Name: In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Découvrez un test de luciférase basé sur l'ARN in vitro pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus. Cette méthode permet d'analyser les effets des éléments cis de l'ARNm sur l'initiation de la traduction.

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Le projet a été financé par les instituts nationaux de la santé (AI128406 www.nih.gov) à ZY et en partie par le centre de recherche sur le cancer Johnson (http://cancer.k-state.edu) sous la forme de la bourse d’été étudiants diplômés à la police.

1. préparation du modèle d’ADN par PCR pour la transcription in vitro
<ol><li>Pour préparer le modèle d’ADN par PCR, amorces de conception. Lors de la conception des amorces considèrent des caractéristiques cruciales comme la longueur de l’amorce, la température de recuit (Tm), le contenu GC, 3 'fin avec G ou C etc. Remarque: Discutés en détail dans ces ouvrages25,26,27.</li>
	<li>Les amorces de conception pour produire l’amplicon de PCR contenant les éléments suivants dans la direction de 5 'à 3 ': T7-promoteur, chef de poly (a), luciférase d’Firefly ORF et une queue de poly (a) référée ci-après comme T7_12A-Fluc. Amorces de conception (avant et arrière) pour englober tous les éléments supplémentaires qui ne sont pas présents dans l’ADN du gabarit (figure 2a). Remarque: La séquence de tous les éléments se trouve dans le tableau 1.
</li>
	<li>Inclure plusieurs nucléotides supplémentaires dans l’amorce avant (5 '-3 ')28, suivi par le promoteur T7, le dirigeant poly (A) ou la séquence 5 '-UTR souhaitée et environ 20 nucléotides, ajuster sur la base de Tm, correspondant à l’extrémité 5 'du gène reporter Orf. Assurez-vous que la région correspondante dans l’amorce est identique au brin de sens (+ brin) du gène. Remarque: Pour les longs 5 '-UTR, synthétiser deux fragments d’ADN: un avec le promoteur T7 suivi d’un long 5 '-UTR et d’une seconde avec l’ORF du gène reporter. Joignez ces deux fragments en utilisant l’extension de chevauchement PCR29.</li>
	<li>Concevoir l’apprêt inversé (5 '-3 ') pour inclure la queue poly (A) et environ 20 nucléotides, ajuster sur la base de Tm, correspondant à l’extrémité 3 'de l’ORF du gène reporter. Assurez-vous que la région correspondante dans l’amorce est identique au brin anti-sens (-brin) du gène et qu’un codon d’arrêt in-frame est présent avant la queue poly (A). Remarque: La longueur désirée de A dans un chef poly (A) ou une queue poly (A) peut être personnalisée dans les amorces. Par exemple, pour ajouter 50 A dans la queue poly (A), l’amorce inversée devrait comporter 50 T. De même, pour ajouter 20 A dans le leader poly (A), l’amorce avant devrait comporter 20 A.</li>
	<li>Pour le contrôle interne, concevoir un autre ensemble d’amorces contenant les éléments suivants dans la direction 5 'à 3 ': T7 promoter, une séquence de codage aléatoire de 5 '-UTR contenant la séquence de Kozak, la Renilla luciférase ORF et la queue poly (a) référée ci-après comme T7_ Kozak-Rluc.</li>
	<li>Dans un tube PCR, ajouter les réactifs dans l’ordre suivant: eau libre de DNase, 2x ADN polymérase haute fidélité, amorces, et ADN de modèle de luciférase confirmée par séquence (tableau 2). Remarque: Les quantités de composants individuels dans le mélange doivent être ajustées en fonction du volume de réaction.</li>
	<li>Utilisez un cycle de PCR standard en 3 étapes (dénaturation, recuit, extension) pour générer un modèle d’ADN comme illustré dans le tableau 3. Remarque: La température de recuit X ° c dépend du jeu d’amorces utilisé et le temps d’extension T min dépend de la taille de l’amplicon PCR et de l’ADN polymérase utilisée.</li>
	<li>Détectez le produit PCR en exécutant 5-10% de la réaction PCR dans l’électrophorèse sur gel de tris-acétate-EDTA (TAE) de 1% d’d’agarose (contenant 0,1 μg/ml de bromure d’éthidium) ainsi que la norme de poids moléculaire disponible dans le commerce. Visualisez le gel sous un illuminateur UV pour déterminer la taille du produit PCR.</li>
	<li>Après avoir déterminé la taille correcte du produit PCR, ~ 1,7 KB pour T7_12A-Fluc et ~ 1,0 KB pour T7_Kozak-Rluc, le purifier en utilisant un kit de purification de PCR disponible dans le commerce. Éluer l’ADN à l’aide de 100 μL d’eau libre de nucléase (figure 2b).</li>
	<li>Une fois purifiés, vérifier la concentration de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre et déterminer le rapport A260/A280 (~ 1,8-2,0 est acceptable).</li>
	<li>Conserver l’ADN purifié à-20 ° c ou l’utiliser immédiatement pour la transcription in vitro.</li>
</ol>2. générer l’ARNm par transcription in vitro
<ol><li>
Synthétiser l’ARN du produit PCR in vitro, en utilisant un kit de transcription in vitro (figure 3A). Remarque: les modèles d’ADN T7_12A-Fluc et T7_Kozak-rluc sont utilisés pour synthétiser les mRNA 12a-Fluc et Kozak-rluc, respectivement.<ol>
<li>Pour ce faire, prendre un tube de microcentrifugation et ajouter les réactifs dans l’ordre suivant: DNase-RNase eau libre, NTP buffer Mix, Cap ANALOG, modèle PCR Product, T7-RNA polymérase Mix (tableau 4). Remarque: D’autres systèmes de capsulage peuvent également être utilisés pour plafonner l’ARN séquentiellement après une transcription in vitro suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Mélanger soigneusement et incuber à 37 ° c pendant 2 h.</li>
		<li>Procéder à la purification de l’ARN synthétisé à l’aide d’un kit de purification d’ARN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exécutez l’ARN purifié dans 1,5% de gel d’d’agarose tris-borate-EDTA (TBE) (contenant 0,5 μg/mL de bromure d’éthidium) pour vérifier l’ARN. Visualisez le gel sous un illuminateur UV (figure 3b).</li>
	<li>Vérifier la concentration de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre et déterminer le rapport A260/A280 (~ 1,8-2,0 est acceptable).</li>
	<li>Aliquot l’ARN purifié et stocker à-80 ° c.</li>
</ol>3. transfect mRNA aux cellules
<ol><li>Cellules HeLa de graine dans une plaque de 24 puits (à environ ~ 80-90% anastomosé le lendemain) et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 ° c avec 5% co2.</li>
	<li>Infecter les cellules HeLa avec le virus de la vaccine (vacv) à une multiplicité d’infection (moi) de 5 ou garder les cellules HeLa non infectées pour comparaison. Remarque: MOI est le nombre de particules virales infectieuses par cellule.</li>
	<li>MOI de X = {[(nombre de cellules * X)/titer de virus] * 1000} μl de virus par milieu de 1 mL.</li>
	<li>
Après l’infection post-h souhaitée (HPI) (dans cette expérience à 10-12 HPI), transfecter de l’ARNm (500 ng de l’ARNm total par puits de plaques de 24 puits) en utilisant un réactif de transfection lipidique cationique comme illustré à la figure 3C.
	<ol>
<li>Pour un puits d’une plaque de 24 puits, mélanger 480 ng de l’ARNm de la séquence 12a portant la luciférase (12a-Fluc) et 20 ng de la séquence de Kozak portant Renilla luciférase (Kozak-rluc) mRNA dans un tube de microcentrifugation. Dans un autre tube de microcentrifugation, ajouter 1,1 μL de réactif de transfection lipidique cationique.</li>
		<li>Ajouter 55 μL de milieu sérique réduit dans les deux tubes. Mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Après 5 min d’incubation, ajouter 55 μL de réactif de transfection lipidique cationique contenant un milieu sérique réduit dans le tube contenant de l’ARNm.</li>
		<li>Mélanger doucement mais soigneusement, et incuber à température ambiante pendant 15 min.</li>
		<li>Pendant l’incubation, retirer le milieu de culture cellulaire et ajouter 400 μL de milieu sérique réduit par puits de plaques de 24 puits.</li>
		<li>Après incubation, ajouter 100 μL du mélange à l’abandon et uniformément à un puits de plaques de 24 puits.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mesurez les activités de luciférase
<ol><li>Cinq heures après la co-transfection de l’ARNm 12A-Fluc et Kozak-Rluc, mesurer l’activité de la luciférase à l’aide d’un système de dosage de la luciférase capable d’effectuer deux essais de reporter (p. ex., trousse de dosage du double luciférase reporter).</li>
	<li>Retirer le milieu sérique réduit et lyser les cellules en ajoutant 150 μL de tampon de lyse, un composant du kit de dosage de la luciférase.</li>
	<li>Après 10 min d’incubation à la température ambiante, prélever le lysat en déchirant les cellules et en les transvaser dans un tube à microcentrifugation.</li>
	<li>Centrifuger le lysat à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° c pour les débris de cellules de pellets.</li>
	<li>Ajouter 30 μL de surnageant dans une plaque d’essai à paroi opaque 96 bien blanche avec un fond solide.</li>
	<li>Mesurez la double luminescence à l’aide du kit de dosage de la luciférase et d’un luminomètre multimode pour lecteur de plaques.</li>
	<li>Effectuer la mesure en utilisant la fonction cinétique (sur une base par puits) en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 5. Remarque: La lecture peut également être prise à l’aide d’un luminomètre manuel. Ajouter un volume égal de lysat et de substrat pour Fluc dans une cuvette. Attendre 2 s et mesurer pendant 10 s à l’aide du luminomètre. Après la mesure Fluc, sortez rapidement la cuvette du luminomètre et ajoutez un volume égal du substrat pour Rluc manuellement. Encore une fois, attendre 2 s et mesurer pendant 10 s à l’aide du luminomètre.</li>
	<li>Exportez les données de lecture de luminescence dans un format de fichier souhaitable.</li>
	<li>Déterminer le taux de traduction relatif de l’ARNm 12A-Fluc dans les cellules HeLa infectées non infectées et VACV en divisant la valeur de Fluc par le contrôle interne Rluc valeur. Remarque: La figure 1 supplémentaire montre l’analyse étape par étape des données brutes pour obtenir une activité Fluc relative.</li>
</ol>

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<li>Dominissini, D., Rechavi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N4-acetylation+of+Cytidine+in+mRNA+by+NAT10+Regulates+Stability+and+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">N4-acetylation of Cytidine in mRNA by NAT10 Regulates Stability and Translation.</a> Cell. 175, 1725-1727 (2018).</li>
<li>Wei, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+m6A%2C+m6Am%2C+and+m1A+Demethylation+Mediated+by+FTO+in+the+Cell+Nucleus+and+Cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm.</a> Molecular Cell. 71, 973-985 (2018).</li>
<li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m6A+RNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation.</a> Nature Reviews Genetics. 15, 293-306 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs aimeraient ne déclarer aucun intérêt financier concurrent.

Toutes les étapes à quatre cœurs sont cruciales pour le succès de l’essai in vitro transcrit de la luciférase à base d’ARN. Une attention particulière doit être accordée à la conception des amorces, en particulier pour la séquence de promoteur T7. T7 RNA polymérase commence la transcription à partir du premier G souligné (gGG-5 '-UTR-Aug-) dans le promoteur T7 ajouté avant la séquence 5 '-UTR. Bien que le site de début de transcription (TSS) commence à partir du premier G à l’extrémité 5 ', la diminution du nombre...

Selon le dogme central, l’information génétique circule de l’ADN à l’ARN, puis finalement vers la protéine1,2. Ce flux d’information génétique est très réglementé à de nombreux niveaux, y compris la traduction de mRNA3,4. La mise au point de tests rapporteurs pour mesurer la régulation de l’expression génique facilitera la compréhension des mécanismes de réglementation impliqués dans ce processus. Nous décrivons ici un protocole pour étudier la traduction de l’ARNm à l’aide d’un test de transcription in vitro de la luciférase basée sur l’ARN dans les cellules infectées par le poxvirus.
Les poxvirus comprennent de nombreux agents pathogènes humains et animaux très dangereux5. Comme tous les autres virus, les poxvirus dépendent exclusivement des cellules hôtes pour la synthèse protéique6,7,8. Pour synthétiser efficacement les protéines virales, les virus ont évolué de nombreuses stratégies pour détourner les machines cellulaires translationnelles pour les rediriger vers la traduction des mRNAs viraux7,8. Un mécanisme couramment utilisé par les virus est d’utiliser des éléments d’action CISdans leurs transcriptions. Parmi les exemples notables, citons le site interne d’entrée de ribosome (IRES) et l’activateur de traduction indépendant du Cap (cite)9,10,11. Ces éléments CISrendent les transcriptions virales un avantage translationnel en attirant des machines translationnelles par divers mécanismes12,13,14. Plus de 100 mRNA de poxvirus ont un élément d’action CISévolutivement conservé dans la région 5 '-non traduite (5 '-UTR): un dirigeant de 5 '-poly (a) aux cinq extrémités de ces mRNAs15,16. Les longueurs de ces 5 '-poly (A) leaders sont hétérogènes et sont générées par le glissement de l’ARN polymérase encodée par le poxvirus pendant la transcription17,18. Nous, et d’autres, avons récemment découvert que le 5 '-poly (A) leader confère un avantage de traduction à un mRNA dans les cellules infectées par le virus de la vaccine (vacv), le membre prototypique des poxvirus19,20.
Le test de transcription de luciférase à base d’ARN transcrit in vitro a été initialement développé pour comprendre le rôle du 5 '-poly (A) leader dans la traduction d’ARNm au cours de l’infection par le poxvirus19,21. Bien que les tests de journaliste de luciférase basés sur l’ADN de plasmide aient été largement utilisés, il y a plusieurs inconvénients qui compliqueront l’interprétation des résultats dans les cellules infectées par le poxvirus. Premièrement, les plasmides sont capables de se reproduire dans les cellules infectées par le VACV22. Deuxièmement, la transcription cryptique se produit souvent à partir de l’ADN plasmide18,23,24. Troisièmement, la transcription pilotée par le promoteur VACV génère des poly (A)-leader de longueurs hétérogènes rendant ainsi difficile le contrôle de la longueur de leader poly (A) dans certaines expériences18. Un essai in vitro de transcription de luciférase basé sur l’ARN contourne ces questions et l’interprétation des données est simple.
Il y a quatre étapes clés dans cette méthode: (1) la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour générer le modèle d’ADN pour la transcription in vitro; (2) transcription in vitro pour générer de l’ARNm; (3) transfection pour délivrer l’ARNm dans les cellules; et (4) la détection de l’activité de la luciférase comme indicateur de la traduction (figure 1). L’amplicon PCR qui en résulte contient les éléments suivants dans la direction 5 'à 3 ': T7-promoteur, leader poly (A) ou séquence 5 '-UTR souhaitée, cadre de lecture ouvert luciférase Firefly (ORF) suivi d’une queue poly (A). L’amplicon PCR est utilisé comme modèle pour synthétiser l’ARNm par transcription in vitro à l’aide de la T7 polymérase. Pendant la transcription in vitro, m7G Cap ou autre analogue de Cap est incorporé dans l’ARNm nouvellement synthétisé. Les transcriptions plafonnées sont transfectées en cellules infectées ou non infectées par le VACV. Le lysat cellulaire est recueilli au moment désiré après la transfection pour mesurer les activités de luciférase qui indiquent la production de protéines à partir de l’ARNm transfecté. Ce test reporter peut être utilisé pour étudier la régulation de la traduction par élément CISprésent dans 5 '-UTR, 3 '-UTR ou d’autres régions d’un ARNm. En outre, l’analyse in vitro transcrite à base d’ARN peut être utilisée pour étudier différents mécanismes d’initiation de la traduction, y compris l’initiation au Cap, l’initiation indépendante du capuchon, la réinitiation et l’initiation interne comme IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td><td>ADN polymérase haute fidélité utilisée en PCR</td></tr><tr><td>3&acute ;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G Structure du capuchon d’ARN analogique</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Capuchon anti-retour analogique ou ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 Well Half-Area blanc à fond plat microplaque en polystyrène</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Opaque à paroi opaque 96 well white plate plate avec fond solide</td></tr><tr><td>Système de dosage Dual-Luciferase Reporter</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Kit de dosage Dual-Luciferase (DLAK)</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure Kit</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td><td>Kit de purification PCR</td></tr><tr><td>GloMax Navigator Luminomètre sur microplaques</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Luminomètre à lecteur de plaques multimode</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit de synthèse d’ARN rapide à haut rendement</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Kit de transcription vitro</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Réactif de transfection lipidique cationique</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Utilisé pour mesurer la concentration d’ADN et d’ARN</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Milieu sérique réduit</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Kit de purification de l’ARN</td></tr><tr><td>Système de coiffage</td><td>de la vaccine New England Biolabs</td><td>M2080</td><td>Système de coiffage</td></tr></tbody></table>

in vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’arn pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Chaque mRNA poxvirus transcrit après la réplication de l’ADN viral a un leader évolutif, non-basé sur le modèle 5 '-poly (A) dans le 5 '-UTR. Pour disséquer le rôle du 5 '-poly (A) chef de file dans la traduction d’ARNm pendant l’infection de poxvirus nous avons développé un essai in vitro transcrit de journaliste de luciférase basé sur l’ARN. Ce test de reporter comprend quatre étapes principales: (1) PCR pour amplifier le gabarit d’ADN pour la transcription in vitro; (2) transcription in vitro pour générer de l’ARNm à l’aide de l’ARN polymérase T7; (3) transfection pour introduire dans les cellules une ARNm transcrite in vitro; (4) détection de l’activité de la luciférase comme indicateur de la traduction. Le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN décrit ici contourne les problèmes de réplication plasmidique dans les cellules infectées par le poxvirus et la transcription cryptique du plasmide. Ce protocole peut être utilisé pour déterminer la régulation de la traduction par des éléments CISdans un mRNA comprenant 5 '-UTR et 3 '-UTR dans des systèmes autres que les cellules infectées par le poxvirus. De plus, il est possible d’étudier différents modes d’initiation de la traduction, tels que le Cap-dépendant, le Cap-indépendant, la réinitiation et l’initiation interne à l’aide de cette méthode.

Les quatre étapes de l’analyse in vitro de la luciférase à base d’ARN transcrit: PCR pour générer un modèle d’ADN pour la transcription in vitro, la transcription in vitro pour générer l’ARNm, la transfection de l’ARNm et la mesure de la luciférase, peuvent être observées dans le diagramme schématique ( Figure 1). La conception des amorces pour les deux modèles d’ADN (Fluc et Rluc) et le schéma général de l’extension de surplomb PCR est illustrée dans le sché...

Nous présentons un protocole pour étudier la régulation de la traduction des mRNA dans les cellules infectées par le poxvirus à l’aide du test de reporter de luciférase basé sur l’ARN transcrit in vitro. Le dosage peut être utilisé pour étudier la régulation de la traduction par les éléments CISd’un mRNA, y compris la région 5 '-non traduite (UTR) et 3 '-UTR. Différents modes d’initiation de traduction peuvent également être examinés à l’aide de cette méthode.

In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Notre protocole pour un essai in vitro transcrit à base d’ARN luciferase aide à étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le virus de la varicelle. En outre, une longueur personnalisée du Poly(A)litre permet d’étudier ses effets réglementaires sur la traduction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de la régulation de la traduction par des éléments cis tels que 5'UTR et 3'UTR en ARNm et un large spectre d’initiation à la traduction.L’analyse de journaliste luciferase transcrite in vitro à base d’ARN peut être adaptée pour intégrer la modification au capuchon et à d’autres modifications et utilisée pour tester l’effet sur la traduction. Pour commencer, concevez des amorces avant et arrière pour générer un amplicon PCR contenant les éléments suivants en 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)litre, Firefly Luciferase ORF dans une queue Poly(A)appelée T7_12A-Fluc, comprennent plusieurs nucléotides supplémentaires dans l’amorce avant suivie par T7-Promoteur Poly (A)litre ou désiré 5'UTR séquence et environ 20 nucléotides correspondant à la 5'end de l’ORF du gène reporter. Ajustez la longueur de l’amorce en fonction de la température de fusion correspondant à la 5'end de l’ORF du gène reporter en s’assurant que la région correspondante dans l’amorce est identique au brin de sens du gène.Ensuite, concevoir l’amorce inverse pour inclure poly (A)queue et environ 20 nucléotides. Ajuster en fonction de la température de fusion correspondant à l’extrémité 3 de l’ORF du gène reporter en s’assurant que la région correspondante de l’amorce est identique au brin antisens du gène et qu’un codon d’arrêt dans le cadre est présent avant la queue Poly(A).. Pour le contrôle interne, concevoir un autre ensemble d’amorces contenant les éléments suivants en 5'to 3'direction:T7-Promoter, une séquence de codage aléatoire de 5'UTR contenant la séquence Kozak, Renilla Luciferase ORF, et Poly(A)tail, appelé T7_Kozak-Rluc.Pour configurer la réaction, ajoutez des réamorts dans l’ordre suivant à un tube PCR : eau libre DNase, polymésase d’ADN haute fidélité 2X, amorce et adn confirmé de modèle de luciferase de séquence. Après un cycle PCR standard en trois étapes pour générer un modèle d’ADN, détecter le produit PCR en exécutant 5-10% de la réaction PCR dans un électrophoresis gel TAE 1%agarose avec une norme de poids moléculaire. Pour déterminer la taille du produit PCR, visualisez le gel sous un illuminateur UV.Après avoir déterminé la taille correcte du produit PCR, purifiez-le à l’aide d’un kit de purification PCR disponible dans le commerce à l’aide de 100 microlitres d’eau libre de nucléase pour élucider l’ADN. Vérifiez la concentration de l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre et rangez-le à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation immédiate pour la transcription in vitro. Pour synthétiser l’ARN du produit PCR, ajoutez les réapprovisionnements suivants à un tube de microcentrifugeuse : eau libre DNase-RNase, mélange tampon NTP, modèle de produit PCR, modèle de produit PCR et mélange polymétrie T7-ARN à partir du kit de transcription in vitro.Mélanger. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis procéder à la purification de l’ARN synthétisé à l’aide d’un kit de purification de l’ARN. Pour vérifier l’ARN purifié, chauffer l’ARN à 70 degrés pendant cinq minutes pour enlever la structure secondaire et l’exécuter sur 1,5 gel TBE agarose.Visualisez ensuite le gel sous un illuminateur UV. Vérifiez la concentration de l’ARN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre. Aliquot il et stocker à moins 80 degrés Celsius.Graines HeLa cellules dans une plaque de puits 24 pour atteindre 80-90%confluency le lendemain et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Infecter les cellules HeLa avec le virus Vaccinia à une multiplicité d’infection de cinq et garder les cellules HeLa non infectées à des fins de comparaison. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 10 à 12 heures.Après les heures désirées après l’infection, mélanger 480 nanogrammes de séquence 12A portant l’ARNm Firefly Luciferase et 20 nanogrammes de séquence kozak portant l’ARNm Renilla Luciferase dans un tube de microcentrifugeuse. Dans un autre tube de microcentrifugeuse, ajouter 1,1 microlitres de réaccfection cationique de transfection lipidique. Ajouter 55 microlitres de sérum réduit dans les deux tubes, mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.Ajouter ensuite 55 microlitres cationic lipidique réfection réavantage contenant des supports sériques réduits à l’ARNm contenant tube. Mélanger délicatement mais soigneusement avec une pipette et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, retirer le milieu de culture cellulaire des cellules et ajouter 400 microlitres de sérum moyen réduit par puits.Lorsque l’incubation est terminée, ajouter 100 microlitres du mélange goutte sage et uniformément par puits de la plaque de 24 puits. Cinq heures après la co-transfection avec 12A Fluc et Kozak Rluc mRNA, enlever le milieu de sérum réduit des cellules et lyse les cellules en ajoutant 150 microlitres tampon 1X lysis de la trousse d’analyse Luciferase capable d’effectuer deux analyses reporter. Après avoir couvé pendant 10 minutes à température ambiante, racler les cellules à l’aide de caoutchouc et de seringue stérile et transférer dans un tube de microcentrifugeuse.Pour pelleter les débris cellulaires, centrifugez le lysate à 12 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer 30 microlitres de supernatant par puits d’une plaque d’essai opaque murée 96 et blanche avec un fond solide. Utilisez le kit d’analyse Luciferase et un luminomètre lecteur de plaques multi-mode pour mesurer la double luminescence à l’aide de la fonction cinétique décrite dans le manuscrit.Après avoir exporté les données de lecture de luminescence dans un format de fichier souhaitable, déterminez le taux de traduction relatif de 12A ArNm Fluc dans les cellules HeLA non infectées et infectées par le VACV en divisant la valeur Fluc par la valeur rluc de contrôle interne. Cet essai a été utilisé pour tester l’efficacité de traduction d’un ARNm Fluc qui contient un 5'Poly(A)litre dans les cellules infectées non infectées et VACV. Les cellules non infectées et les cellules infectées par le VACV ont été co-transfectées avec l’ARNm fluc et rluc.La division du Fluc par Rluc a normalisé l’efficacité de la transfection dans la stabilité de l’ARN dans les cellules. 5'Poly(A)litre contenant de l’ARNm a un avantage translationnel pendant l’infection par le VACV par rapport aux cellules non infectées. Ceci n’était pas dû à l’efficacité différentielle de transfection ou à la stabilité d’ARNm car le niveau d’ARN était semblable dans les cellules infectées non infectées et VACV cinq heures après transfection d’ARNm.Prenez un soin particulier lors de la conception des amorces car cela peut affecter non seulement l’efficacité de la réaction PCR, mais aussi tous les processus en aval nécessitant l’ADN amplifié. Cette méthode est un test important pour tester rapidement le règlement de traduction par les éléments Cis. Si possible, cette méthode doit être corroborée par d’autres expériences complémentaires.Il faut prendre des précautions lors de l’utilisation du virus Vaccinia et éviter l’exposition à des produits chimiques tels que le bromure d’éthidium et le phénol.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette méthode décrit un rendement élevé in vitro synthèse d'ARNm capés et non capés à partir d'un plasmide linéarisé contenant le Gaussia gène de la luciférase (GLuc). L'ARN est purifié et une fraction de l'ARN non capée est capée enzymatiquement à l'aide du Vaccinia enzyme de coiffage viral. Dans la dernière étape, l'ARNm est transfecté dans des cellules HeLa et les surnageants de culture cellulaire sont analysés pour l'activité de la luciférase.

Transcription in vitro et plafonnement de l&#39;ARNm de luciférase Gaussia Suivie par la transfection de cellules HeLa

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Cette vidéo présente une méthode de suivi des infections virales dans des modèles murins à l’aide d’un virus de la grippe A bi-rapporteur exprimant la luciférase recombinante et la protéine de fluorescence. Cette méthode permet des études in vivo et ex vivo, ce qui permet aux chercheurs de mieux comprendre la dynamique virale et les effets des interventions.

Un virus de la grippe rapporteur fluorescent à la luciférase pour suivre les infections virales

Cette vidéo présente un test permettant d’étudier la régulation de la traduction dans des cellules infectées par des poxvirus. Des cellules non infectées et infectées par le virus ont été co-transfectées avec des ARNm codant pour la luciférase de luciférase (Fluc) et la Renilla luciférase (Rluc), l'ARNm de Fluc contenant une séquence leader Poly(A) 5'. Lors de l’ajout de substrats bioluminescents sur des cellules lysées, mesurez le signal des deux luciférases pour identifier l’avantage...

Un test rapporteur de luciférase pour étudier la régulation de la traduction dans des cellules infectées par des poxvirus

Nous décrivons l'utilisation d'un virus de la vaccine rapporteur fluorescent qui permet la mesure en temps réel de l'infectivité virale et l'expression des gènes par le biais de l'expression spécifique au stade de fluorophores spectralement distincts rapporteurs. Nous détaillons une méthode basée plaque pour identifier avec précision l'étape à laquelle la réplication du virus est affecté en réponse à petite molécule inhibition.

Reporter vaccine virus pour quantifier la fonction virale à toutes les étapes de l&#39;expression des gènes

Ici, nous décrivons un test de gène rapporteur basé sur des cellules comme un outil précieux pour cribler les bibliothèques chimiques à la recherche de composés modulant les mécanismes de contrôle post-transcriptionnel exercés par 3' UTR.

Haut-débit criblage de modulateurs chimique des gènes post-transcriptionnelle réglementées

La transfection dans la lignée cellulaire des macrophages, RAW264.7, est difficile en raison de la réponse naturelle de la cellule contre les corps étrangers. Nous avons décrit ici une procédure douce mais robuste pour transfecter les gènes rapporteurs de la luciférase dans les cellules RAW264.7.

Transfecter des cellules RAW264.7 avec un gène rapporteur de la luciférase

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

Nous présentons ici les protocoles afin d’identifier les immunomodulateurs 1) virus codé qui favorisent la réplication arbovirus et facteurs de l’hôte 2) eucaryotes que restreignent la réplication des arbovirus. Ces méthodes à base de fluorescence et de luminescence aux chercheurs d’obtenir rapidement des afficheurs quantitatives de réplication arbovirus dans les essais simplistes avec des rapports signal sur bruit faibles.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

Pour identifier de nouveaux régulateurs des facteurs de transcription, nous avons développé une approche pour dépister les bibliothèques de RNAi lentiviral ou rétroviral à l’écran à l’aide d’un essai de reporter transcriptionnel à double base de luciferase. Cette approche offre un moyen rapide et relativement peu coûteux de filtrer des centaines de candidats dans une seule expérience.

Identification des régulateurs des facteurs de transcription à l’aide du dépistage à débit moyen des bibliothèques à débit moyen et d’un reporter à double luciferase

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

Découvrez un test de luciférase basé sur l'ARN in vitro pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus. Cette méthode permet d'analyser les effets des éléments cis de l'ARNm sur l'initiation de la traduction.

In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus (Vidéo) | JoVE Journal

In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus

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