Name: Préparation de la moelle osseuse entière pour lanalyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Apprenez une méthode de cytométrie de masse pour préserver l'intégrité de la moelle osseuse entière et analyser les sous-populations rares de cellules de lignée neutrophile chez la souris et l'humain.

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Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie de flux de LJI pour l'aide avec la procédure de cytométrie de masse. Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R01HL134236, P01HL136275, et R01CA202987 (tous à C.C.H) et ADA7-12-MN-31 (04) (à C.C.H. et Y.P.Z).

Toutes les expériences ont suivi les directives approuvées du Comité d'allergie et d'immunologie des animaux de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie, et l'approbation de l'utilisation des rongeurs a été obtenue de l'Institut La Jolla pour l'allergie et l'immunologie selon les critères décrits dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals des National Institutes of Health.
1. Récolte de la moelle osseuse de souris (BM)
<ol><li>Achetez des souris C57BL/6J auprès d'un fournisseur commercial. Nourrir le régime standard de chow de rongeur et la maison dans des cages de microisolateur dans une installation exempte d'agent pathogène.</li>
	<li>Utilisez des souris mâles, âgées de 6 à 10 semaines, à des fins expérimentales. Euthanasier par inhalation de CO2 suivie de la luxation cervicale.</li>
	<li>Placez la souris sur un tampon chirurgical stérile avec le côté de l'abdomen vers le haut. Stérilisez la peau de l'abdomen et de la région des membres postérieurs en pulvérisant 70 % d'éthanol. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux de dissection pour couper la cavité abdominale ouverte.</li>
	<li>Retirez la peau pour exposer les membres postérieurs. Utilisez une paire de forceps d'habillage à pointe émoussée pour tenir le tibia de la souris juste en dessous de la cheville. Utilisez une autre paire de forceps de pansement incurvés pour stabiliser le tibia sous les forceps d'habillage à pointe émoussée. Casser le tibia et exposer l'os en arrachant le muscle avec les forceps de pansement à pointe émoussée. NOTE: Le tibia est lâchement attaché à l'articulation du genou et peut être facilement choisi en utilisant les forceps de pansement à pointe émoussée.</li>
	<li>Placer le tibia dans le froid 1x PBS.</li>
	<li>Ensuite, déplacez les forceps de dressage incurvés stabilisants vers le bas vers le fémur. Faites glisser les forceps d'habillage à pointe émoussée sous l'articulation du genou et maintenez la rotule. Déloger la rotule en la tirant doucement vers le haut. Exposer le fémur en arrachant le muscle attaché à la rotule. Tenez le fémur exposé par les forceps de pansement courbés et coupez le fémur du fond de l'os à l'aide de ciseaux chirurgicaux disséquant.</li>
	<li>Placer le fémur dans le froid 1x PBS.</li>
	<li>Percer un trou dans un tube de microcentrifuge de 0,5 ml à l'aiguille de 18 G.</li>
	<li>Placez le tibia et le fémur dans le même tube de microcentrifuge de 0,5 ml avec l'extrémité ouverte des os faisant face vers le bas au trou.</li>
	<li>Placez le tube de 0,5 ml contenant à la fois le tibia et le fémur dans un tube de microcentrifuge de 1,7 ml.</li>
	<li>Faites tourner les tubes à double couche contenant à la fois le tibia et le fémur à 5 510 x g pour 30 s dans la microcentrifuge.</li>
	<li>Assurez-vous que le BM est extrait des os et granulé au fond du tube. Jere le tube de 0,5 ml contenant les os sacrés. La souris BM est prête pour les prochaines étapes. REMARQUE : La BM humaine est moissonnée aux ressources cliniques comme décrit précédemment11.</li>
</ol>2. Cellules De Tache BM pour CyTOF
<ol><li>Resuspendre le BM en 1 mL 1x Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse. Pour la BM humaine, resuspendre l'ensemble bM dans un volume de 10x de 1x Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse. Incuber pendant 10 min à température ambiante (RT).</li>
	<li>Faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Pour le BM humain, répétez les étapes 2.1 et 2.2 avant de passer à l'étape 2.3.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et laissez la pastille intacte. Suspendre le granule avec 1 mL de froid 1x PBS. Filtrer la pastille dans un tube conique de 15 ml à travers une passoire cellulaire de 70 m. Les cellules BM sont maintenant complètement isolées dans le tube à partir des débris musculaires et osseux. Laver les cellules en ajoutant 9 ml de froid 1x PBS dans le tube.</li>
	<li>Faire tourner le tube de 15 ml à 350 x g pour 5min à 4 oC.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 10 ml de PBS froid. Prenez un aliquot de cellules pour le comptage. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre.</li>
	<li>Aliquot 5 x 106 cellules BM dans un nouveau tube de 15 ml pour la coloration CyTOF.</li>
	<li>Faire tourner l'aliquot à tube de 15 ml à 350 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 125 nM Cisplatin dans 1 mL de CyTOF Staining Buffer comme indicateur de viabilité pour l'échantillon. Incuber pendant 5 min à RT.</li>
	<li>Après l'incubation, ajouter 4 ml de tampon de coloration CyTOF au tube. Faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC. Pour la BM humaine, ajouter 10 % de sérum AB humain dans le tampon de coloration CyTOF.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez les cellules BM avec 50 L de solution de blocage du récepteur Fc. Incuber pendant 10 min à 4 oC. Passer cette étape pour l'homme BM.</li>
	<li>Ajoutez 50 l du cocktail d'anticorps CyTOF maison5 à l'échantillon de sorte que le volume total de coloration est de 100 L. Mélanger délicatement la pipette. Incuber pendant 30 min à 4 oC. Le volume final du cocktail d'anticorps est de 100 l pour les échantillons de BM de souris et de BM humain.</li>
	<li>Ajouter 2 ml de tampon de coloration CyTOF à chaque tube après l'incubation pour laver les cellules, faire tourner le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Répétez l'étape 2.12 pour un total de deux lavages.</li>
	<li>Préparer une nouvelle solution de formaldéhyde de 1,6 % à partir de l'ampule de 16 % des actions. Diluer 1 partie du formaldéhyde de stock avec 9 parties de 1x PBS.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule avec 1 ml de solution FA fraîche de 1,6%. Incuber pendant 15 min à RT.</li>
	<li>Faire tourner le tube à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule de cellule avec la solution d'intercalation de 125 nM dans le tampon de correction/perm de 1 ml.</li>
	<li>Incuber l'échantillon dans une solution d'intercalation pendant la nuit à 4 oC.</li>
</ol>3. Préparer les cellules pour l'acquisition de CyTOF
<ol><li>Vortex et cellules de rotation doucement à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Laver les cellules en ajoutant 2 ml de tampon de coloration CyTOF, faire tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 oC et enlever le supernatant par aspiration.</li>
	<li>Resuspendre les cellules en 1 mL de diH2O. Réservez un petit volume (environ 10 L) de chaque tube pour compter les cellules.</li>
	<li>Spin cellules à 800 x g pendant 5 min à 4 oC.</li>
	<li>Répétez les étapes 3.3 et 3.4.</li>
	<li>Aspirez soigneusement le supernatant et laissez les cellules dans la pastille. Les cellules BM sont maintenant prêtes à être suspendues à la concentration de 1 x 106 cellules/mL pour l'acquisition de CyTOF.</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404, 193-197 (2000).</li>
<li>Iwasaki, H., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+lineage+commitment+from+the+hematopoietic+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell.</a> Immunity. 26, 726-740 (2007).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Methods. 13, 493-496 (2016).</li>
<li>Zhu, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Early+Unipotent+Neutrophil+Progenitor+with+Pro-tumoral+Activity+in+Mouse+and+Human+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow.</a> Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).</li>
<li>Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+High-Dimensional+Data+Using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>Amir, E. A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+data+using+t-SNE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Machine+Learning+Research%22%5BJournal%5D)">Visualizing data using t-SNE.</a> Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).</li>
<li>Cloos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Protocol+to+Sample+and+Process+Bone+Marrow+for+Measuring+Measurable+Residual+Disease+and+Leukemic+Stem+Cells+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia.</a> Journal of Visualized Experiment. 133, 56386(2018).</li>
<li>Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+profiler%E2%80%99s+guide+to+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A deep profiler’s guide to cytometry.</a> Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).</li>
<li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+New+insights+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: New insights and open questions.</a> Science Immunology. 3 (30), 4579(2018).</li>
<li>Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of neutrophils.</a> Nature Reviews in Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Au cours des dernières décennies, la cytométrie à base de fluorescence a été utilisée comme méthode principale pour étudier les lignées cellulaires et l'hétérogénéité1,2,3. Bien que la cytométrie de flux ait fourni des données multidimensionnelles, cette méthode est limitée par des choix de paramètres et de chevauchement spectral. Pour surmonter la faiblesse de la cytométrie d'écoulement, nous avons profité de CyTOF, qui utilise...

Au cours des dernières décennies, les méthodes de cytométrie ont été un outil puissant pour étudier le système hématopoïétique dans le BM. Ces méthodes comprennent la cytométrie d'écoulement activée par la fluorescence et la nouvelle méthode de CyTOF utilisant des anticorps étiquetés métal lourd. Ils ont mené à la découverte de nombreux types de cellules dans un spécimen biologique hétérogène en identérant leurs profils uniques d'expression de marqueurde de surface. L'augmentation des chevauchements de spectre associés à un plus grand nombre de canaux entraîne une inexactitude accrue des données dans les applications de cytométrie de débit activée par la fluorescence. Par conséquent, les cellules indésirables sont systématiquement enlevées afin d'enrichir les populations cellulaires d'intérêt pour l'analyse de cytométrie de débit activée par fluorescence. Par exemple, Les cellules Ly6G (ou Gr-1) et CD11b sont considérées comme des marqueurs de cellules myéloïdes matures et les cellules Ly6G(ou Gr-1)et CD11b sont systématiquement retirées des échantillons de BM à l'aide de kits d'enrichissement magnétique avant l'analyse de la cytométrie du flux. cellules souches hématopoïétiques et progénitrices (HSPC) ou en combinant ces marqueurs dans un canal de cocktail à décharge1,2,3. Un autre exemple est que les neutrophiles sont systématiquement retirés du spécimen de sang humain pour enrichir les cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMC) pour des études immunologiques. La moelle osseuse entière isolée de la souris ou de l'homme, cependant, est rarement étudiée intacte pour l'analyse de cytométrie.
Récemment, CyTOF est devenu un outil révolutionnaire pour étudier le système hématopoïétique4,5,6. Avec CyTOF, les anticorps étiquetés fluorophore sont remplacés par des anticorps étiquetés par des journalistes à élément lourd. Cette méthode permet de mesurer plus de 40 marqueurs simultanément sans se soucier du chevauchement du spectre. Il a permis l'analyse d'un spécimen biologique intact sans étapes de pré-épuisement ou d'un canal de vidange. Par conséquent, nous pouvons voir le système hématopoïétique de manière complète avec la dimensionnalité à haute teneur à partir des parcelles conventionnelles de cytométrie de flux 2-D. Les populations cellulaires omises dans le passé lors de l'épuisement ou du processus de gating peuvent maintenant être mises en lumière avec les données de haute dimension générées par CyTOF4,5. Nous avons conçu un panneau d'anticorps qui mesure simultanément 39 paramètres dans le système hématopoïétique avec un accent sur le linage myéloïde7. Par rapport aux données conventionnelles de cytométrie de flux, l'interprétation et la visualisation des données unicellulaires sans précédent à haute dimensionnalité générées par CyTOF est un défi. Les scientifiques computationnels ont développé des techniques de réduction de dimensionnalité pour la visualisation des ensembles de données de haute dimension. Dans cet article, nous avons utilisé l'algorithme, viSNE, qui utilise t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE) technique pour analyser les données CyTOF et de présenter le résultat de haute dimension sur une carte en 2 dimensions tout en conservant la structure de haute dimension des données8,9,10. Sur la parcelle tSNE, des cellules similaires sont regroupées en sous-ensembles et la couleur est utilisée pour mettre en évidence la caractéristique des cellules. Par exemple, à la figure 1, les cellules myéloïdes sont réparties dans plusieurs sous-ensembles cellulaires en fonction des similitudes de leurs modèles d'expression de 33 marqueurs de surface résultant de CyTOF (Figure 1)4. Ici nous avons étudié la moelle d'os de souris avec notre panneau précédemment rapporté de 39 marqueurs de CyTOF par l'analysedeviSNE 7. l'analyse viSNE de nos données CyTOF a révélé une population cellulaire non identifiée qui a montré à la fois HSPC (CD117)et neutrophiles (Ly6G)(figure2)7.
En conclusion, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse entière fraîche pour l'analyse de CyTOF. Dans cet article, nous avons utilisé la moelle osseuse de souris comme exemple, tandis que ce protocole peut également être utilisé pour traiter des échantillons de moelle osseuse humaine. Les détails spécifiques aux échantillons de moelle osseuse humaine sont également notés dans le protocole. L'avantage de ce protocole est qu'il contient des détails tels que le temps d'incubation et la température qui ont été optimisés pour préserver les cellules de neutrophile dans toute la moelle osseuse pour permettre l'investigation sur la moelle osseuse entière intacte. Ce protocole peut également être facilement modifié pour les applications de cytométrie de débit activée par fluorescence.

<table><tbody><tr><td>CyTOF Antibodies (souris)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3089005B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3176002B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD105 (Clone MJ7/18)-Purified</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 120402 ; RRID :AB_961070</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 135502 ; RRID :AB_1937293</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3166004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD11a (Clone M17/4)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 101101 ; RRID :AB_312774</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris CD11B (Clone M1/70)-148Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3148003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris CD11C (Clone N418)-142Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3142003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD127 (IL-7R&alpha ;) (Clone A7R34)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919 ; RRID :AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3167004B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16.2 (Fc&gamma ; RIV) (Clone 9E9)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149502 ; RRID :AB_2565302</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purifié</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 557787 ; RRID :AB_647340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 142402 ; RRID :AB_10916523</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 149302 ; RRID :AB_2565277</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD183 (clone CXCR3-173)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 126502 ; RRID :AB_1027635</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 137625 ; RRID :AB_2563744</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD34 (clone MEC14.7)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 119302 ; RRID :AB_345280</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 133919 ; RRID :AB_2565433</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD43 (Clone S11)-146Nd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3146009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD48 (Clone HM48.1)-156Gd</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3156012B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 14-1351-82 ; RRID :AB_467481</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD71 (clone RI7217)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 113802 ; RRID :AB_313563</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD90 (Clone G7)-Purifié</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 105202 ; RRID :AB_313169</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris F4/80 (Clone BM8)-159Tb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3159009B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Fc&epsilon ; RI&alpha ; (Clone MAR-1)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 134321 ; RRID :AB_2563768</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purifié</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 554404 ; RRID :AB_395370</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3174003B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Souris Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purifié</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 556003 ; RRID :AB_396287</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3169015B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ly6B (Clone 7/4)-Abcam Purifié</td><td></td><td>Cat# ab53457 ; RRID :AB_881409</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 127637 ; RRID :AB_2563784</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris NK1.1 (Clone PK136)-165Ho</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 3165018B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purifié</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat# 552125 ; RRID :AB_394340</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris TCR&beta ; (Clone H57-597)-143Nd</td><td>Fluidigm</td><td>(Clone H57-597)-143Nd</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris TER-119/Cellules érythroïdes (Clone TER-119)-MaxPar Ready</td><td>Biolegend</td><td>Cat# 116241 ; RRID :AB_2563789</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals, peptides and recombinant Proteins </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody Stabilizer</td><td>CANDOR Bioscience</td><td>Cat# 130050</td><td></td></tr><tr><td>Bovin Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cisplatine-194Pt</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201194</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience 1x Tampon</td> <td>de lyse RBCThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>EQ Perles d’étalonnage à quatre éléments</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201078</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum bovin fœtal</td><td>Omega Scientific</td><td>Cat# FB-02</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Phosphate Buffered Solution Saline</td><td>GE Lifesciences</td><td>Cat#SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Intercalator-Ir</td><td>Fluidigm</td><td>Cat# 201192B</td><td></td></tr><tr><td>MAXPAR Kits de marquage d’anticorps</td><td>Fluidigm</td><td>http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 158127</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de</td> <td>sodiumSigma-Aldrich</td><td>Cat# S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# X100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>Cat# 25-053-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Modèle expérimental : Organisme/Souches</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>souris : C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Code n° : 000664</td><td></td></tr><tr><td>Software Alogrithm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normalisateur basé sur les billes</td><td>Finck et al., 2013</td><td>https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cytobank Cytobank</td><td>https://www.cytobank.org/</td><td></td></tr> <tr><td>Cytofkit v1.r.0</td><td>Chen et al., 2016</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html</td><td></td></tr><tr><td>t-SNE</td><td>van der Maaten et Hinton, 2008</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

Dans cet article, nous présentons un protocole qui est optimisé pour préserver des cellules de neutrophile-ligne dans BM frais pour l'analyse entière de CyTOF de BM. Nous avons utilisé un panneau CyTOF de 39 anticorps myéloïde-biaisé pour évaluer le système hématopoïétique avec un foyer sur les cellules de neutrophile-ligne en utilisant ce protocole. Le résultat de CyTOF a été analysé avec un algorithme de réduction dimensionnelle à ressources ouvertes, viSNE, et les données ont été présentées pour démontrer les résultats de ce protocole. Nous avons découvert de nouvelles populations de cellules de neutrophile basées sur ce protocole. Ce protocole de préparation bM entière fraîche peut être employé pour 1), analyse de CyTOF pour découvrir des populations non identifiées de cellules de BM entière, 2), étudiant des défauts entiers de BM pour des patients présentant des désordres de sang tels que la leucémie, 3), aidant l'optimisation de protocoles de cytométrie de débit fluorescence activés qui utilisent BM entier frais.

La figure 1 est présentée comme un exemple résultant d'expériences CyTOF. Sur cette parcelle tSNE les cellules à travers plusieurs tissus de souris ont été regroupés en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d'expression de marqueur de surface mesurés par un panneau CyTOF de 33 paramètres. Les cellules avec des propriétés plus semblables ont été automatiquement regroupées comme les neutrophiles, les macrophages, ou les DC s'appuyant sur l'expression des 33 marqueurs sur chaq...

Ici, nous présentons un protocole pour traiter la moelle osseuse fraîche (BM) isolée de la souris ou de l'homme pour la cytométrie de masse de haute dimension (Cytométrie par Time-Of-Flight, CyTOF) analyse des cellules de neutrophile-lignée.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

Ce protocole de cytométrie de masse préserve l’intégrité de toute la moelle osseuse, permettant le sauvetage de l’information qui a été perdue lors de la préparation conventionnelle de l’échantillon pour l’analyse des cellules sous-étudiées. Ce protocole rapide et sans effort d’isolement de moelle facilite l’acquisition des populations viables de cellules myéloïdes de courte durée telles que les sous-ensembles rares de neutrophile-lignée. L’utilisation de la cytométrie de masse pour identifier les cellules immunitaires précédemment sous-estimées telles que les cellules de neutrophile-lignée peut avoir de larges implications pour une grande variété de maladies.Ce protocole préserve l’intégrité des cellules myéloïdes de courte durée qui sont présentes dans la moelle osseuse et peuvent facilement être appliquées à d’autres types de tissus tels que la tumeur solide. Nous avons simplifié au protocole pour le rendre aussi convivial que possible, mais comme dans toutes les études biologiques, il peut avoir besoin de quelques courses de pratique à gérer. Lorsque vous faites cela la première fois, vous pouvez obtenir tous vos reagents prêts d’abord, puis suivre strictement le protocole.Si vous éprouvez des problèmes, vous pouvez vous connecter au CyTOForum et parler à d’autres utilisateurs de CyTOF qui peuvent vous aider à résoudre les problèmes. Pour la préparation de l’échantillon biologique, des astuces simples peuvent faire une énorme différence avec le résultat final. Une démonstration visuelle est beaucoup plus facile pour un nouvel utilisateur de saisir le protocole.Si vous faites cela pour la première fois, vous pouvez obtenir vos reagents prêts d’abord, puis suivre strictement le protocole. Pour la récolte de moelle osseuse, placez une souris noire C57 de six à 10 semaines en position supinpine sur un coussin chirurgical stérile et utilisez 70 % d’éthanol pour stériliser l’abdomen et les membres postérieurs. Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux disséquants pour ouvrir la cavité abdominale et enlever la peau pour exposer les membres postérieurs.À l’aide d’une paire de forceps émoussés, maintenez le tibia de la souris juste en dessous de la cheville et utilisez une paire de forceps incurvés pour stabiliser le tibia sous les forceps de dressage à pointe émoussée. Utilisez les forceps émoussés pour briser le tibia et enlever le muscle pour exposer l’os. Avant de placer le tibia dans du PBS froid, déplacez les forceps de dressage incurvés stabilisateurs vers le fémur et faites glisser les forceps émoussés sous l’articulation du genou pour tenir la rotule.Tirez doucement vers le haut pour disloquer la rotule et enlever le muscle de la rotule pour exposer le fémur. Tenez le fémur exposé près des forceps incurvés et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper le fémur du fond de l’os. Ensuite, placez le fémur dans PBS.Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 18 pour percer un trou dans un tube de micro centrifugeuse de 0,5 millilitre et placez les deux os dans le tube avec les extrémités ouvertes des os orientés vers le bas dans le trou. Placez le tube de 0,5 millilitre dans un tube de micro centrifugeuse de 1,7 millilitre et faites tourner les tubes à double couche dans une micro centrifugeuse. À la fin de la centrifugation, confirmer que la moelle osseuse a été extraite au fond du tube.Pour tacher les cellules de moelle osseuse pour la cytométrie de masse, suspendez la moelle osseuse en un millilitre de tampon de lyse de globule rouge pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de PBS froid. Filtrer les cellules à travers une passoire de 70 micromètres dans un tube conique de 15 millilitres et laver les cellules avec neuf millilitres de PBS frais et froid.Suspendre à nouveau la pastille de cellules de moelle osseuse en 10 millilitres de PBS frais et froid pour compter et transférer cinq fois 10 à la sixième cellule aliquot dans un nouveau tube de 15 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau les cellules dans un millilitre de mémoire tampon de coloration de cytométrie de masse, complétée par 125 cisplatine nanomolaire. Après cinq minutes à température ambiante, laver les cellules en quatre millilitres de tampon de cytométrie de masse fraîche.Suspendre à nouveau la pastille dans 50 microlitres de solution de blocage des récepteurs FC. Après 10 minutes à quatre degrés Celsius, ajouter 50 microlitres du cocktail d’anticorps d’intérêt pour les cellules et doucement pipet mélanger. La température à différentes étapes d’incubation est très importante pour préserver la viabilité des cellules de moelle osseuse.Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules deux fois en deux millilitres de tampon de cytométrie de masse fraîche par lavage avant de suspendre les cellules en un millilitre de formaldéhyde fraîchement préparé à 1,6 % pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de tampon perm fixe complété par une solution d’intercalation nanomolaire de 125 nanomolaires pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Avant d’analyser les cellules par cytométrie de masse, vortex et centrifugeuse doucement la suspension cellulaire avant de laver les cellules en deux millilitres de tampon de coloration de cytométrie de masse fraîche.Ensuite, lavez les cellules deux fois en un millilitre d’eau distillée par lavage, en aspirant soigneusement le supernatant après le deuxième lavage avant de suspendre à nouveau les cellules à une fois 10 à la sixième cellule par millilitre de concentration tampon de cytométrie de masse pour l’analyse de cytométrie de masse. Dans cette parcelle d’intégration stochastique du voisin stochastique, les cellules à travers plusieurs tissus muraux ont été regroupées en sous-ensembles basés sur la similitude de leurs profils d’expression des marqueurs de surface mesurés par un panneau de cytométrie de masse de 33 paramètres. Les cellules ayant des propriétés plus similaires ont été automatiquement regroupées en fonction de l’expression de ces marqueurs sur chaque cellule.En utilisant cette méthode, l’intégrité de toute la moelle osseuse a été préservée, conduisant à la découverte d’une population cellulaire jusque-là inconnue qui co-exprime simultanément des marqueurs de surface de la tige et de l’ancêtre neutrophiles et hématopoïétiques. Cette population cellulaire, qui a été précédemment omise dans les études de progéniteur myéloïde, due à l’épuisement positif de cellules de Ly6G, montre un modèle distinct d’expression de marqueur de surface. Plus important encore, ces données ont conduit à la découverte d’un petit sous-ensemble du cluster cellulaire positif Ly6G qui n’exprime pas ly6G, mais a été regroupé étroitement avec les cellules positives CD117 Ly6G positives, suggérant la similitude de ces cellules à la lignée neutrophile basée sur l’expression des 33 marqueurs de surface utilisés dans cette expérience de cytométrie de masse.Un panneau de tri cellulaire activé par florescence de 13 couleurs pourrait alors être construit, permettant l’isolement des progéniteurs neutrophiles par cytométrie d’écoulement pour les analyses fonctionnelles en aval. Il est important d’effectuer la procédure d’isolement de la moelle osseuse aussi rapidement que possible et de maintenir les cellules à quatre degrés Celsius pendant la procédure de coloration.

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Research

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo décrit un protocole détaillé permettant d'isoler la moelle osseuse entière fraîche des membres postérieurs de la souris afin d'étudier les anomalies de la moelle osseuse chez les patients atteints de troubles sanguins tels que la leucémie.

Prélèvement de moelle osseuse sur une patte postérieure de souris

Nous décrivons un protocole pour l'isolement et la purification des neutrophiles de la moelle osseuse de souris par centrifugation de gradient de densité et de neutrophiles étiquetage utilisant des colorants CellTracker. Cela représente une méthode simple, rapide, reproductible et économique pour obtenir un grand nombre de neutrophiles pour des études fonctionnelles en aval ou des expériences de transfert et de suivi adoptifs.

Isolement, la purification et l&#39;étiquetage des neutrophiles osseuse de souris de moelle pour les études fonctionnelles et expériences de transfert adoptif

Nous rapportons un protocole utilisant les cellules activées par fluorescence de tri pour isoler les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) avec une grande pureté à partir de la moelle osseuse de souris lupus sujettes à des études fonctionnelles de pDC.

Fluorescence-tri cellulaire activé pour la purification de cellules dendritiques plasmacytoïdes de la moelle osseuse de souris

Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Le diagnostic MDS est difficile en l’absence de critères morphologiques ou cytogénétique non informatif. MFC pourrait aider à affiner le processus de diagnostic de MDS. Pour devenir utile pour la pratique clinique, l’analyse MFC doit reposer sur des paramètres avec une spécificité et une sensibilité suffisante, et les données doivent être reproductibles entre les différents opérateurs.

Base de données guidée-cytométrie en flux pour l’évaluation de la Maturation des cellules myéloïdes médullaires

Nous démontrons comment identifier et isoler les 6 sous-ensembles de progéniteurs myéloïdes de murins de la moelle osseuse à l’aide d’une combinaison de magnétique et de la fluorescence de tri (MACS et FACS). Ce protocole peut être utilisé pour les essais de culture in vitro (cultures de méthylcellulose ou liquide), des expériences in vivo transfert adoptif et analyses ARN/protéines.

Identification et isolement des Oligopotent et des progéniteurs myéloïdes Lineage-commis de moelle osseuse de souris

Ici, nous décrivons un protocole simple pour l’isolement et la coloration des cellules de moelle osseuse murine en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques phénotypiques ainsi que les cellules souches endothéliales et mésenchymateuses de niche. Une méthode d’enrichissement des cellules situées dans les zones endostéales et centrales de la moelle osseuse est également incluse.

Analyse par cytométrie en flux de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques de moelle osseuse murine et de cellules de niche stromale

Nous décrivons des protocoles par étapes mesurant la respiration mitochondriale des neutrophiles de souris et humaines et des cellules HL60 à l’aide de l’analyseur de flux extracellulaire métabolique.

Mesure en temps réel du profil bioénergétique mitochondrial des neutrophiles

Le succès de la transcriptomique unicellulaire/mononoyau et de la multi-omique dépend en grande partie de la qualité des cellules/noyaux. Par conséquent, l’isolement des cellules/noyaux des tissus et leur purification doivent être hautement standardisés. Ce protocole décrit la préparation des noyaux du cerveau et de la moelle osseuse pour l’essai multiome à noyau unique en aval.

Préparation de noyaux de cerveau et de moelle osseuse de haute qualité pour les dosages multiomes à noyau unique

Un protocole détaillé pour isoler et caractériser les populations microenvironnementales de moelle osseuse à partir de modèles murins de syndromes myélodysplasiques et de leucémie myéloïde aiguë est présenté. Cette technique permet d’identifier les changements dans la niche de la moelle osseuse non hématopoïétique, y compris les cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses, avec la progression de la maladie.

Identification des populations microenvironnementales de moelle osseuse dans le syndrome myélodysplasique et la leucémie myéloïde aiguë

Ce manuscrit décrit un protocole pour la préparation d’une banque ATAC-seq de neutrophiles à partir de moelle osseuse murine, visant à garantir une viabilité optimale des neutrophiles et une qualité de bibliothèque élevée. Il offre des instructions étape par étape sur la préparation des BMC, le tri immunomagnétique et la construction de bibliothèques, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux venus dans l’étude des neutrophiles.

Bibliothèque ATAC-Seq Préparation de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse murine

Apprenez une méthode de cytométrie de masse pour préserver l'intégrité de la moelle osseuse entière et analyser les sous-populations rares de cellules de lignée neutrophile chez la souris et l'humain.

Préparation de la moelle osseuse entière pour l'analyse de la cytométrie de masse des cellules de lignée neutrophile

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