Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

Salut, je suis Bin Ren, je suis professeur agrégé de chirurgie et de génie biomédical à l’Université de l’Alabama à la Birmingham School of Medicine. Notre laboratoire s’intéresse à la biologie cellulaire endothéliale fonction angiogenèse acuogenèse dans le contexte de ces maladies cardiovasculaires et cancers communs. Une de nos recherches se concentre sur la régulation épigénétique et transcriptionnelle de la transdifferentiation et de l’angiogenèse des cellules endothéliales.

Pour comprendre les mécanismes transcriptionnels de l’angiogenèse, nous avons établi des lignées de souris transgéniques, dans lesquelles nous avons non seulement supprimé un gène spécifique associé à l’angiogenèse dans les cellules endothéliales, mais une sonde GFP améliorée sera génétiquement étiquetée sur un ribosome de cellules endothéliales indigènes. De cette façon, nous pouvons isoler et purifier les boucles de l’ARN messager associé à partir de cellules endothéliales dans différents organes tissulaires directement chez les animaux transgéniques. Nous pouvons ensuite utiliser l’ARN messager purifié pour l’analyse en aval des transcriptions et du transcriptome.

Par séquençage de l’ARN et le PCR froid en temps réel. Dans cette vidéo, mes étudiants Patrick Moran et Jordan Palmer et les techniciens de recherche Nicholas Barnekow et Rong Yuan vous montreront une approche génotypage souris transgéniques et l’ARN messager aspirant directement à partir de l’endothélial chez les animaux transgéniques. Le génotypage est un préliminaire important dans ce protocole pour s’assurer que la glace a l’étiquette GFP sur les ribosomes des cellules endothéliales.

Étant donné que toutes les étapes d’isolement en aval du RNAi reposent sur la présence de ribosomes marqués GFP, il est essentiel de déterminer le génotype avant de commencer l’expérience. Avant de commencer l’isolement de l’ARN, plusieurs étapes préparatoires doivent être accomplies. Il s’agit notamment de la préparation tampon et la liaison de l’anticorps anti-GFP à la protéine G dina perles.

Les tampons peuvent durer jusqu’à un mois à quatre degrés Celsius et les perles liées aux anticorps peuvent durer jusqu’à une semaine à quatre degrés Celsius. Prenez donc en compte ces limitations lors de la planifier de votre expérience. L’utilisation d’un homogénéiseur molar conduit est un excellent moyen d’augmenter le rendement en ARN.

Assurez-vous d’utiliser des paramètres et des durées de fréquence plus faibles afin de réduire la dégradation de l’ARN. Comme nous l’avons mentionné précédemment, le génotypage est une étape préliminaire importante du protocole d’essai. S’assurer que les souris dont l’ARN doit être isolé à l’aide de la technique TRAP sont positives pour le gène TRAP, au moins les hétérozygotes, mais idéalement homozygotes pour le gène TRAP est une étape importante parce que s’assurer que l’étiquette GFP est sur le ribosome est essentiel afin de tirer vers le bas en utilisant la réaction anticorps antigène et les perles anti-GFP que vous aurez préparé avant de commencer l’expérience.

Isoler les tissus désirés de la souris et le placer immédiatement dans un PBS glacé avec 100 microgrammes par millilitre solution cyclohexamide. Cela garantit que la traduction sera arrêtée et que le transcriptome sera une représentation exacte de la souris avant l’euthanasie. Utilisez un homogénéiseur à moteur pour homogénéiser le tissu en suspension cellulaire.

Le moment idéal et les paramètres de fréquence devront être déterminés par le laboratoire individuel en fonction de l’homogénéiseur moteur particulier que vous utiliserez. L’utilisation d’un réglage de fréquence trop élevé peut entraîner une dégradation de l’ARN et perturber le reste du protocole. Suspendez la pastille cellulaire dans le tampon de lyse que vous auriez dû préparer avant de commencer l’expérience.

Assurez-vous d’homogénéiser davantage ce mélange afin d’assurer une homogénéisation adéquate avant de procéder au reste du protocole. Centrifugeuse l’homogénéisation pendant 10 minutes à 2000 fois G dans une centrifugeuse de quatre degrés Celsius. Cela va pelleter les noyaux et les gros débris cellulaires qui peuvent interférer avec la réaction d’immunoprécipitation en aval.

Ajouter les lipides DHPC et CA-630 au supernatant dès l’étape précédente de centrifugalisation. Ces lipides aideront à séparer les phases protéiques des autres composants intracellulaires. Placez la suspension sur la glace pendant cinq minutes et laissez-la reposer.

Centrifugeuse le lysate pendant 10 minutes à 13 000 fois G pour granuler n’importe quel matériau soluble. Gardez 15% du lysate clair pour les étapes futures. Ajouter les perles liées à l’anticorps anti-GFP à la cellule lysate supernatant et incuber le mélange à quatre degrés Celsius avec la fin sur la rotation de fin pendant 30 minutes.

C’est là que les anticorps anti-GFP lieront les ribosomes marqués GFP, ce qui nous permettra d’isoler davantage l’ARN de ces ribosomes. Recueillir les perles sur votre grille magnétique et laver les perles cinq fois en utilisant votre tampon de lavage en polysome à haute teneur en sel que vous aurez préparé avant de commencer l’isolement. Passez immédiatement à l’étape suivante au cours de laquelle vous placez les perles dans le tampon RLT.

Centrifugeuse le lysate pendant trois minutes à pleine vitesse et retirez soigneusement le supernatant et transférez-le dans un nouveau tube de microfuge. Ajouter un volume de 70% d’éthanol au lysate défriché et mélanger immédiatement par pipetting. Passez immédiatement à l’étape suivante au cours de laquelle vous transférerez jusqu’à 700 microlitres de l’échantillon, y compris tout précipité qui aurait pu se former, à une colonne de spin placée dans un tube de collecte de deux millilitres.

Centrifugeuse le lysate pendant 15 secondes à plus de 8000 fois G pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers et passer à l’étape suivante. Ajouter 350 microlitres de tampon RW1 à la colonne de spin.

Centrifugeuse pendant 15 secondes à plus de 8000 fois G pour laver la membrane de la colonne de spin et jeter le flux à travers. Répétez cette étape à l’aide de 350 microlitres de tampon RW1 avant de passer à l’étape suivante. Ajouter 500 microlitres de RPE tampon à la colonne de spin.

Centrifugeuse pendant 15 secondes à plus de 8000 fois G pour laver la membrane de la colonne de spin. Jetez le flux à travers et procéder à répéter cette étape en ajoutant un autre 500 microlitres de RPE tampon à la colonne de spin. Cette fois, centrifugeuse pendant deux minutes à plus de 8.000 fois G pour laver la membrane de la colonne de spin.

Jetez le flux à travers et placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de deux millilitres et procéder à la centrifugeuse à pleine vitesse pendant une minute pour éliminer tout tampon résiduel qui peut être présent sur la colonne de spin. Jetez le flux à travers et placez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte de 1,5 millilitre. Procéder à l’ajout de 30 à 50 microlitres d’eau libre RNase directement à la membrane de la colonne de spin.

Centrifugeuse pendant une minute à plus de 8000 fois G pour électrifier l’ARN de la membrane de la colonne de spin. À ce stade, votre ARN est dissous dans l’eau libre RNase et peut être stocké à moins 80 degrés Celsius pour un an. Procédez à la quantification et à la vérification de la pureté de l’ARN que vous avez isolé à l’aide d’un spectrophotomètre.

Vous êtes à la recherche d’un pic à 260 nanomètres, qui est l’acide nucléique, y compris l’ARN, absorbe au maximum. La quantité est représentée dans la partie inférieure droite de l’image en nanogrammes par microlitre. La qualité peut être déduite par le rapport 260 230 qui est montré un élément au-dessus de la quantité dans la partie inférieure droite de l’écran.

Notre approche a montré de faibles rendements d’ARN, particulièrement quand nous avons purifié l’ARNm des tissus cardiaques ou des tissus précédemment congelés. Nous devons donc opter pour les conditions d’augmentation des rendements. Cependant, nous avons observé chez les souris déficientes spécifiques au CD-36, le niveau d’ephrin B2 et de DLL4 ont été sensiblement augmentés dans les endothélies pulmonaires et cardiaques, par rapport au contrôle.

Ces résultats étaient conformes à nos études in vitro précédentes, ce qui suggère que la qualité de l’ARN est suffisante pour l’analyse en aval. Le rendement était faible en raison des conditions rigoureuses dans notre espace de travail. Pour surmonter cette limitation, il est essentiel de mettre en place une zone de travail sans RNase et de décontaminer les surfaces de travail et l’équipement qui peuvent être contaminés par la RNase et changer fréquemment de gants afin d’extraire de l’ARN de qualité et d’augmenter les rendements.

Il est également essentiel de trouver des concentrations appropriées d’anticorps GFP dans la matrice d’affinité et d’utiliser des concentrations appropriées d’inhibiteur de la RNase dans le tampon de lyse tissulaire et d’utiliser des marchandises en plastique sans RNase et des réagengenèses pour l’extraction de l’ARN à partir de ribosomes endothéliales des tissus ciblés.