In vitro transcrit le test de reporter de luciférase basé sur l’ARN pour étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le poxvirus

Notre protocole pour un essai in vitro transcrit à base d’ARN luciferase aide à étudier la régulation de la traduction dans les cellules infectées par le virus de la varicelle. En outre, une longueur personnalisée du Poly(A)litre permet d’étudier ses effets réglementaires sur la traduction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’étude de la régulation de la traduction par des éléments cis tels que 5'UTR et 3'UTR en ARNm et un large spectre d’initiation à la traduction.

L’analyse de journaliste luciferase transcrite in vitro à base d’ARN peut être adaptée pour intégrer la modification au capuchon et à d’autres modifications et utilisée pour tester l’effet sur la traduction. Pour commencer, concevez des amorces avant et arrière pour générer un amplicon PCR contenant les éléments suivants en 5'to 3'direction:T7-Promoter, Poly(A)litre, Firefly Luciferase ORF dans une queue Poly(A)appelée T7_12A-Fluc, comprennent plusieurs nucléotides supplémentaires dans l’amorce avant suivie par T7-Promoteur Poly (A)litre ou désiré 5'UTR séquence et environ 20 nucléotides correspondant à la 5'end de l’ORF du gène reporter. Ajustez la longueur de l’amorce en fonction de la température de fusion correspondant à la 5'end de l’ORF du gène reporter en s’assurant que la région correspondante dans l’amorce est identique au brin de sens du gène.

Ensuite, concevoir l’amorce inverse pour inclure poly (A)queue et environ 20 nucléotides. Ajuster en fonction de la température de fusion correspondant à l’extrémité 3 de l’ORF du gène reporter en s’assurant que la région correspondante de l’amorce est identique au brin antisens du gène et qu’un codon d’arrêt dans le cadre est présent avant la queue Poly(A).. Pour le contrôle interne, concevoir un autre ensemble d’amorces contenant les éléments suivants en 5'to 3'direction:T7-Promoter, une séquence de codage aléatoire de 5'UTR contenant la séquence Kozak, Renilla Luciferase ORF, et Poly(A)tail, appelé T7_Kozak-Rluc.

Pour configurer la réaction, ajoutez des réamorts dans l’ordre suivant à un tube PCR : eau libre DNase, polymésase d’ADN haute fidélité 2X, amorce et adn confirmé de modèle de luciferase de séquence. Après un cycle PCR standard en trois étapes pour générer un modèle d’ADN, détecter le produit PCR en exécutant 5-10% de la réaction PCR dans un électrophoresis gel TAE 1%agarose avec une norme de poids moléculaire. Pour déterminer la taille du produit PCR, visualisez le gel sous un illuminateur UV.

Après avoir déterminé la taille correcte du produit PCR, purifiez-le à l’aide d’un kit de purification PCR disponible dans le commerce à l’aide de 100 microlitres d’eau libre de nucléase pour élucider l’ADN. Vérifiez la concentration de l’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre et rangez-le à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation immédiate pour la transcription in vitro. Pour synthétiser l’ARN du produit PCR, ajoutez les réapprovisionnements suivants à un tube de microcentrifugeuse : eau libre DNase-RNase, mélange tampon NTP, modèle de produit PCR, modèle de produit PCR et mélange polymétrie T7-ARN à partir du kit de transcription in vitro.

Mélanger. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis procéder à la purification de l’ARN synthétisé à l’aide d’un kit de purification de l’ARN. Pour vérifier l’ARN purifié, chauffer l’ARN à 70 degrés pendant cinq minutes pour enlever la structure secondaire et l’exécuter sur 1,5 gel TBE agarose.

Visualisez ensuite le gel sous un illuminateur UV. Vérifiez la concentration de l’ARN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre. Aliquot il et stocker à moins 80 degrés Celsius.

Graines HeLa cellules dans une plaque de puits 24 pour atteindre 80-90%confluency le lendemain et incuber pendant la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Infecter les cellules HeLa avec le virus Vaccinia à une multiplicité d’infection de cinq et garder les cellules HeLa non infectées à des fins de comparaison. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 10 à 12 heures.

Après les heures désirées après l’infection, mélanger 480 nanogrammes de séquence 12A portant l’ARNm Firefly Luciferase et 20 nanogrammes de séquence kozak portant l’ARNm Renilla Luciferase dans un tube de microcentrifugeuse. Dans un autre tube de microcentrifugeuse, ajouter 1,1 microlitres de réaccfection cationique de transfection lipidique. Ajouter 55 microlitres de sérum réduit dans les deux tubes, mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Ajouter ensuite 55 microlitres cationic lipidique réfection réavantage contenant des supports sériques réduits à l’ARNm contenant tube. Mélanger délicatement mais soigneusement avec une pipette et incuber à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant l’incubation, retirer le milieu de culture cellulaire des cellules et ajouter 400 microlitres de sérum moyen réduit par puits.

Lorsque l’incubation est terminée, ajouter 100 microlitres du mélange goutte sage et uniformément par puits de la plaque de 24 puits. Cinq heures après la co-transfection avec 12A Fluc et Kozak Rluc mRNA, enlever le milieu de sérum réduit des cellules et lyse les cellules en ajoutant 150 microlitres tampon 1X lysis de la trousse d’analyse Luciferase capable d’effectuer deux analyses reporter. Après avoir couvé pendant 10 minutes à température ambiante, racler les cellules à l’aide de caoutchouc et de seringue stérile et transférer dans un tube de microcentrifugeuse.

Pour pelleter les débris cellulaires, centrifugez le lysate à 12 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer 30 microlitres de supernatant par puits d’une plaque d’essai opaque murée 96 et blanche avec un fond solide. Utilisez le kit d’analyse Luciferase et un luminomètre lecteur de plaques multi-mode pour mesurer la double luminescence à l’aide de la fonction cinétique décrite dans le manuscrit.

Après avoir exporté les données de lecture de luminescence dans un format de fichier souhaitable, déterminez le taux de traduction relatif de 12A ArNm Fluc dans les cellules HeLA non infectées et infectées par le VACV en divisant la valeur Fluc par la valeur rluc de contrôle interne. Cet essai a été utilisé pour tester l’efficacité de traduction d’un ARNm Fluc qui contient un 5'Poly(A)litre dans les cellules infectées non infectées et VACV. Les cellules non infectées et les cellules infectées par le VACV ont été co-transfectées avec l’ARNm fluc et rluc.

La division du Fluc par Rluc a normalisé l’efficacité de la transfection dans la stabilité de l’ARN dans les cellules. 5'Poly(A)litre contenant de l’ARNm a un avantage translationnel pendant l’infection par le VACV par rapport aux cellules non infectées. Ceci n’était pas dû à l’efficacité différentielle de transfection ou à la stabilité d’ARNm car le niveau d’ARN était semblable dans les cellules infectées non infectées et VACV cinq heures après transfection d’ARNm.

Prenez un soin particulier lors de la conception des amorces car cela peut affecter non seulement l’efficacité de la réaction PCR, mais aussi tous les processus en aval nécessitant l’ADN amplifié. Cette méthode est un test important pour tester rapidement le règlement de traduction par les éléments Cis. Si possible, cette méthode doit être corroborée par d’autres expériences complémentaires.

Il faut prendre des précautions lors de l’utilisation du virus Vaccinia et éviter l’exposition à des produits chimiques tels que le bromure d’éthidium et le phénol.