Biopsie et vitrification humaines de Blastocyst

La biopsie blastocyste et la vitrification ont été une révolution dans la FIV, la fécondation in vitro, permettant aux embryologistes du monde entier d’effectuer des tests génétiques préimplantatoires sur des embryons humains avec un risque minimal pour l’embryon. La biopsie trophectoderm a permis la récupération d’environ sept cellules à partir d’un embryon adulte, permettant ainsi une analyse génétique robuste en aval. De plus, aucune incidence n’a été démontrée, à ce jour, sur cette approche.

L’efficacité clinique de ce flux de travail permet aux patients présentant des conditions monogéniques et à tous les patients présentant un risque accru d’anomalies chromosomiques dans leur blastocyste de bénéficier de tests génétiques préimplantation. Il est encore temps d’améliorer les stratégies actuelles de sélection des embryons. Par exemple, le profilage miRNomic et protéomique représente des options intrigantes pour compléter les tests génétiques préimplantation sur une biopsie trophectoderm unique.

Les opérateurs inexpérimentés ont souvent du mal à ouvrir et pénétrer la zona pellucida. C’est juste une question de concentration. Le blastocyste, l’objectif laser et les pipettes doivent être sur le même plan focal.

Après avoir étiqueté le plat de biopsie avec les détails du patient, avec un marqueur permanent et non toxique, numérotez chaque goutte de 10 microlitres de milieu tamponné HEPES avec l’embryon et le cycle ID.Using a 300-micrometer décapage pipette, transférer un viable, blastocyste entièrement élargi à la première goutte du plat de biopsie et rincer la goutte pour enlever le milieu de culture excédentaire, avant de déplacer le blastocyste dans la deuxième goutte dans le plat. Placer le plat sous un microscope inversé, et amorce la pipette biopsie avec moyen à partir de la troisième goutte du plat de biopsie. Sous un grossissement de 20 fois, orientez le blastocyste pour obtenir une vue claire de la masse cellulaire interne à sept heures, et fixez l’embryon sur la pipette de fixation.

Concentrez-vous sur la zona pellucida afin que les pipettes et les blastocystes soient sur le même plan focal. Passez à l’objectif laser, et placez le pointeur laser sur la zona pellucida de l’autre côté de la masse cellulaire interne. Percer la zona pellucida avec deux à trois impulsions laser, et appuyez doucement sur la pipette biopsie contre la zona pellucida pour permettre au milieu d’être soufflé par la brèche pour détacher les cellules trophectoderm de la surface interne.

Lorsque le trophectoderm est détaché, entrez par le trou et aspirez sept à huit cellules trophectoderm dans la pipette biopsie avec aspiration douce. Tout en appliquant une aspiration modérée pour étirer les cellules cibles, déplacez légèrement la pipette biopsie vers l’arrière et dirigez le laser vers la partie la plus mince des cellules aspirées. Tirez deux à cinq impulsions laser aux jonctions entre les cellules pour séparer les cellules cibles du corps de l’embryon.

Lorsque le fragment trophectoderm a été séparé du blastocyste, relâchez le fragment dans la même chute de biopsie loin du blastocyste pour empêcher le fragment d’être aspiré dans la pipette biopsie. Relâchez le blastocyste de la pipette de fixation, et soulevez rapidement les deux pipettes pour empêcher le fragment de coller aux pipettes. Puis l’image du fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité.

Lorsque tous les blastocystes ont été biopsiés comme il vient de le démontrer, déplacez le plat de biopsie vers le capot d’écoulement laminaire et étiquetez le plat de culture post-biopsie avec l’ID du couple et chaque goutte avec l’embryon et les pièces d’identité à cycle. En présence d’un témoin, rincer le blastocyste dans un milieu de FIV propre et déplacer le blastocyste à sa baisse correspondante dans le plat post-biopsie. Ensuite, placez le plat post-biopsie à un 37 degrés Celsius, 6% de dioxyde de carbone, et 5% incubateur d’oxygène.

En présence du témoin et à l’intérieur d’un capot d’écoulement laminaire à température ambiante, étiquetez les tubes PCR avec un marqueur permanent et non toxique. Étiquetez le couvercle d’un plat de culture de tube de 60 x 15 millimètres avec les pièces d’iD d’embryon biopsiées, et ajoutez deux gouttes de 10 microlitres de solution de lavage de biopsie au plat. Prime une pipette de décapage de 140 micromètres avec solution de lavage biopsie de la deuxième goutte du plat de tube sous le microscope stéréo pour visualiser les fragments de trophectoderm.

Relâchez doucement une solution de lavage de biopsie sur le fragment de trophectoderme, et chargez le fragment dans la pipette de décapage. Déplacez le fragment vers la deuxième goutte de la solution de lavage de biopsie, et rincez soigneusement le tissu deux à trois fois. Transférer le fragment de trophectoderm au fond du tube PCR dûment étiqueté avec la solution de chargement, en prenant soin d’éviter de toucher les parois du tube avec la pointe de la pipette de décapage.

Lorsque tous les fragments ont été ajoutés à leurs tubes, faites tourner tous les tubes dans une mini centrifugeuse pendant quelques secondes pour sédimenter les fragments. Rangez ensuite les échantillons à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient expédiés au laboratoire génétique de référence pour analyse. Dans les 30 minutes de biopsie trophectoderm, étiquetez une plaque de vitrification avec les détails du patient et les iD des blastocystes qui doivent être vitrifiés.

À l’aide de cryolabels spéciaux résistants à la température froide, étiquetez les supports de vitrification avec le nom et le nom de famille du patient, l’identification du couple, l’identité de l’embryon qui y sera chargé et la date de l’intervention. À température ambiante, distribuez 300 microlitres de solution d’équilibrage pour chaque blastocyste qui sera vitrifié et, en présence d’un témoin, utilisez une pipette décapage de 300 micromètres pour déplacer le blastocyste en un volume de solution d’équilibrage. Laissez le blastocyste dans la solution d’équilibrage pendant 13 à 15 minutes.

Après un retrait initial du volume, une ré-expansion progressive sera observée. À la fin de l’équilibrage, ajouter 300 microlitres de solution de vitrification au deuxième puits de la plaque de vitrification et transférer le blastocyste complètement re-élargi à la solution de vitrification pendant une minute. À la fin de l’incubation, rincer le blastocyste pour diluer la solution d’équilibrage et, en présence d’un témoin, charger le blastocyste sur le support de vitrification.

Supprimer l’excès de solution de vitrification. Un film subtil de solution devrait entourer le blastocyste. Plongez le support de vitrification dans de l’azote liquide et déplacez vigoureusement le support pour réduire le risque de formation de bulles près de l’échantillon.

Placez ensuite le bouchon protecteur sur le support pendant que le support de vitrification est encore immergé dans de l’azote liquide. Sur les 1 544 interventions de biopsie trophectoderm effectuées au cours de cette période représentative de deux ans, entre un et quatre blastocystes ont été biopsiés par procédure pendant trois à 22 minutes par intervention. Dans ces parcelles, le moment moyen de la biopsie pour chaque opérateur le long des trimestres d’étude est indiqué, avec une valeur globale moyenne de 8,24 minutes.

Il est utile d’acquérir une image de chaque fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité afin d’évaluer si la cause des diagnostics non concluants était imputable à la dimension et/ou à la qualité du fragment, au tube ou à certains problèmes dans le traitement de l’échantillon dans le laboratoire génétique. Dans cette étude, 572 blastocystes euploïdes ont été réchauffés pour subir un transfert d’embryon après un diagnostic d’euploïde. Tous les blastocystes vitrifiés dans les 30 minutes, avec 2,4% des blastocystes ne se redynamisonne pas entre 31 et 90 minutes et 4,9% ne se ré-expansion au-delà de 90 minutes de réchauffage.

Surtout pour les blastocystes de mauvaise qualité et/ou de septième jour, le moment entre biopsie et vitrification semble crucial pour parvenir à une ré-expansion après le réchauffement. Prenez soin de se concentrer avant d’ouvrir la zona pellucida lors de l’exposition de la jonction entre la cellule trophectoderm et le tir, et prendre soin aussi d’empêcher la réexpane blastocyste avant la vitrification. Deux autres approches de biopsie blastocyste existent, impliquant à la fois l’ouverture de zona pellucida et l’attente d’un arqué spontané des cellules trophectoderm.

Ces approches sont plus faciles, mais nécessitent plus de manipulations et prennent plus de temps. L’efficacité de ce flux de travail permet la mise en œuvre de technologies moléculaires en FIV afin d’essayer de sélectionner le blastocyste ayant le plus de chances de s’implanter avant le transfert d’embryons. N’oubliez pas de ne pas utiliser d’appareil ou de solution qui pourrait être toxique pour les embryons et de prévenir la contamination par l’ADN en utilisant des matériaux exempts d’ADN.