par les bourses Marie Curie de la Commission européenne (Proposition 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre de l'accord de subvention avancée no 67013 de l'ERC et de la NIAIH des NIH dans le cadre de R21 AT009174 à RMO. Ce travail fait partie de l'Institut Oncode, qui est en partie financé par la Société néerlandaise du cancer et a été financé par une subvention de la Société néerlandaise du cancer.

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<li>Feng, H., Nie, W., Sheoran, A., Zhang, Q., Tzipori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+enhance+invasiveness+of+Cryptosporidium+spp.+into+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bile acids enhance invasiveness of Cryptosporidium spp. into cultured cells.</a> Infection and Immunity. 74 (6), 3342-3346 (2006).</li>
<li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cpgp40%2F15+in+Toxoplasma+gondii%3A+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li>
<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La culture des parasites de Cryptosporidium dans les organoïdes intestinaux et de voie aérienne fournit un modèle précis pour étudier des interactions hôte-parasite10 mais a également beaucoup d'autres applications. Par exemple, les méthodes actuelles de sélection et de propagation des parasites cryptosporidium génétiquement modifiés nécessitent un passage chez la souris19 qui ne permet pas l'isolement des parasites qui ont des modifications essentielles p...

Le développement de médicaments ou de vaccins pour le traitement et la prévention de l'infection à Cryptosporidium a été entravé par l'absence de systèmes in vitro qui imitent précisément la situation in vivo chez l'homme1,2. Bon nombre des systèmes actuellement disponibles ne permettent que l'infection à court terme (5 jours) ou ne soutiennent pas le cycle de vie complet du parasite3,4. D'autres systèmes qui permettent le développement complet du parasite sont basés sur des lignées cellulaires immortalisées ou des lignées de cellules cancéreuses qui ne récapitulent pas fidèlement la situation physiologique chez l'homme5,6,7 . Les organoïdes ou « mini-organes » sont des structures dérivées de tissus 3D qui sont cultivées dans une matrice extracellulaire complétée par divers facteurs de croissance spécifiques aux tissus. Des organoïdes ont été développés à partir de divers organes et tissus. Ils sont génétiquement stables et récapitulent la plupart des fonctions des organes de leur origine, et peuvent être maintenus en culture pendant de longues périodes de temps. Nous avons développé une méthode pour infecter les organoïdes intestinaux et pulmonaires humains avec Cryptosporidium qui fournit un modèle in vitro précis pour l'étude des interactions hôte-parasite pertinentes à la cryptosporidiose intestinale et respiratoire8 ,9,10,11,12,13. Contrairement à d'autres modèles de culture publiés, le système organoïde est représentatif des interactions réelles des parasites hôtes, permet d'achever le cycle de vie afin que toutes les étapes du cycle de vie du parasite puissent être étudiées, et maintient la propagation du parasite pour un jusqu'à 28 jours10.
Cryptosporidium parvum est un parasite apicomplexan qui infecte l'épithélium des voies respiratoires et intestinales, causant une maladie diarrhéique prolongée. Le stade environnemental résistant est l'oocyste, trouvé dans les aliments et l'eau contaminés14. Une fois ingérés ou inhalés, l'oocyste excyste et libère quatre sporozoites qui se fixent aux cellules épithéliales. Sporozoites glisser sur les cellules hôtes et engager les récepteurs cellulaires hôtes, mais le parasite n'envahit pas complètement la cellule, et semble induire la cellule hôte pour l'engloutir15. Le parasite, qui est intériorisé dans un compartiment intracellulaire mais extracytoplasmique, reste à la surface apicale de la cellule, se reproduisant dans un vacuole parasitophore. Il subit deux séries de reproduction asexuée, un processus appelé mérogonie. Pendant la mérogonie, les meronts de type I se développent qui contiennent huit mériozoites qui sont libérés pour envahir de nouvelles cellules. Ces mériozoites envahissent de nouvelles cellules pour se développer en meronts de type II contenant quatre mériozoites. Ces mériozoites, lorsqu'ils sont libérés, infectent les cellules et se développent en macrogamonts et microgamonts. Les microgametes sont libérés et fécondent les macrogametes produisant des zygotes qui mûrissent en oocystes. Les oocystes matures sont ensuite libérés dans le lumen. Les okys sont soit à parois minces qui excystent immédiatement pour réinfecter l'épithélium, soit à d'épais parois s'éparpés qui sont libérés dans l'environnement pour infecter le prochain hôte14. Toutes les étapes du cycle de vie de Cryptosporidium ont été identifiées dans le système de culture organoïde précédemment développé par notre groupe10.
Depuis organoïdes humains reproduisent fidèlement les tissus humains9,11,13, et de soutenir toutes les étapes réplicatrices de Cryptosporidium10, ils sont le système idéal de culture tissulaire pour étudier Biologie du cryptosporidium et interactions hôte-parasite. Ici nous décrivons les procédures pour infecter des organoïdes avec des oocysts de Cryptosporidium et des sporozoites excystés, et isoler les nouveaux oocysts produits dans ce système de culture de tissu.

<table><tbody><tr><td>Extrait de membrane basale (matrice extracellulaire)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td><fort>&nbsp ; Anticorps </td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo (anticorps spécifique de l’oocyste)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Concentration finale = Utiliser 2-3 gouttes/lame</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM coated Magnetic billes</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dynamag 15</td><td>rack Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 rack</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp ; Filtres à membrane en polycarbonate isopore - 3&micro ; m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Colorant vert rapide</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp ; &nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Micro-injecteur Femtojet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Capillaires en verre de 1 mm de diamètre</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Matrigel (matrice extracellulaire)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tube microfuge 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Embouts de micro-chargeur</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette P-97</td><td>Instrument à obturateur</td><td>P-97</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB&</td><td>nbsp ;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Hypoclorite de sodium (utiliser 5 %)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Super stick slides</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Porte-filtre en polycarbonate</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Sel de sodium d’acide taurocholique hydraté</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Agent de montage Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td><fort>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</fort></td><td><fort>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td><td>Quantité finale</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mL de stock dans 500 mL de DMEM</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL de stock dans 500 mL de DMEM</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 mL de stock dans 500 mL de DMEM</td></tr><tr><td><fort> ORGANOÏDE INTESTINAL (Milieu d’expansion)</fort></td><td><fort>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </fort></td><td><fort>Concentration finale</fort></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0,5 & micro ; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td><td>jusqu’à 100 ml</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>Sur place*</td><td>&nbsp ;</td><td>10 %</td></tr><tr><td>Inhibiteur de P38 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &micro ; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL media</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>Sur place*</td><td>&nbsp ;</td><td>20 %</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>Sur place*</td><td>&nbsp ;</td><td>50 %</td></tr><tr><td>Sur place* - des lignées cellulaires seront fournies sur demande</td><td>.</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td></tr><tr><td><FORT>ORGANOÏDES INTESTINAUX-OMD (Milieu de différenciation)</fort></td>&<td>nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td><td>Pour différencier les organoïdes, des organoïdes de l’intestin grêle en expansion ont été cultivés dans un milieu riche en Wnt pendant six à sept jours après la séparation, puis cultivés dans un milieu de différenciation (retrait de Wnt, de nicotinamide, de SB202190, dans un milieu de différenciation (retrait de Wnt, de nicotinamide, de SB202190, de prostaglandine E2 d’un milieu riche en Wnt ou OME)</td></tr><tr><td>LUNG ORGANOID MEDIA- LOM (Differentiation media)</td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td><td>Concentration finale</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp ;</td><td>&nbsp ;</td><td>jusqu’à 100 ml</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0.0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Contacter l’entreprise directement</td><td>10 %</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro ; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2.5 &micro ; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Contacter directement l’entreprise</td><td>10</td></tr><tr><td> %Tampon réducteur (pour la remise en suspension des oocystes et des sporozoïtes pour injection)</td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </fort></td><td><fort>Concentration finale</fort></td></tr><tr><td>L-Glutathion réduit</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0,5 &mu ; g/&mu ; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0.5 &mu ; g/&mu ; L de OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu ; g/&mu ; L d’OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Acide linoléique</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &mu ; g/mL d’OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625-10MG</td><td>0.5 &mu ; g/&mu ; L de tampon bloquant OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td> (pour la coloration par immunofluorescence)</td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </forte></td><td><forte>Concentration finale</forte></td></tr><tr><td>Âne/Chèvre sérum</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2 %</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Jusqu’à 100 mL</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0,1</td></tr><tr><td> %<fort>Liste des anticorps utilisés </forte></td><td><forte>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td><td>&nbsp ; </td></tr><tr><td>Alexa 568 chèvre anti-lapin</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Dilution-1:500 ; RRID : AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Anticorps marqué à la fluorescéine Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>Dilution A400FLK</td><td>- 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads- Perles magnétiques enrobées d’anticorps monoclonal réactif</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>Dilution-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Dilution-1:1 000 ; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>Phalloïdine-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Dilution-1:1 000 ; RRID :</td></tr><tr><td>Anticorps anti-gp15 de AB_2620155 Rabbit généré par R. M. O' Connor (co-auteur).</td><td>Sur demande</td><td>Sur demande</td><td>Dilution-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>Dilution- 1:200</td></tr></tbody></table>

Étudier l'infection à cryptosporidium dans les systèmes de culture organoïde humaine dérivés de tissus 3d par microinjection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum est l'une des principales causes de la maladie diarrhéique humaine. Pour comprendre la pathologie du parasite et développer des médicaments efficaces, un système de culture in vitro qui récapitule les conditions dans l'hôte est nécessaire. Les organoïdes, qui ressemblent étroitement aux tissus de leur origine, sont idéaux pour étudier les interactions hôte-parasite. Les organoïdes sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de tissus qui sont dérivées de cellules souches adultes et se développent en culture pendant de longues périodes de temps sans subir d'aberration génétique ou de transformation. Ils ont une polarité bien définie avec des surfaces apicales et basolatérales. Les organoïdes ont diverses applications dans le dépistage des drogues, la biobanque, et la modélisation des maladies et les études d'interaction hôte-microbe. Ici, nous présentons un protocole étape par étape de la façon de préparer les oocystes et les sporozoites de Cryptosporidium pour infecter les organoïdes intestinaux et respiratoires humains. Nous démontrons ensuite comment la microinjection peut être utilisée pour injecter les microbes dans le lumen organoïde. Il existe trois méthodes principales par lesquelles les organoïdes peuvent être utilisés pour les études d'interaction hôte-microbe : microinjection, tonte mécanique et placage, et en fabriquant des monocouches. La microinjection permet le maintien de la structure 3D et permet un contrôle précis des volumes de parasites et un contact latéral actoical direct pour les microbes. Nous fournissons des détails pour la croissance optimale des organoïdes pour la production d'imagerie ou d'oocyst. Enfin, nous démontrons également comment les oocysts nouvellement générés peuvent être isolés de l'organoïde pour un traitement et une analyse en aval.

Les protocoles présentés ici donnent lieu à une purification efficace des oocystes et des sporozoites (Figure 1A) prêts pour la microinjection. Le protocole d'excystation entraîne la libération de sporozoites à partir d'environ 70 à 80 % des oocystes, il est donc essentiel de filtrer les oocystes et les coquilles restants à l'intérieur d'un filtre de 3 m. La filtration entraîne près de 100 % de purification de la sporozoite (figure 1B). En outre, l'ajout d'un co...

Nous décrivons des protocoles pour préparer des oocysts et purifier des sporozoites pour étudier l'infection des organoïdes intestinaux et de voie aérienne humains par Cryptosporidium parvum. Nous démontrons les procédures pour la microinjection des parasites dans le lumen intestinal organoïde et l'immunostaining des organoïdes. Enfin, nous décrivons l'isolement des oborcystes générés des organoïdes.

Étudier l'infection à Cryptosporidium dans les systèmes de culture organoïde humaine dérivés de tissus 3D par microinjection

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Utilisant cette procédure de purification et de microinjection de sporozoite, essentiellement n’importe quel microbe d’hôte peut être étudié dans n’importe quel système d’organe tissu-dérivé. En utilisant cette technique, nous pouvons contrôler la quantité de sporozoites purs injectés dans le lumen organoïde ou le côté apical de l’organoïde. Pour purifier les sporozoites de C.parvum, transférez l’oocyste à un tube de 15 millilitres et résuspendez les cellules à une fois 10 à la septième concentration moyenne d’oocyste par millilitre excystation.Après 60 à 90 minutes à 37 degrés Celsius, mélanger 14 millilitres d’une solution de lavage appropriée avec les oocystes, et sédimenter les cellules par centrifugation. Aspirez soigneusement le supernatant pour éviter de perdre des oocystes et résuspendez la pastille sporozoïque à trois fois 10 à la septième oocyste par un à deux millilitres de concentration de DMEM. Pour enlever les oocystes et les coquilles restantes, placez un canon de seringue de 10 millilitres équipé d’un dispositif de support de filtre de 47 millilitres équipé d’un filtre en polycarbonate de taille pore de trois micromètres dans un tube de 15 millilitres à quatre degrés Celsius.Ajouter 7,5 millilitres de suspension sporozoite à l’assemblage du filtre. Lorsque tout le volume est passé à travers la passoire par gravité, laver les cellules restantes à travers la passoire avec un autre 7,5 millilitres de DMEM. Lorsque tout le lavage est passé à travers la passoire, recueillir la suspension filtrée sporozoite par centrifugation pendant 10 minutes et étiqueter la pastille en 50 à 100 microlitres d’un milieu de culture organoïde approprié, complétée par 0,05% de colorant vert rapide, et L-glutathione, bétaine, L-cystéine, acide linoléique, et la taurine contenant la réduction tampon.Pour microinjecter les parasites dans le côté apical d’un organoïde 3D, utilisez d’abord un puller micropipette pour préparer des capillaires d’injection de verre. Utilisez des forceps pour couper la pointe du capillaire à un diamètre de neuf à 12 micromètres pour permettre un flux facile de sporozoites ou d’oocystes, si vous choisissez d’injecter des oocystes directement, et utilisez des pointes de micro-chargeur pour remplir chaque capillaire d’un colorant vert rapide étiqueté oocyste ou suspension sporozoite. Ensuite, chargez le premier capillaire rempli de sporozoite dans un microinjecteur et utilisez un microscope inversé à un grossissement de 5 x et une pression constante pour microinjecter 100 à 200 nanolitres de la suspension dans chaque organoïde.Le protocole d’excystation entraîne la libération de sporozoites d’environ 70 à 80% des oocystes. Par conséquent, il est essentiel de filtrer les coquilles oocystes restantes par une filtration de trois micromètres. Retirez près de 100 % des oocystes non glacés.En outre, l’ajout d’un colorant vert permet d’assurer l’injection de tous les organoïdes, et permet la visualisation des organoïdes injectés pendant au moins 24 heures après l’injection. Bien qu’il s’agit d’une méthode bien pratiquée, la microscopie électronique à balayage peut être utilisée pour s’assurer que le processus d’excystation n’a pas endommagé les sporozoites ou les oocystes. L’injection de quantités égales d’oocystes dans le lumen organoïde peut être confirmée visuellement par une imagerie microscopique simple.Les analyses d’immunofluorescence peuvent également être utilisées pour explorer les types de cellules infectées par cryptosporidium. Une fois que les organoïdes différenciés ont été infectés pendant cinq jours, la présence de sporozoites dans les oocystes peut être confirmée en séchant une partie des oocystes sur une tobody adhésive, en fixant les oocystes avec du méthanol et en combinant la coloration DAPI avec un anticorps approprié spécifique à l’oocyste. Pour obtenir un maximum de résultats, utilisez des oocystes frais, utilisez le même capillaire pour toutes les injections et changez les médias tous les jours après l’injection.En utilisant cette technique, divers laboratoires commencent maintenant à utiliser des organoïdes pour étudier les interactions hôte-microbe. Nous étudions des proportionnels ainsi que d’autres agents pathogènes dans des milieux de microculture organoïdes similaires. Comme cryptosporidium est un parasite humain, il est important d’effectuer ces expériences selon les règlements de sécurité de niveau 2.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Isolement in vitro de sporozoïtes à partir d’oocystes de Cryptosporidium parvum

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Technique de développement d’une infection parasitaire dans des organoïdes intestinaux par micro-injection

Ce protocole explique culture organoïde primaire LGR5-positve et la performance ultérieure de transduction rétrovirale. Cela permet la surexpression Cre inductible ou effet de choc du transgène livré et permet des études fonctionnelles à réaliser dans le roman en organotypique in vitro   système modèle.

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Dans ce protocole vidéo, nous expliquons étape par étape la transduction lentivirale dans les organoïdes de l’épithélium intestinal primaire et le traitement et l’analyse en aval de ces cultures par RT-PCR quantitative, ARN-microarray et immunohistochimie.

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Les cultures dérivées de cellules souches recèlent un énorme potentiel pour modéliser les maladies infectieuses. Ici, la culture d’organoïdes gastriques de souris et d’humains dérivés de cellules souches adultes est décrite. Les organoïdes sont micro-injectés avec l’agent pathogène gastrique Helicobacter pylori.

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Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

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Découvrez la purification de sporozoïtes et la microinjection pour étudier l'infection à Cryptosporidium parvum dans des organoïdes intestinaux et respiratoires humains. Ces protocoles permettent de visualiser les interactions hôte-pathogène avec précision.

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