Name: Biopsie et vitrification humaines de Blastocyst (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Découvrez la biopsie de trophectoderme et la vitrification pour le diagnostic génétique préimplantatoire sur embryons humains. Cette technique sécurisée permet d'extraire 7 à 8 cellules sans risque pour le blastocyste.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AG et RM ont recueilli les données et rédigé le manuscrit. DC a analysé les données, rédigé les résultats représentatifs, effectué les statistiques et révisé le manuscrit. L'UMF et LR ont fourni une discussion critique des résultats et de l'ensemble du manuscrit.

Le protocole pour la biopsie humaine de blastocyste, ici décrit, suit les lignes directrices du comité d'éthique de recherche humaine de G.EN.E.R.A.
REMARQUE: Consultez le Tableau des matériaux pour les matériaux requis. D'autres matériaux requis comprennent des chaussures et des tenues de laboratoire, un masque chirurgical, un couvre-cheveux, des gants chirurgicaux, un marqueur permanent non toxique, des forceps et du désinfectant. L'utilisation d'une blouse chirurgicale, de gants chirurgicaux jetables, d'un masque facial, d'une couverture capillaire est obligatoire pour prévenir les risques de contamination. Toutes les zones de travail, ainsi que l'équipement impliqué dans le processus, doivent être nettoyés à fond avec du désinfectant de laboratoire (p. ex., Oosafe) avant de commencer toute procédure. Tous les consommables et les supports utilisés doivent être stériles et emballés individuellement ou aliquoted. Il est suggéré d'utiliser un poste de travail dédié à la biopsie et à la tuyauterie et de limiter l'accès de la zone uniquement aux opérateurs impliqués dans la procédure (embryologiste et témoin).
1. Préparation le jour avant la procédure de biopsie
<ol><li>
Préparer le plat de culture post biopsie.
	<ol>
<li>Placer 6 gouttes de 20 l de culture FIV (Tableau des matériaux) dans un plat de culture FIV et la reposition de 6 ml d'huile minérale préchauffée pour la culture embryonnaire (Tableau des matériaux).</li>
		<li>Ajouter un autre 10 'L de milieu de culture DE FIV à chaque goutte. Incuber toute la nuit à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O2, 6 % CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparer un plat de FIV 4-bien assiette pour rincer le blastocyste après la biopsie.
	<ol>
<li>Placez 600 ll de milieu de culture de FIV dans les deux premiers puits et regroupez-vous de 300 l d'huile minérale pré-chauffée pour la culture embryonnaire.</li>
		<li>Incuber toute la nuit à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O2, 6 % CO2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Distribuer 1,5 L de solution de chargement (Table of Materials) dans chaque tube PCR à utiliser pour les tubes des cellules TE, le faire tourner et le garder à 4 oC.</li>
</ol>2. Préparation le jour de la procédure de biopsie
<ol><li>
Préparer le plat de biopsie.
	<ol>
<li>Placer 3 gouttes de 10 l hePES-tamponné milieu (complété avec l'albumine de sérum humain) (Table of Materials) dans une rangée dans un plat de culture FIV.</li>
		<li>Répétez l'étape 1.1.1 selon le nombre de blastocystes disponibles (jusqu'à 4 blastocystes par plat) et recassez avec 6 ml d'huile minérale pré-chauffée pour la culture embryonnaire.</li>
		<li>Incuber le plat à 37 oC pendant au moins 1 h avant d'effectuer la biopsie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sélection et classement Blastocyst
<ol><li>
Grade le blastocyste en fonction de son expansion et l'apparence morphologique de ICM et TE (Figure 1). REMARQUE : Les critères de classement ont été adaptés de Gardner et Schoolcraft15 et précédemment décrits par Capalbo et coll. et Cimadomo et al.4,11.<ol>
<li>Définissez la taille et la teneur d'expansion comme : A pour un blastocyste entièrement éclos, B pour un blastocyste d'éclosion, C pour un blastocyste entièrement élargi, et D pour un blastocyste non étendu (ces embryons sont biopsiés seulement s'ils ne se sont pas étendus plus loin jusqu'au jour 7).</li>
		<li>Définir icM grade: 1 pour ICM notable avec plusieurs cellules strictement emballées; 2 pour discernable avec plusieurs cellules, mais grossièrement emballées; 3 pour difficile à distinguer avec très peu de cellules de mauvaise qualité.</li>
		<li>Définir la catégorie TE comme suit : 1 pour l'épithélium bien organisé avec plusieurs cellules ; 2 pour l'épithélium lâche avec peu de cellules ; 3 pour peu et/ou de grandes cellules de faible qualité.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Biopsie de trophectoderm
<ol><li>Effectuez une biopsie TE sur tous les blastocystes viables entièrement élargis (de préférence de catégorie C pour la taille et l'expansion).</li>
	<li>Définir les pipettes de fixation et de biopsie pour chaque procédure de biopsie. Les recommandations pour la pipette de biopsie sont les suivantes : 30 m de diamètre interne, angle de courbure de 35 degrés, pointe de distance de 0,75 mm à plier.</li>
	<li>Étiquetez le plat de biopsie avec les détails du patient (nom et prénom de la femme, date de naissance et iD) et faites ensuite le numéro de chaque goutte avec des iD d'embryon et de cycle. Utilisez un marqueur permanent non toxique.</li>
	<li>Transférer le blastocyste à l'arme de 300 m pour décaper la première goutte du plat de biopsie et le rincer afin d'éliminer l'excès de milieu de culture. Déplacez ensuite le blastocyste dans la deuxième goutte du plat de biopsie.</li>
	<li>Déplacer le plat au microscope inversé et amorcer la pipette de biopsie en apitant un milieu à partir de la troisième goutte du plat de biopsie.</li>
	<li>À 20x grossissement, orienter le blastocyste pour avoir une vue claire de l'ICM. Lorsqu'il est visualisé à 7 heures (en face de la zone qui sera ciblée pour enlever les cellules TE), fixez l'embryon sur la pipette de retenue (figure 2a).</li>
	<li>Concentrez-vous sur la zona pellucida et s'assurer que les pipettes et le blastocyste sont sur le même plan focal.</li>
	<li>Passez à l'objectif laser (temps d'impulsion 0,3 ms, 6,5 m) et placez le pointeur laser sur la zona pellucida du côté opposé de l'ICM. Percer la zona pellucida à travers 2 3 impulsions laser (Figure 2b).</li>
	<li>Appuyez doucement sur la pipette de biopsie contre la zona pellucida et soufflez un peu de milieu à travers la brèche pour détacher les cellules TE de sa surface interne et accélérer l'effondrement du blastocyste (Figure 2c).</li>
	<li>Une fois que le TE est détaché (Figure 2d), entrez par le trou (si nécessaire, le rendre plus large avec une dernière impulsion laser) et aspirez peu de cellules TE (idéalement 7-813,16) dans la pipette de biopsie avec une aspiration douce (Figure 2e).</li>
	<li>Déplacez légèrement la pipette de biopsie vers l'arrière tout en appliquant une aspiration modérée pour étirer les cellules cibles (Figure 2f).</li>
	<li>Dirigez le laser vers la partie la plus mince des cellules aspirées et tirez des impulsions laser de 2 à 5 aux jonctions entre les cellules pour séparer les cellules cibles du corps de l'embryon (Figure 2g). Le moment des impulsions laser et le nombre d'impulsions peuvent être ajustés en fonction de la qualité du blastocyste; cependant, essayez de les minimiser pour éviter la lyse cellulaire.</li>
	<li>Après la séparation du fragment te du blastocyste (Figure 2h), relâchez-le dans la même goutte de biopsie loin du blastocyste. Ceci est nécessaire pour éviter qu'ils ne soient à nouveau aspirés dans la pipette de biopsie (figure 2i).</li>
	<li>Relâchez le blastocyste de la pipette de retenue et soulevez rapidement les deux pipettes pour empêcher le fragment de s'y coller.</li>
	<li>Prenez une photo du fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité (figure 3). REMARQUE : Si plus d'un seul blastocyste doit être biopsié par procédure (jusqu'à quatre par plat de biopsie), changez la pipette de biopsie avec une nouvelle pour empêcher la contamination croisée entre les embryons.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.1-4.13.</li>
	<li>Déplacez le plat de biopsie vers le capuchon à débit laminaire.</li>
	<li>Étiquetez le plat de culture post-biopsie avec l'ID du couple, et chaque goutte avec l'embryon et l'ID du cycle.</li>
	<li>En présence d'un témoin, rincez le blastocyste dans un milieu de FIV propre, et enfin déplacez-le à sa goutte correspondante du plat post-biopsie.</li>
	<li>Déplacer le plat post-biopsie à l'incubateur dans une atmosphère contrôlée (37 oC, 6 % CO2, 5 % O2) jusqu'à la vitrification. Il est conseillé d'effectuer la vitrification dans les 30 minutes de la procédure de biopsie, pour empêcher la ré-expansion blastocyste.</li>
</ol>5. Tubing
REMARQUE: L'ensemble de la procédure doit être effectué en présence d'un témoin et à l'intérieur du capot à débit laminaire à température ambiante. Pendant la procédure, garder les tubes PCR dans un support à tube froid sur la glace (Figure supplémentaire 1).
<ol><li>Étiqueter les tubes PCR avec un marqueur permanent non toxique. REMARQUE: L'étiquetage doit être effectué à la demande du laboratoire génétique. En général, le nom et le nom de famille du patient (initiales), l'iD de couple, l'embryon et l'iD de cycle (par exemple : JD 12345 1.2 pour l'embryon N.1 du 2ème cycle appartenant à Jane Doe dont l'ID de couple est 12345). L'ID d'embryon devrait également être rapporté dans les lettres sur le corps du tube.</li>
	<li>Étiquetez le couvercle d'un plat de culture de 60 mm x 15 mm (plat de tube) avec les iD des embryons biopsiés (figuresupplémentaire 1) et préparez-y deux gouttes de 10 l de solution de lavage de biopsie (Tableaudes matériaux).</li>
	<li>Premier la pipette de décapage de 140 m (figuresupplémentaire 1) avec une solution de lavage de biopsie de la deuxième goutte du plat de tuyauterie.</li>
	<li>Placez le plat de biopsie sous le stéréomicroscope pour visualiser facilement le fragment TE(s).</li>
	<li>Libérez doucement une solution de lavage de biopsie sur le fragment te ; puis, chargez-le dans la pipette de décapage.</li>
	<li>Déplacez le fragment te à la deuxième goutte de la solution de lavage de biopsie dans le plat de tuyauterie et rincez-le soigneusement 2/3 fois.</li>
	<li>Transférer le fragment TE au fond du tube PCR (précédemment étiqueté après lui) avec la solution de chargement, en prêtant attention pour éviter de toucher ses parois avec la pointe de la pipette de décapage.</li>
	<li>Répétez la procédure de l'étape 5.3 à l'étape 5.7 pour chaque fragment TE, en prêtant attention à l'utilisation d'un nouveau capillaire pour chaque fragment TE.</li>
	<li>À la fin de la procédure de tuyauterie, mettre tous les tubes PCR dans une mini centrifugeuse, et les faire tourner pendant quelques secondes.</li>
	<li>Entreposer les échantillons à -20 oC jusqu'à ce qu'ils les expédient au laboratoire génétique référé pour les tester.</li>
</ol>6. Vitrification blastocyste
<ol><li>Vitrify s'est effondré blastocystes dans les 30 min de la biopsie TE pour empêcher leur ré-expansion.</li>
	<li>Étiquetez la plaque de vitrification avec les détails de la femme et les iD des blastocystes qui doivent être vitrifiés.</li>
	<li>Étiquetez le support de vitrification (s) avec le nom et le nom de famille de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera chargé sur elle, aussi bien que la date de la procédure. Des cryolabels spéciaux sont utilisés qui préservent leur intégrité même à très basse température (-196 oC).</li>
	<li>À température ambiante, distribuer 0,3 ml de solution d'équilibre (ES) (tableaudes matériaux)pour chaque blastocyste qui sera vitrifié.</li>
	<li>En présence d'un témoin, déplacez le blastocyste en ES à l'aide de la pipette de décapage de 300 m.</li>
	<li>Laisser le blastocyste dans l'ES pendant 13 à 15 min. Après un premier rétrécissement du volume, une réexpansion graduelle sera observée.</li>
	<li>Remplissez une petite grille de refroidissement d'azote liquide (LN2) et placez-la sous le capot d'écoulement laminaire.</li>
	<li>Dispense 300 L de solution de vitrification (VS) (Tableau des Matériaux) dans le deuxième puits. Après la réexpansion complète du blastocyste, transférez-le dans la solution VS pendant 1 min et rincez-le pour diluer l'ES.</li>
	<li>En présence d'un témoin, chargez le blastocyste sur le support de vitrification et prenez soin d'enlever l'excès de VS. Un film subtil de solution devrait entourer le blastocyste.</li>
	<li>Plongez le support de vitrification dans Le LN2 et déplacez-le énergiquement afin de réduire le risque de formation de bulles près du spécimen.</li>
	<li>Placez le bouchon de protection tout en gardant le support de vitrification immergé dans le LN2.
</li>
	<li>En présence d'un témoin, déplacez le support de vitrification dans un réservoir de stockage LN2 à long terme.</li>
</ol>7. Rétrécissement artificiel des blastocystes non biopsiés
<ol><li>
Si aucune biopsie TE n'est effectuée, effondrez artificiellement les blastocystes immédiatement avant la vitrification (Figure 4).
	<ol>
<li>Déplacez le plat de culture de l'incubateur au microscope inversé et concentrez-vous sur l'embryon sélectionné.</li>
		<li>Passez à l'objectif laser (impulsion pré-fixée : 0,3 ms, 6,5 m), ciblez la zona pellucida du côté opposé de l'ICM, puis dirigez des impulsions laser de 1 à 2 vers les jonctions entre les cellules TE à une distance sécuritaire de l'ICM. Les blastocystes devraient s'effondrer en moins de 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procéder à la vitrification du blastocyste effondré tel que décrit dans la section 6.</li>
</ol>8. Réchauffement de Blastocysttransférable
<ol><li>Le jour de l'ET, préparez la plaque ET 4-puits en plaçant 600 L de milieu de culture de FIV pré-équilibré pour chaque puits. Incuber à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O2, 6 % CO2), tout en effectuant un réchauffement blastocyste.</li>
	<li>Étiquetez le plat chauffant avec le nom et le nom de famille de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera réchauffé en lui.</li>
	<li>Distribuer 1 ml de la solution de décongélation (TS) (tableaudes matériaux)dans un plat iVF d'un puits (figuresupplémentaire 1) et le réchauffer à 37 oC dans un thermostat pendant au moins 1 h avant de commencer la procédure.</li>
	<li>Remplissez un petit support de refroidissement avec LN2 et placez-le dans le capot d'écoulement laminaire à proximité de la zone de travail.</li>
	<li>Avant de commencer la procédure, vérifiez les informations blastocystes rapportées sur le soutien de vitrification. Toutes les pièces d'intention doivent correspondre au rapport génétique et le blastocyste au chaud doit être choisi parmi les plus transférables. Un témoin est requis pendant l'intervention.</li>
	<li>Sortez le plat d'un puits contenant de la TS réchauffée du thermostat et placez-le sur une scène chauffée sous le stéréomicroscope.</li>
	<li>Tirez sur le bouchon de protection dans le LN2 à l'aide de forceps.</li>
	<li>Plongez rapidement la pointe du support de vitrification dans le TS de 37 oC.</li>
	<li>Sous observation microscopique, déplacez doucement le support de vitrification jusqu'à ce que le blastocyste soit libéré de la pointe.</li>
	<li>Laissez le blastocyste pendant un total de 1 min dans le TS, en faisant attention pour le garder au fond de la TS.</li>
	<li>À température ambiante, distribuez 200 l de solution de dilution (DS) (Tableaudes matériaux)sur le premier puits de la plaque de vitrification.</li>
	<li>Transférer le blastocyste à DS et le placer au fond du puits tout en libérant un peu de TS sur le dessus de celui-ci pour créer une sorte de gradient. Laisser agir 3 min.</li>
	<li>Distribuer 200 l de solution de lavage (WS) dans 2 puits différents (WS1 et WS2).</li>
	<li>Transférer le blastocyste à WS1 et le placer sur le fond du puits tout en libérant un peu de milieu DS sur le dessus de celui-ci. Ensuite, transférer le blastocyste à WS2 et le laisser intact pendant 1 min.</li>
	<li>Étiquetez la plaque ET post-réchauffement avec le nom et le nom de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera cultivé en elle.</li>
	<li>En présence d'un témoin, transférez le blastocyste réchauffé au milieu de culture pré-équilibré dans la plaque ET post-réchauffement.</li>
	<li>Rincer le blastocyste dans le premier puits de la plaque ET et le placer dans le deuxième puits.</li>
	<li>Transférer le plat de culture post-réchauffement à l'incubateur dans une atmosphère contrôlée (37 oC, 6 % CO2, 5 % O2) et culture du blastocyste pendant au moins 1,5 h avant de vérifier sa survie et sa réexpansion. REMARQUE: La figure 5 montre des exemples de blastocystes dégénérés, cryo-survivants, mais non réexpansés et cryo-survivants et entièrement expansés.</li>
</ol>9. EmbryoTransfert
<ol><li>Pour effectuer ET, placez le plat sur la scène chauffée de la hotte à débit laminaire, de sorte que l'embryon est visible sous le microscope à un faible grossissement.</li>
	<li>Prenez environ 0,4 ml de milieu de culture FIV. Fixez fermement la pointe de la seringue dans l'extrémité de réception du cathéter interne, puis relâchez le milieu jusqu'à 0,1 ml.</li>
	<li>Aspirez le milieu de culture jusqu'à ce qu'ils observent les embryons entrant dans le cathéter (quantité minimale de milieux : 10 à 15 l).</li>
	<li>Placez le cathéter dans le boîtier en plastique et allez à la salle d'opération et placez le cathéter interne dans le guide externe.</li>
	<li>Une fois atteint l'utérus, poussez le piston de seringue pour libérer l'embryon. Relâchez très lentement le milieu jusqu'à ce que le piston lisse 0,1 ml.</li>
	<li>Aprenez le cathéter au laboratoire et vérifiez au microscope que l'embryon a été transféré.</li>
</ol>

<ol><li>Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+stage+versus+blastocyst+stage+embryo+transfer+in+assisted+reproductive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118(2016).</li>
<li>Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+chromosome+screening+improves+embryo+selection%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis.</a> Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Biopsy+on+Human+Embryo+Developmental+Potential+during+Preimplantation+Genetic+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+International%22%5BJournal%5D)">The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis.</a> Biomedical Research International. 2016, 7193075(2016).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+standard+blastocyst+morphology%2C+euploidy+and+implantation%3A+an+observational+study+in+two+centers+involving+956+screened+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts.</a> Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+PGD%2FPGD-A+in+IVF+clinics%3A+considerations+for+the+best+laboratory+approach+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).</li>
<li>McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnancies+and+live+births+after+trophectoderm+biopsy+and+preimplantation+genetic+testing+of+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts.</a> Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).</li>
<li>Kokkali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+healthy+infant+following+trophectoderm+biopsy+from+blastocysts+for+PGD+of+beta-thalassaemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major.</a> Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).</li>
<li>Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preincubation+of+human+oocytes+may+improve+fertilization+and+embryo+quality+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection.</a> Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).</li>
<li>Wale, P. L., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+chemical+and+physical+factors+on+mammalian+embryo+culture+and+their+importance+for+the+practice+of+assisted+human+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).</li>
<li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte%2C+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART%3A+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+blastocyst+features%2C+trophectoderm+biopsy+and+other+laboratory+practice+with+post-warming+behavior+and+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation.</a> Human Reproduction. , (2018).</li>
<li>Evans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+versus+frozen+embryo+transfer%3A+backing+clinical+decisions+with+scientific+and+clinical+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence.</a> Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+and+reproducible+outcomes+of+blastocyst+biopsy+and+aneuploidy+screening+across+different+biopsy+practitioners%3A+a+multicentre+study+involving+2586+embryo+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies.</a> Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+mode+and+effects+analysis+of+witnessing+protocols+for+ensuring+traceability+during+PGD%2FPGS+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles.</a> Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).</li>
<li>Gardner, D. K., Schoolcraft, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGardner%2C+DK+%22Towards+Reproductive+Certainty%3A+Infertility+and+Genetics+Beyond+1999%22">Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999</a>. Jansen, R., Mortimer, D. , Parthenon Press. 377-388 (1999).</li>
<li>Cimadomo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inconclusive+chromosomal+assessment+after+blastocyst+biopsy%3A+prevalence%2C+causative+factors+and+outcomes+after+re-biopsy+and+re-vitrification.+A+multicenter+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience.</a> Human Reproduction. , (2018).</li>
<li>de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+to+blastocyst+biopsy+for+preimplantation+genetic+diagnosis+and+single+embryo+transfer+at+Sydney+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.</a> Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).</li>
<li>Capalbo, A., Rienzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaicism+between+trophectoderm+and+inner+cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass.</a> Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).</li>
<li>McCoy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Selection+against+Complex+Mitotic-Origin+Aneuploidy+during+Preimplantation+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development.</a> PLoS Genetics. 11 (10), e1005601(2015).</li>
<li>Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage-stage+biopsy+significantly+impairs+human+embryonic+implantation+potential+while+blastocyst+biopsy+does+not%3A+a+randomized+and+paired+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial.</a> Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+births+after+transfer+of+rebiopsy+and+revitrification+of+blastocyst+that+had+%E2%80%9Cno+diagnosis%E2%80%9D+following+trophectoderm+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy.</a> Fertility and Sterility. 106 (3), e164(2016).</li>
<li>Capalbo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+efficacy+of+blastocoel+fluid+and+spent+media+as+sources+of+DNA+for+preimplantation+genetic+testing+in+standard+clinical+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions.</a> Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).</li>
<li>Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+mitochondrial+DNA+in+blastocoele+fluid+and+embryo+culture+medium%3A+evidence+and+potential+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use.</a> Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).</li>
<li>Vera-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+composition+of+cell-free+DNA+in+spent+medium+from+human+embryo+culture+during+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development.</a> Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Seuls les embryologistes qualifiés expérimentés qui ont terminé leur période de formation devraient effectuer la biopsie TE et la vitrification blastocyste. De plus, un témoin est tenu de surveiller les procédures et de garantir une traçabilité efficace pendant i) les mouvements du blastocyste biopsié du plat de biopsie (figure supplémentaire 1) au plat post-biopsie (figure supplémentaire1 ), puis à la plaque de vitrification (figure supplémentaire 1) et enfin au support...

L'objectif principal de l'embryologie humaine moderne est de maximiser le nombre de naissances vivantes par cycle stimulé et de réduire les coûts, le temps et les efforts pour atteindre une grossesse. Pour atteindre cet objectif, des approches validées pour la sélection des embryons devraient être utilisées pour identifier les embryons compétents en matière de reproduction au sein d'une cohorte obtenue au cours d'un cycle de FIV. Selon les dernières preuves, la culture blastocyste1 combinée à des tests chromosomiques complets et au transfert d'embryons euploïdes vitrifiés (ET) est le cadre le plus efficace pour augmenter l'efficacité de la FIV2. De toute évidence, le dépistage de l'anéuploïde nécessite un spécimen embryonnaire, qui est actuellement principalement représenté à partir de quelques cellules extraites du trophectoderm (TE), c'est-à-dire la section du blastocyste qui donne naissance aux annexes embryonnaires (par exemple, le placenta) pendant la grossesse . Au-delà de l'analyse karyotype, des mutations génétiques uniques pourraient également être évaluées à partir d'une biopsie TE dans le cadre d'une stratégie clinique connue sous le nom de test génétique préimplantatoire (PGT; -A pour les anéuploidies, -SR pour les réarrangements chromosomiques structurels, -M pour les maladies monogéniques). D'autres méthodes de biopsie d'ovocyte/embryon ont été théorisées et adoptées cliniquement au cours des dernières décennies, à savoir la biopsie des corps polaires et la biopsie blastomere. Cependant, leur utilisation est réduite de nos jours puisque leurs inconvénients procéduraux (p. ex., charge de travail et risque accrus d'impact sur la reproduction) et leurs limitations diagnostiques (p. ex., problèmes d'analyse cellulaire unique) entravent implicitement un équilibre suffisant entre les coûts, les risques et les avantages (pour un examen voir3).
Dans cet article, l'un des protocoles principaux pour la biopsie de TE est soigneusement décrit avec les procédures suivantes de vitrification, de réchauffement et de transfert exigées. Le flux de travail décrit ici est idéal pour une unité DE TGP occupée.
Comme déjà décrit précédemment par notre groupe4,5, la procédure implique l'ouverture séquentielle de la pellucida zona de blastocystes entièrement élargis et l'élimination de quelques cellules TE (en moyenne 7-8). Comparée à la méthode de biopsie blastocyste à base d'éclosion laser-assistée36, cette procédure pourrait faciliter le programme quotidien d'une unité de FIV où les procédures délicates, telles que la biopsie blastocyste et la vitrification, doivent être exécutées en temps opportun. Dès que le blastocyste atteint sa pleine expansion, la biopsie peut être effectuée en sélectionnant les cellules TE à enlever, empêchant ainsi le risque d'hernie de la masse cellulaire interne (ICM), ce qui rendrait autrement la procédure difficile. Dans la littérature, un troisième protocole de biopsie blastocyste a également été décrit, qui implique l'éclosion au laser assistée étant effectuée une fois que l'embryon a déjà atteint le stade blastocyste, quelques heures avant la procédure5,7. Cependant, cette approche prend plus de temps et convient principalement aux unités de FIV qui mettent en œuvre la biopsie TE entre les mains d'opérateurs peu expérimentés et en raison d'une charge de travail quotidienne modérée-faible.
L'injection de spermatozoïdes intracytoplasmatic (ICSI)8 devrait être une technique consolidée si l'objectif de mener des analyses génétiques dans la FIV. De même, un système de culture approprié pour récolter en toute sécurité les embryons au stade blastocyste est crucial pour la mise en œuvre de la stratégie de biopsie TE. Un nombre suffisant d'incubateurs, ainsi que l'utilisation de faible tension d'oxygène sont des conditions préalables clés à cette fin, de ne pas compromettre le taux de blastocyste9. En même temps, un programme de cryoconservation efficace est nécessaire pour gérer en toute sécurité un cycle pgT. Au cours de la dernière décennie, la mise en œuvre de la vitrification a augmenté les taux de cryo-survie des embryons, même jusqu'à 99 %10,11. Cela a fourni suffisamment de temps pour effectuer des tests génétiques et reporter le transfert d'embryons au cycle menstruel suivant, sur un endomètre non stimulé et probablement plus réceptif12.
La biopsie TE et la vitrification exigent des tâches exigeantes et leur efficacité peut varier d'un opérateur inexpérimenté à l'autre. Une période de formation spécifique est donc préconisée avant de permettre à chaque opérateur d'effectuer ces interventions cliniquement; en outre, le maintien des compétences des opérateurs devrait être évalué périodiquement en surveillant les indicateurs de performance clés (KPI) pour les procédures de cryoconservation et de biopsie. Chaque clinique de FIV doit définir les indicateurs de la santé interne à cette fin, qui doivent se rapprocher de ceux publiés par les consortiums internationaux et/ou des résultats publiés par les laboratoires de référence.
La biopsie TE, le réchauffement de la vitrification et les procédures de témoignage sont des techniques validées dans notre unité, qui ont été normalisées dans tous les opérateurs impliqués comme indiqué dans trois publications précédentes11,13,14 .

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold tube rack</td><td>Biocision</td><td>XTPCR96</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de pipette électronique</td><td>Fisher Scientific</td><td>710931</td><td></td></tr><tr><td>Flexipet Poignée réglable</td><td>Cook</td><td>G18674</td><td>Porte-décapant</td></tr><tr><td>Gilson Pipetman</td><td>Gilson</td><td>66003</td><td>p20</td></tr><tr><td>IVF Système de témoin électronique</td><td>CooperSurgical Fertility & Solutions génomiques</td><td>RI Witness Système de gestion ART</td>Microscope inversé Nikon Eclipse TE2000-U Hotte à flux laminaire IVF TECH Débit d’air Grade A Objectif laser RI Saturn 5 Micro-injecteurs Nikon Narishige NT-88-V3 Mini centrifugeuse pour tubes PCR Eppendorf <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>CSLQSPIN</td><td>pour tubes PCR de 0,2 mll</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Leica</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Thermostat</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5AC-PE</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur trigaz</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5M-PE</td><td>02/CO2</td></tr><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pipette de biopsie</td><td>RI</td><td>7-71-30FB35720</td><td>30 &micro ; m ID, plat 35 &deg ; C</td></tr><tr><td>Cryolock</td><td>Cryolock</td><td>CL-R-CT</td><td></td></tr><tr><td>CSCM complet</td><td>Irvine Scientific</td><td>90165</td><td>Milieu de culture FIV complété par HSA</td></tr><tr><td>Cathéter de transfert d’embryons</td><td>Cook</td><td>G17934</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Flexipet</td><td>Cook</td><td>G26712</td><td>140&micro ; m pointe de pipette de décapage</td></tr><tr><td>Pipette Flexipet</td><td>Cook</td><td>G46020</td><td>300&micro ; m pointes de pipette de décapage</td></tr><tr><td>Pipette de maintien</td><td>RI</td><td>7-71-IH35/20</td><td>30 &micro ; m ID, plat 35 &deg ; C</td></tr><tr><td>Sérum humain Albumine</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr><tr><td>FIV Plat à un puits</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale pour culture d’embryons</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Medium HTF modifié</td><td>Irvine Scientific</td><td>90126</td><td>Milieu tamponné à l’Hepes</td></tr><tr><td>Nuclon Delta Surface</td><td>Thermofisher scientific</td><td>176740</td><td>Plat de FIV 4- Plaque à puits avec couvercle coulissant</td></tr><tr><td>Primaria Plat de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>353802</td><td>60 mm x15 mm</td></tr><tr><td>Reproplate</td><td>Kitazato</td><td>83016</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>10ml</td></tr><tr><td>Stérile jetable Embouts Gilson</td><td>Eppendorf</td><td>0030 075.021</td><td>200 &micro ; </td></tr><tr><td>L Kit de tubulure</td><td>Fourni par le laboratoire</td><td></td> de génétique <td>Tubes PCR (0,2 mL), solution de chargement, solution de lavage de biopsie</td></tr><tr><td>Milieux de vitrification</td><td>Kitazato</td><td>VT801</td><td>Solutions d’équilibrage et de vitrification</td></tr><tr><td>Milieux chauffants</td><td>Kitazato</td><td>VT802</td><td>Solutions de décongélation et de dilution</td></tr></tbody></table>

biopsie et vitrification humaines de blastocyst

Human Blastocyst Biopsy and Vitrification

La biopsie de Blastocyst est effectuée pour obtenir un diagnostic génétique fiable pendant des cycles de FIV avec l'essai génétique préimplantatoire. Ensuite, le flux de travail idéal implique un protocole de vitrification sûr et efficace, en raison du délai d'exécution des techniques de diagnostic et de transférer l'embryon sélectionné sur un endomètre physiologique dans un cycle naturel suivant. Une approche de biopsie englobant l'ouverture séquentielle de la zona pellucida et la récupération de 5-10 cellules de trophectoderm (idéalement 7-8) limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales. Après une formation adéquate, la technique a été reproductible entre différents opérateurs en termes de synchronisation de la biopsie (8 min, allant de 3 à 22 min en fonction du nombre d'embryons à la biopsie par plat), diagnostics concluants obtenus (97,5%) et les taux de natalité vivante après le transfert de blastocyste euploïde vitrifié (40 %). Le taux de survie après biopsie, vitrification et réchauffement était aussi élevé que 99,8%. Le taux de réexpansion à 1,5 h du réchauffement était aussi élevé que 97%, en grande partie dépendant du moment entre la biopsie et la vitrification (idéalement 30 min), la qualité morphologique blastocyste et le jour de la biopsie. En général, il est préférable de vitrifier un blastocyste effondré; par conséquent, dans les cycles non-PGT, le rétrécissement artificiel laser-assisté pourrait être exécuté pour induire l'effondrement d'embryon avant la cryoconservation. La perspective future la plus prometteuse est l'analyse non invasive des médias de culture de FIV après la culture blastocyste comme source putative de l'ADN embryonnaire. Toutefois, cette avant-garde potentielle est toujours à l'étude et un protocole fiable doit encore être défini et validé.

La figure 6 représente un schéma de tous les résultats d'une procédure de biopsie qui peut être adoptée pour normaliser le protocole et surveiller le rendement de chaque opérateur. Le principal résultat procédural est le moment pour terminer la biopsie/biopsies; le principal résultat technique est la qualité de l'intrigue produite après des tests génétiques qui pourraient entraîner un diagnostic concluant ou non concluant, ce dernier qui nécessite une re-biop...

La biopsie et la vitrification de Blastocyst sont nécessaires pour mener efficacement le test génétique préimplantatoire. Une approche impliquant l'ouverture séquentielle de la pellucida de zona et la récupération de 7-8 cellules de trophectoderm dans le jour 5-7 post-insémination limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales.

Biopsie et vitrification humaines de Blastocyst

Blastocyst biopsy is performed to obtain a reliable genetic diagnosis during IVF cycles with preimplantation genetic testing. Then, the ideal workflow ...

La biopsie blastocyste et la vitrification ont été une révolution dans la FIV, la fécondation in vitro, permettant aux embryologistes du monde entier d’effectuer des tests génétiques préimplantatoires sur des embryons humains avec un risque minimal pour l’embryon. La biopsie trophectoderm a permis la récupération d’environ sept cellules à partir d’un embryon adulte, permettant ainsi une analyse génétique robuste en aval. De plus, aucune incidence n’a été démontrée, à ce jour, sur cette approche.L’efficacité clinique de ce flux de travail permet aux patients présentant des conditions monogéniques et à tous les patients présentant un risque accru d’anomalies chromosomiques dans leur blastocyste de bénéficier de tests génétiques préimplantation. Il est encore temps d’améliorer les stratégies actuelles de sélection des embryons. Par exemple, le profilage miRNomic et protéomique représente des options intrigantes pour compléter les tests génétiques préimplantation sur une biopsie trophectoderm unique.Les opérateurs inexpérimentés ont souvent du mal à ouvrir et pénétrer la zona pellucida. C’est juste une question de concentration. Le blastocyste, l’objectif laser et les pipettes doivent être sur le même plan focal.Après avoir étiqueté le plat de biopsie avec les détails du patient, avec un marqueur permanent et non toxique, numérotez chaque goutte de 10 microlitres de milieu tamponné HEPES avec l’embryon et le cycle ID.Using a 300-micrometer décapage pipette, transférer un viable, blastocyste entièrement élargi à la première goutte du plat de biopsie et rincer la goutte pour enlever le milieu de culture excédentaire, avant de déplacer le blastocyste dans la deuxième goutte dans le plat. Placer le plat sous un microscope inversé, et amorce la pipette biopsie avec moyen à partir de la troisième goutte du plat de biopsie. Sous un grossissement de 20 fois, orientez le blastocyste pour obtenir une vue claire de la masse cellulaire interne à sept heures, et fixez l’embryon sur la pipette de fixation.Concentrez-vous sur la zona pellucida afin que les pipettes et les blastocystes soient sur le même plan focal. Passez à l’objectif laser, et placez le pointeur laser sur la zona pellucida de l’autre côté de la masse cellulaire interne. Percer la zona pellucida avec deux à trois impulsions laser, et appuyez doucement sur la pipette biopsie contre la zona pellucida pour permettre au milieu d’être soufflé par la brèche pour détacher les cellules trophectoderm de la surface interne.Lorsque le trophectoderm est détaché, entrez par le trou et aspirez sept à huit cellules trophectoderm dans la pipette biopsie avec aspiration douce. Tout en appliquant une aspiration modérée pour étirer les cellules cibles, déplacez légèrement la pipette biopsie vers l’arrière et dirigez le laser vers la partie la plus mince des cellules aspirées. Tirez deux à cinq impulsions laser aux jonctions entre les cellules pour séparer les cellules cibles du corps de l’embryon.Lorsque le fragment trophectoderm a été séparé du blastocyste, relâchez le fragment dans la même chute de biopsie loin du blastocyste pour empêcher le fragment d’être aspiré dans la pipette biopsie. Relâchez le blastocyste de la pipette de fixation, et soulevez rapidement les deux pipettes pour empêcher le fragment de coller aux pipettes. Puis l’image du fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité.Lorsque tous les blastocystes ont été biopsiés comme il vient de le démontrer, déplacez le plat de biopsie vers le capot d’écoulement laminaire et étiquetez le plat de culture post-biopsie avec l’ID du couple et chaque goutte avec l’embryon et les pièces d’identité à cycle. En présence d’un témoin, rincer le blastocyste dans un milieu de FIV propre et déplacer le blastocyste à sa baisse correspondante dans le plat post-biopsie. Ensuite, placez le plat post-biopsie à un 37 degrés Celsius, 6% de dioxyde de carbone, et 5% incubateur d’oxygène.En présence du témoin et à l’intérieur d’un capot d’écoulement laminaire à température ambiante, étiquetez les tubes PCR avec un marqueur permanent et non toxique. Étiquetez le couvercle d’un plat de culture de tube de 60 x 15 millimètres avec les pièces d’iD d’embryon biopsiées, et ajoutez deux gouttes de 10 microlitres de solution de lavage de biopsie au plat. Prime une pipette de décapage de 140 micromètres avec solution de lavage biopsie de la deuxième goutte du plat de tube sous le microscope stéréo pour visualiser les fragments de trophectoderm.Relâchez doucement une solution de lavage de biopsie sur le fragment de trophectoderme, et chargez le fragment dans la pipette de décapage. Déplacez le fragment vers la deuxième goutte de la solution de lavage de biopsie, et rincez soigneusement le tissu deux à trois fois. Transférer le fragment de trophectoderm au fond du tube PCR dûment étiqueté avec la solution de chargement, en prenant soin d’éviter de toucher les parois du tube avec la pointe de la pipette de décapage.Lorsque tous les fragments ont été ajoutés à leurs tubes, faites tourner tous les tubes dans une mini centrifugeuse pendant quelques secondes pour sédimenter les fragments. Rangez ensuite les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient expédiés au laboratoire génétique de référence pour analyse. Dans les 30 minutes de biopsie trophectoderm, étiquetez une plaque de vitrification avec les détails du patient et les iD des blastocystes qui doivent être vitrifiés.À l’aide de cryolabels spéciaux résistants à la température froide, étiquetez les supports de vitrification avec le nom et le nom de famille du patient, l’identification du couple, l’identité de l’embryon qui y sera chargé et la date de l’intervention. À température ambiante, distribuez 300 microlitres de solution d’équilibrage pour chaque blastocyste qui sera vitrifié et, en présence d’un témoin, utilisez une pipette décapage de 300 micromètres pour déplacer le blastocyste en un volume de solution d’équilibrage. Laissez le blastocyste dans la solution d’équilibrage pendant 13 à 15 minutes.Après un retrait initial du volume, une ré-expansion progressive sera observée. À la fin de l’équilibrage, ajouter 300 microlitres de solution de vitrification au deuxième puits de la plaque de vitrification et transférer le blastocyste complètement re-élargi à la solution de vitrification pendant une minute. À la fin de l’incubation, rincer le blastocyste pour diluer la solution d’équilibrage et, en présence d’un témoin, charger le blastocyste sur le support de vitrification.Supprimer l’excès de solution de vitrification. Un film subtil de solution devrait entourer le blastocyste. Plongez le support de vitrification dans de l’azote liquide et déplacez vigoureusement le support pour réduire le risque de formation de bulles près de l’échantillon.Placez ensuite le bouchon protecteur sur le support pendant que le support de vitrification est encore immergé dans de l’azote liquide. Sur les 1 544 interventions de biopsie trophectoderm effectuées au cours de cette période représentative de deux ans, entre un et quatre blastocystes ont été biopsiés par procédure pendant trois à 22 minutes par intervention. Dans ces parcelles, le moment moyen de la biopsie pour chaque opérateur le long des trimestres d’étude est indiqué, avec une valeur globale moyenne de 8,24 minutes.Il est utile d’acquérir une image de chaque fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité afin d’évaluer si la cause des diagnostics non concluants était imputable à la dimension et/ou à la qualité du fragment, au tube ou à certains problèmes dans le traitement de l’échantillon dans le laboratoire génétique. Dans cette étude, 572 blastocystes euploïdes ont été réchauffés pour subir un transfert d’embryon après un diagnostic d’euploïde. Tous les blastocystes vitrifiés dans les 30 minutes, avec 2,4% des blastocystes ne se redynamisonne pas entre 31 et 90 minutes et 4,9% ne se ré-expansion au-delà de 90 minutes de réchauffage.Surtout pour les blastocystes de mauvaise qualité et/ou de septième jour, le moment entre biopsie et vitrification semble crucial pour parvenir à une ré-expansion après le réchauffement. Prenez soin de se concentrer avant d’ouvrir la zona pellucida lors de l’exposition de la jonction entre la cellule trophectoderm et le tir, et prendre soin aussi d’empêcher la réexpane blastocyste avant la vitrification. Deux autres approches de biopsie blastocyste existent, impliquant à la fois l’ouverture de zona pellucida et l’attente d’un arqué spontané des cellules trophectoderm.Ces approches sont plus faciles, mais nécessitent plus de manipulations et prennent plus de temps. L’efficacité de ce flux de travail permet la mise en œuvre de technologies moléculaires en FIV afin d’essayer de sélectionner le blastocyste ayant le plus de chances de s’implanter avant le transfert d’embryons. N’oubliez pas de ne pas utiliser d’appareil ou de solution qui pourrait être toxique pour les embryons et de prévenir la contamination par l’ADN en utilisant des matériaux exempts d’ADN.

human-blastocyst-biopsy-and-vitrification

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

MicroSecure Vitrification a été développé en tant que système de dispositif de vitrification fermé aseptique non commercial, conforme aux bonnes pratiques de fabrication et de manipulation des tissus de la FDA. En raison du retrait des pailles d’embryons bouchés hydrophobes de l’industrie, la procédure de vitrification a été modifiée pour inclure un joint intérieur avant le bouchon intérieur en coton standard.

Modifié MicroSecure Vitrification: Une très procédure Cryoconservation sûre et efficace, simple et blastocystes humains

Les techniques de procréation assistée (ARTs) sont en évaluation continue pour améliorer les résultats et réduire les risques associés. Ce manuscrit décrit une procédure de transfert d’embryons mini-invasive avec un protocole de cryoconservation efficace qui permet l’utilisation de lapins comme modèle animal idéal de reproduction humaine.

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Nous présentons ici un protocole de time-lapse morphométriques pour suivre l’intensité du rétrécissement du blastocyste et re-expansion durant les interventions de previtrification et récupération après réchauffement. L’application du protocole est possible dans les laboratoires in vitro fertilization équipés de microscopes time-lapse et est recommandée dans le développement d’une méthode de vitrification de blastocyste optimale.

Morphométrique protocole pour l’évaluation Objective du comportement de blastocyste pendant la Vitrification et étapes de réchauffement de la planète

Ici, nous décrivons une méthode pour réchauffer les blastocystes humains vitrifiés, les cultiver à travers la période d’implantation in vitro, les digérer en cellules individuelles et recueillir les cellules trophoblastiques précoces pour une étude plus approfondie.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

La présente étude fait état d’un protocole de criblage chromosomique d’embryons humains qui utilise un milieu de culture épuisé, ce qui évite la biopsie embryonnaire et permet l’identification de la ploïdie chromosomique à l’aide du NGS. Le présent article présente la procédure détaillée, y compris la préparation du milieu de culture, l’amplification du génome entier (WGA), la préparation de la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) et l’analyse des données.

Criblage chromosomique d’embryons humains préimplantatoires à l’aide de milieux de culture épuisés : prélèvement d’échantillons et analyse de la ploïdie chromosomique

Lorsque les protéines précurseurs de la famille ß du facteur de croissance transformant sont exprimées ectopiquement dans les embryons de Xenopus laevis, elles se dimérisent, se clivent et sont sécrétées dans le blastocoele, qui commence à la fin de la blastula au stade précoce de gastrula. Nous décrivons une méthode d’aspiration des produits de clivage de la cavité blastocoèle pour l’analyse immunoblot.

Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis

Ici, nous présentons le protocole Spatula Montevideo pour vitrifier les embryons préimplantatoires de souris et de moutons, composé d’une spatule faite maison et utilisant des solutions faites maison. Les embryons sont rapidement équilibrés dans deux solutions cryoprotectrices de concentration croissante, chargés sur la spatule, immergés dans de l’azote liquide et enfin scellés avec une paille de 0,5 ml.

Spatule Montevideo Dispositif pour la vitrification d’embryons de mammifères

Les principaux types de cellules adhérentes dérivées du muscle humain sont les cellules myogéniques et les fibroblastes. Ici, les populations cellulaires sont enrichies à l’aide d’un tri cellulaire activé par magnétisme basé sur l’antigène CD56. L’immunomarquage ultérieur avec des anticorps spécifiques et l’utilisation de techniques d’analyse d’images permettent de quantifier les caractéristiques cytoplasmiques et nucléaires dans les cellules individuelles.

Isolement et quantitative immunocytochimique caractérisation des cellules myogéniques primaires et fibroblastes de muscle squelettique humain

Épines dendritiques des neurones pyramidaux sont les sites de la plupart des synapses excitatrices de cortex cérébral de mammifère. Cette méthode décrit une analyse quantitative 3D de la morphologie de la colonne vertébrale dans les neurones pyramidaux du cortex glutamatergiques humaines dérivées de cellules souches pluripotentes induites.

Quantification tridimensionnelle d&#39;épines dendritiques de Pyramidal neurones humains induits Dérivé de cellules souches pluripotentes

Voici un protocole pour cultiver des cellules souches pluripotentes (CSP) et des cellules souches neurales (CSN) dans un système de culture cellulaire fermé qui permet une stérilité et une reproductibilité maximales, remplaçant l’enceinte de biosécurité et l’incubateur traditionnels. Cet équipement est conforme aux directives de bonnes pratiques de fabrication clinique (cGMP) et de bonnes pratiques de laboratoire clinique (cGLP).

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

Découvrez la biopsie de trophectoderme et la vitrification pour le diagnostic génétique préimplantatoire sur embryons humains. Cette technique sécurisée permet d'extraire 7 à 8 cellules sans risque pour le blastocyste.

Biopsie et vitrification humaines de Blastocyst

Explorer plus de vidéos