Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l'homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.

Ce protocole de cytométrie de masse préserve l’intégrité de toute la moelle osseuse, permettant le sauvetage de l’information qui a été perdue lors de la préparation conventionnelle de l’échantillon pour l’analyse des cellules sous-étudiées. Ce protocole rapide et sans effort d’isolement de moelle facilite l’acquisition des populations viables de cellules myéloïdes de courte durée telles que les sous-ensembles rares de neutrophile-lignée. L’utilisation de la cytométrie de masse pour identifier les cellules immunitaires précédemment sous-estimées telles que les cellules de neutrophile-lignée peut avoir de larges implications pour une grande variété de maladies.

Ce protocole préserve l’intégrité des cellules myéloïdes de courte durée qui sont présentes dans la moelle osseuse et peuvent facilement être appliquées à d’autres types de tissus tels que la tumeur solide. Nous avons simplifié au protocole pour le rendre aussi convivial que possible, mais comme dans toutes les études biologiques, il peut avoir besoin de quelques courses de pratique à gérer. Lorsque vous faites cela la première fois, vous pouvez obtenir tous vos reagents prêts d’abord, puis suivre strictement le protocole.

Si vous éprouvez des problèmes, vous pouvez vous connecter au CyTOForum et parler à d’autres utilisateurs de CyTOF qui peuvent vous aider à résoudre les problèmes. Pour la préparation de l’échantillon biologique, des astuces simples peuvent faire une énorme différence avec le résultat final. Une démonstration visuelle est beaucoup plus facile pour un nouvel utilisateur de saisir le protocole.

Si vous faites cela pour la première fois, vous pouvez obtenir vos reagents prêts d’abord, puis suivre strictement le protocole. Pour la récolte de moelle osseuse, placez une souris noire C57 de six à 10 semaines en position supinpine sur un coussin chirurgical stérile et utilisez 70 % d’éthanol pour stériliser l’abdomen et les membres postérieurs. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux disséquants pour ouvrir la cavité abdominale et enlever la peau pour exposer les membres postérieurs.

À l’aide d’une paire de forceps émoussés, maintenez le tibia de la souris juste en dessous de la cheville et utilisez une paire de forceps incurvés pour stabiliser le tibia sous les forceps de dressage à pointe émoussée. Utilisez les forceps émoussés pour briser le tibia et enlever le muscle pour exposer l’os. Avant de placer le tibia dans du PBS froid, déplacez les forceps de dressage incurvés stabilisateurs vers le fémur et faites glisser les forceps émoussés sous l’articulation du genou pour tenir la rotule.

Tirez doucement vers le haut pour disloquer la rotule et enlever le muscle de la rotule pour exposer le fémur. Tenez le fémur exposé près des forceps incurvés et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper le fémur du fond de l’os. Ensuite, placez le fémur dans PBS.

Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 18 pour percer un trou dans un tube de micro centrifugeuse de 0,5 millilitre et placez les deux os dans le tube avec les extrémités ouvertes des os orientés vers le bas dans le trou. Placez le tube de 0,5 millilitre dans un tube de micro centrifugeuse de 1,7 millilitre et faites tourner les tubes à double couche dans une micro centrifugeuse. À la fin de la centrifugation, confirmer que la moelle osseuse a été extraite au fond du tube.

Pour tacher les cellules de moelle osseuse pour la cytométrie de masse, suspendez la moelle osseuse en un millilitre de tampon de lyse de globule rouge pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de PBS froid. Filtrer les cellules à travers une passoire de 70 micromètres dans un tube conique de 15 millilitres et laver les cellules avec neuf millilitres de PBS frais et froid.

Suspendre à nouveau la pastille de cellules de moelle osseuse en 10 millilitres de PBS frais et froid pour compter et transférer cinq fois 10 à la sixième cellule aliquot dans un nouveau tube de 15 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau les cellules dans un millilitre de mémoire tampon de coloration de cytométrie de masse, complétée par 125 cisplatine nanomolaire. Après cinq minutes à température ambiante, laver les cellules en quatre millilitres de tampon de cytométrie de masse fraîche.

Suspendre à nouveau la pastille dans 50 microlitres de solution de blocage des récepteurs FC. Après 10 minutes à quatre degrés Celsius, ajouter 50 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt pour les cellules et doucement pipet mélanger. La température à différentes étapes d’incubation est très importante pour préserver la viabilité des cellules de moelle osseuse.

Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules deux fois en deux millilitres de tampon de cytométrie de masse fraîche par lavage avant de suspendre les cellules en un millilitre de formaldéhyde fraîchement préparé à 1,6 % pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de tampon perm fixe complété par une solution d’intercalation nanomolaire de 125 nanomolaires pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Avant d’analyser les cellules par cytométrie de masse, vortex et centrifugeuse doucement la suspension cellulaire avant de laver les cellules en deux millilitres de tampon de coloration de cytométrie de masse fraîche.

Ensuite, lavez les cellules deux fois en un millilitre d’eau distillée par lavage, en aspirant soigneusement le supernatant après le deuxième lavage avant de suspendre à nouveau les cellules à une fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration tampon de cytométrie de masse pour l’analyse de cytométrie de masse. Dans cette parcelle d’intégration stochastique du voisin stochastique, les cellules à travers plusieurs tissus muraux ont été regroupées en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d’expression des marqueurs de surface mesurés par un panneau de cytométrie de masse de 33 paramètres. Les cellules ayant des propriétés plus similaires ont été automatiquement regroupées en fonction de l’expression de ces marqueurs sur chaque cellule.

En utilisant cette méthode, l’intégrité de toute la moelle osseuse a été préservée, conduisant à la découverte d’une population cellulaire jusque-là inconnue qui co-exprime simultanément des marqueurs de surface de la tige et de l’ancêtre neutrophiles et hématopoïétiques. Cette population cellulaire, qui a été précédemment omise dans les études de progéniteur myéloïde, due à l’épuisement positif de cellules de Ly6G, montre un modèle distinct d’expression de marqueur de surface. Plus important encore, ces données ont conduit à la découverte d’un petit sous-ensemble du cluster cellulaire positif Ly6G qui n’exprime pas ly6G, mais a été regroupé étroitement avec les cellules positives CD117 Ly6G positives, suggérant la similitude de ces cellules à la lignée neutrophile basée sur l’expression des 33 marqueurs de surface utilisés dans cette expérience de cytométrie de masse.

Un panneau de tri cellulaire activé par florescence de 13 couleurs pourrait alors être construit, permettant l’isolement des progéniteurs neutrophiles par cytométrie d’écoulement pour les analyses fonctionnelles en aval. Il est important d’effectuer la procédure d’isolement de la moelle osseuse aussi rapidement que possible et de maintenir les cellules à quatre degrés Celsius pendant la procédure de coloration.