Name: Isolement et quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes dans une souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Découvrez l'isolement et la quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes chez la souris. Cette méthode permet d'étudier la pathogenèse virale et la réponse immunitaire pour développer vaccins et thérapeutiques.

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Le Dr Pinto est financé par une subvention de démarrage de la Saint Louis University School of Medicine et des fonds de démarrage de l'École de médecine de l'Université Saint Louis. Le Dr Brien est financé par un prix K22AI104794 de l'INAID des NIH ainsi qu'une subvention de démarrage de l'École universitaire de Saint Louis. Pour toutes les personnes financées, les bailleurs de fonds n'avaient aucun rôle à jouer dans la conception des études, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

<ol><li>Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%3A+New+Clinical+Syndromes+and+Its+Emergence+in+the+Western+Hemisphere%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere.</a> Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).</li>
<li>Simpson, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+Infection+in+Man%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Zika Virus Infection in Man.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).</li>
<li>Fagbami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+investigations+on+arbovirus+infections+at+Igbo-Ora%2C+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria.</a> Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).</li>
<li>McCrae, A. W., Kirya, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yellow+fever+and+Zika+virus+epizootics+and+enzootics+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).</li>
<li>Rodhain, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+infections+and+viral+haemorrhagic+fevers+in+Uganda%3A+a+serological+survey+in+Karamoja+district%2C+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).</li>
<li>Wikan, N., Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus%3A+history+of+a+newly+emerging+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Zika virus: history of a newly emerging arbovirus.</a> Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outbreaks+in+the+Americas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Weekly+Epidemiological+Record%22%5BJournal%5D)">Zika virus outbreaks in the Americas.</a> The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).</li>
<li>Brien, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunological+basis+of+age-related+vulnerability+to+viral+infection%22">Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection</a>. , Oregon Health & Science University. (2007).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus-specific+CD4+T+cells+exhibit+direct+antiviral+cytokine+secretion+and+cytotoxicity+and+are+sufficient+for+antiviral+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection.</a> Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).</li>
<li>Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+role+of+T+cell+defects+in+age-related+vulnerability+to+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-specific+neutralization+and+protection+by+antibodies+against+dengue+virus+type+3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3.</a> Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).</li>
<li>Shrestha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+therapeutic+antibodies+that+neutralize+homologous+and+heterologous+genotypes+of+dengue+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823(2010).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor-1+%28IRF-1%29+shapes+both+innate+and+CD8%28%2B%29+T+cell+immune+responses+against+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230(2011).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+temporal+role+of+type+I+interferon+signaling+in+CD8%2B+T+cell+maturation+during+acute+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).</li>
<li>Brien, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+by+immunoglobulin+dual-affinity+retargeting+antibodies+against+dengue+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus.</a> Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).</li>
<li>Messaoudi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chikungunya+virus+infection+results+in+higher+and+persistent+viral+replication+in+aged+rhesus+macaques+due+to+defects+in+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343(2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hydrogen+peroxide-inactivated+virus+vaccine+elicits+humoral+and+cellular+immunity+and+protects+against+lethal+West+Nile+virus+infection+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice.</a> Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).</li>
<li>Sukupolvi-Petty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+antibodies+against+dengue+virus+type+4+reveals+strain-dependent+epitope+exposure+that+impacts+neutralization+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection.</a> Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+New+Therapeutics+Using+a+More+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Antibody-Enhanced+Dengue+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection.</a> MBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Murine+IFIT1+Proteins+Do+Not+Restrict+Infection+of+Negative-Sense+RNA+Viruses+of+the+Orthomyxoviridae%2C+Bunyaviridae%2C+and+Filoviridae+Families%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families.</a> Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathog. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Pinto, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+IFN+signaling+by+myeloid+cells+leads+to+MAVS-dependent+virus-induced+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis.</a> PLoS Pathog. 10 (4), e1004086(2014).</li>
<li>Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation%2C+quantification%2C+detection%2C+and+storage+of+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus.</a> Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).</li>
<li>Hassert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+cells+mediate+protection+against+Zika+associated+severe+disease+in+a+mouse+model+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237(2018).</li>
<li>Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lectin+pathway+of+complement+activation+contributes+to+protection+from+West+Nile+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection.</a> Virology. 412 (1), 101-109 (2011).</li>
<li>Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+interferon+controls+West+Nile+virus+infection+and+pathogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice.</a> Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler

L'infection par le ZIKV peut causer une maladie neurologique, c'est pourquoi les modèles animaux actuels pour étudier la pathogénie, les réponses immunitaires et l'efficacité protectrice des vaccins et des antiviraux doivent se concentrer sur la lutte virale au sein du SNC. L'un des défis en se concentrant sur la maladie du SNC est qu'elle se fait souvent au détriment de l'étude de l'infection périphérique. Les méthodes d'isolement des organes proposées ici mettent l'accent sur la nécessité d'évaluer rapidement l'infecti...

Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus qui appartient à la famille des flaviviridae, qui comprend d'importants pathogènes humains neuro-invasifs tels que le virus Powassan (POWV), le virus de l'encéphalite japonaise (JEV) et le virus du Nil occidental (VNO)1. Suite à son isolement et à son identification, il y a eu des rapports périodiques d'infections humaines de ZIKV en Afrique et en Asie2,3,4,5, et des épidémies en Amérique centrale et du Sud (revue en référence6). Cependant, ce n'est que récemment que le ZIKV a été pensé pour causer la maladie grave7. Maintenant, il ya des milliers de cas de maladies neurologiques et des malformations congénitales liées à des infections ZIKV. L'émergence rapide de ZIKV a suscité de nombreuses questions concernant: pourquoi il ya une augmentation de la gravité de la maladie, quelle est la réponse immunologique à l'infection ZIKV et y at-il des pathologies virales et / ou immunitaires à médiation liée à l'augmentation des troubles neurologiques manifestations et malformations congénitales. Il y a maintenant une ruée pour comprendre la maladie liée au système nerveux central (SNC) associée au ZIKV ainsi que la nécessité de tester rapidement l'efficacité des antiviraux et des vaccins contre le ZIKV. C'est dans ce contexte que nous avons développé des méthodes pour l'analyse rapide des titers ZIKV dans la périphérie et le SNC à l'aide d'un focus spécifique à ZIKV formant des essais (FFA).
Les modèles de petits animaux sont importants pour comprendre la progression de la maladie et pour l'évaluation précoce des vaccins, des traitements et des antiviraux. Nous avons établi de petits modèles animaux pour l'étude de la maladie d'arbovirus en utilisant diverses souches de souris pour modéliser l'infection humaine et la protection contre les agents pathogènes viraux8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. En utilisant cette expérience antérieure, nous avons commencé à modifier les techniques utilisées pour l'évaluation du VNO et du virus de la dengue, un flavivirus connexe pour l'évaluation de la ture ZIKV dans les deux organes périphériques ainsi que le CNS21,23, 24. Les avantages de ces méthodes par rapport à d'autres essais sont les : 1) qu'elles combinent la capacité de récolter des organes périphériques et du SNC pour l'analyse; 2) les méthodes sont adaptables pour la cytométrie de flux, pour des mesures des réponses immunitaires innées et adaptatives, avec des titers viraux sur le même animal dans le même organe ; 3) la technique de récolte est adaptable pour l'analyse histologique ; 4) le FFA de ZIKV est une méthode rapide de haut débit pour l'analyse virale de titer ; et 5) ces méthodes peuvent être appliquées à l'évaluation des titreleurs viraux dans les organes des animaux infectés par la plupart des agents pathogènes25.

<table><tbody><tr><td>1-bromo-3-chloropropane (BCP)</td><td>MRC</td> gène <td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 10 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BD 309642</td><td></td></tr><tr><td>aiguille de 18 g</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-557-145</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 1 cc TB</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-16H</td><td></td></tr><tr><td>seringue de 20 cc</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-561-66</td><td></td></tr><tr><td>Moulin à billes 24 tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15 340 163</td><td></td></tr><tr><td>Perles en acier inoxydable de 3,2 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9084634</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg ; C Incubateur de culture tissulaire</td><td>Nuair</td><td>5800</td><td></td></tr><tr><td>4G2</td><td>anticorps en maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 plaques à fond plat</td><td>bien plat Midsci</td><td>TP92696</td><td></td></tr><tr><td>96 plaques à fond rond</td><td>bien rond Midsci</td><td>TP92697</td><td></td></tr><tr><td>Basix 1,5 mL tubes eppendorf</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr>Agrafes<td>d’eau de Javel germicide concentrée</td><td></td><td>30966CT</td><td></td></tr><tr><td>CTL S6 Analyseur</td><td>CTL</td><td>CTL S6 Analyseur</td><td></td>universel</tr><tr><td>Ciseaux de coupe incurvés</td><td>Outils de science fine</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aigle modifié' s Glycémie moyenne à élevée Avec 4 500 mg/L de glucose</td><td>MilliporeSigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (qualité biologie moléculaire)</td><td>MilliporeSigma</td><td>e7023</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>MilliporeSigma</td><td>F0926-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pince</td><td>Outils de science fine</td><td>11036-20</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>MilliporeSigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anticorps anti-souris marqué HRP</td><td>MilliporeSigma</td><td>8924</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>MilliporeSigma</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (biologie moléculaire)</td><td>MilliporeSigma</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail kétamine/xylazine</td><td>Médecine</td><td></td><td></td>comparative</tr><tr><td>L-glutamine</td><td>MilliporeSigma</td><td>g7513</td><td></td></tr><tr><td>Magmax RNA kit de purification</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1830</td><td></td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>MilliporeSigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Ependorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>MiniCollect 0,5 mL Tubes EDTA</td><td>Bio-one</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à joint torique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-403-195</td><td></td></tr><tr><td>One step q RT-PCR</td><td>mix Thermo Fisher Scientific</td><td>4392938</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EMS- 15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Tamponné Saline</td><td>Saline MilliporeSigma</td><td>d8537-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes multicanaux Proline</td><td>Sartorius</td><td>72230/72240</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes monocanaux Proline</td><td>Sartorius</td><td>728230</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans RNAse Thermo</td><td> Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol BD</td><td>MRC gène</td><td>RB192</td><td></td></tr><tr><td>Plate-forme à bascule</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11-676-333</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher</td><td>MT10040CV</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>MilliporeSigma</td><td>s7900</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère/spatule</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>10090-17</td><td></td></tr><tr><td>Droit ciseaux coupants</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MilliporeSigma</td><td>t8787</td><td></td></tr><tr><td>True Blue Substrat</td><td>VWR</td><td>95059-168</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>MilliporeSigma</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement et quantification du virus zika à partir de plusieurs organes dans une souris

Isolation and Quantification of Zika Virus from Multiple Organs in a Mouse

Les méthodes présentées démontrent les procédures de laboratoire pour l'isolement des organes des animaux infectés par le virus Zika et la quantification de la charge virale. Le but de la procédure est de quantifier les titreleurs viraux dans les zones périphériques et du SNC de la souris à différents moments après l'infection ou dans des conditions expérimentales différentes afin d'identifier les facteurs virologiques et immunologiques qui régulent l'infection par le virus Zika. Les procédures d'isolement d'organe démontrées permettent à la fois la formation de mise au point quantification et l'évaluation quantitative de PCR des titers viraux. Les techniques d'isolation rapide des organes sont conçues pour la préservation du téter antivirus. La quantification virale des titers par la mise au point de formation d'analyse permet l'évaluation rapide du débit du virus Zika. L'avantage de l'analyse de formation de mise au point est l'évaluation du virus infectieux, la limitation de cet analyse est le potentiel de toxicité des organes réduisant la limite de détection. L'évaluation virale de la térade est combinée avec le PCR quantitatif, et l'utilisation d'un numéro de copie virale recombinante de copie de copie de copie d'ARN dans l'organe est évaluée avec la limite basse de la détection. Dans l'ensemble, ces techniques fournissent une méthode de débit rapide précise pour l'analyse des titers viraux Zika dans la périphérie et le SNC des animaux infectés par le virus Zika et peuvent être appliquées à l'évaluation des titreleurs viraux dans les organes des animaux infectés par la plupart des pathogènes pathogènes, y compris le virus de la dengue.

Évaluer les titers ZIKV à l'aide du protocole décrit ci-dessus Ifnar1-/- les souris ont été infectées par ZIKV (PRVABC59) par injection sous-cutanée (SC) sur le pied. Ici, l'administration de 1 x 105 FFU de ZIKV à 8-12 semaines Ifnar1-/- souris SC n'est pas mortelle, mais le virus peut se répliquer à la fois dans la périphérie et le SNC. Cette dose et cette voie sont utilisées pour étudier les réponses immunitaires et la pathogénicité de...

L'objectif du protocole est de démontrer les techniques utilisées pour étudier les maladies virales en isolant et en quantifiant le virus Zika, à partir de plusieurs organes d'une souris après l'infection.

Isolement et quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes dans une souris

The methods being presented demonstrate laboratory procedures for the isolation of organs from Zika virus infected animals and the quantification of viral ...

Dans cette vidéo, nous décrivons un ensemble de procédures conçues pour interroger l’impact d’une infection virale et la réponse immunologique qui en résulte à l’aide d’un modèle murin d’infection à Zika. Ce protocole est important parce qu’il nous permet de développer une compréhension mécaniste de l’infection et de l’immunité en identifiant la mesure dans laquelle un virus s’est propagé dans tout le corps, en transversant les barrières physiques et en accédant aux tissus. Ces techniques permettent une compréhension détaillée de la pathogénie virale et permettent de disséquer le mécanisme de protection fourni par les vaccins ou les thérapeutiques.Ici, nous démontrons cette méthode en utilisant l’infection par le virus Zika des souris, mais cette méthode peut être appliquée à une gamme d’infections virales, y compris d’autres flavivirus comme le virus de la dengue et les alphavirus comme le virus Chikungunya. La récolte des organes du système nerveux central peut être difficile, il est donc important pour une personne de planifier une petite expérience, et être prêt à pratiquer les techniques à l’avance. Ce protocole permet la dissection rapide de la propagation virale dans les petits modèles animaux avec la possibilité de visualiser, capturer et stocker des données expérimentales.Il est important de démontrer visuellement cette méthode pour permettre à l’expérimentateur de comprendre comment récolter les organes du système nerveux central. Il est également important de voir le niveau de confluence cellulaire et l’intensité des foyers viraux. Pour commencer, utilisez des forceps pour enlever la peau de la souris infectée.Décapiter la tête de la souris avec des ciseaux, suivie de l’enlèvement des bras et des jambes. Pour récolter le cerveau, utilisez des ciseaux La Grange dentelés pour couper le crâne à travers le magnum foramen. Peler le crâne avec des forceps, et ramasser le cerveau avec une spatule.À l’aide de solides ciseaux émoussés, enlever l’os entourant la colonne vertébrale, puis couper à travers l’os pelvien pour exposer les contremaures vertébrales au niveau lombaire. Ensuite, retirez autant de muscle que possible autour de la colonne vertébrale. Soigneusement, placez la pointe biseauté de l’aiguille à l’intérieur du contre-homme vertébral, en évitant la pression excessive pour empêcher l’aiguille d’empiéter sur le corps vertébral.Maintenez fortement pour exercer une pression sur le corps vertébral et l’aiguille, et appuyez sur le piston de seringue pour expulser le cordon dans la boîte de Pétri. Transférer immédiatement la moelle épinière dans le tube étiqueté et le placer dans le bain de glace sèche pour une homogénéisation plus complète. Pour l’homogénéisation, ajouter un millilitre de DMEM et homogénéiser l’échantillon dans un BeadBeater.Après s’être assuré que les organes sont homogénéisés, des échantillons de centrifugeuses et d’aliquot sur la glace et conserver dans les moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire. Le jour de l’analyse, retirez les échantillons homogénéisés du congélateur de moins 80 degrés Celsius et laissez-les décongeler. Avec les échantillons sur la glace, diluer le virus Zika décuplé dans le premier puits de la plaque de dilution et utiliser une pipette multicanal pour faire des dilutions en série décuplées dans la plaque, en changeant les conseils à chaque fois.En ajoutant 20 microlitres d’échantillon dans 180 microlitres de supports de croissance, changez les pointes de pipette entre chaque dilution. Préparer la plaque de formation de mise au point en enlevant le média des virocellules préparées à fond plat de 96 puits couvrant les virocellules. Pour éviter que le monocouche ne se dessèche, ajoutez immédiatement 100 microlitres de dilution du virus à chaque puits du viroplate.Utilisez le même ensemble de conseils à ajouter de la concentration la plus basse à la plus élevée. Plaque de roche côte à côte deux à quatre fois et incuber à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une à deux heures. Réchauffer 2% de méthylcellulose à température ambiante.Ensuite, diluer la solution de méthylcellulose de 2% dans les médias de croissance à un ratio d’environ deux pour un. Après l’incubation, ajouter 125 microlitres du média de croissance de la méthylcellulose à chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber à nouveau à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant 32 à 40 heures.Pour fixer les virocellules, dans une armoire de biosécurité ajouter 50 microlitres de 5%paraformaldéhyde sur le dessus de la couche de méthylcellulose dans chaque puits des plaques de 96 puits. Incuber pendant 60 minutes à température ambiante. Vous pouvez également couvrir les plaques de parafilm et les placer à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Après cela, utilisez une pipette pour enlever la superposition et les médias des cellules dans un récipient jetable à l’intérieur de l’armoire de biosécurité. Laver délicatement avec 150 microlitres de PBS par puits. Retirez le PBS des plaques et retirez la plaque de l’armoire de biosécurité.Répétez le lavage PBS deux fois, puis ajoutez 150 microlitres par puits une fois tampon de lavage FFA et laisser à température ambiante pendant cinq à 10 minutes pour perméabiliser les cellules fixes. Ensuite, utilisez l’anticorps zika primaire pour détecter l’infection. Préparer l’anticorps primaire 4G2 à une concentration d’un microgramme par millilitre dans le tampon de coloration FFA.Feuilletez le tampon de lavage FFA des plaques et ajoutez 50 microlitres de l’anticorps primaire dans le tampon de coloration FFA à chaque puits. Ensuite, sceller les plaques avec parafilm, ou film plastique, et incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Préparez l’anticorps anti-souris secondaire HRP étiqueté à une concentration de un à 5000 dans le tampon de coloration FFA.Après avoir enlevé la solution d’anticorps, laver les cellules trois fois avec 150 microlitres FFA tampon de lavage par puits. Retirez le tampon de lavage en feuilletant dans l’évier à chaque fois. Tacher les cellules avec l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration FFA à 50 microlitres par puits et incuber une à deux heures à température ambiante.Après cela, laver les cellules trois fois avec tampon de lavage FFA, encore une fois, en enlevant le tampon de lavage en feuilletant dans l’évier à chaque fois. Ajouter 50 microlitres du substrat TrueBlue dans chaque puits. Attendez deux à 15 minutes jusqu’à ce que les taches soient entièrement définies avec un arrière-plan minimal.Une fois les taches visibles, lavez doucement avec de l’eau à l’aide d’une main pour protéger le monocouche de la force de l’eau courante. Appuyez sur sec sur du papier absorbant. Peu de temps après, utilisez une portée de dissécation pour compter manuellement les taches dans chaque puits, ou utilisez un compteur au comptant automatisé.Dans le logiciel ImmunoCapture, sélectionnez une dilution avec des foyers facilement distingués entre 20 et 200 par puits pour chaque échantillon et calculez le litre en unités de mise au point par millimètre en utilisant la moyenne des puits en double. Dans cette expérience, la charge virale a été montrée dans les tissus périphériques et centraux du système nerveux après que les souris Ifnar ont reçu le virus Zika sous-cutanée. La limite de détection se situe entre 100 et 500 FFU par gramme, selon l’organe.Lors de l’exécution de l’analyse de mise au point, les erreurs techniques peuvent entraîner des résultats sous-optimaux. La toxicité d’organe, entraînée par la concentration élevée du foie, a changé la sensibilité de l’essai. Lorsque le litre viral dans l’organe était inférieur à la toxicité, la FFA ne pouvait pas enregistrer avec précision les titres viraux.Les cellules rénales ont illustré la toxicité avec la concentration élevée d’organe mais ont été surmontées par le titer viral à de faibles concentrations d’organe. Le pipetage ou le lavage vigoureux peuvent enlever le monocouche, menant à la perte de données rapports inexacts des résultats de titer. Les fibres ou les poils qui sont présents dans le papier absorbant de banc de laboratoire, peuvent contaminer des puits individuels et causer des erreurs significatives si l’utilisation d’un programme automatisé de comptage.La densité cellulaire est un autre problème, qui peut avoir un impact considérable sur le succès d’un essai de mise au point. Les cellules à environ 60% de confluence au début de l’essai, comparées aux cellules plaquées à 90% confluency, ont montré la différence dramatique impactant l’essai de mise au point-formation. La planification de la taille et de la portée de l’expérience afin que la récolte des organes soit effectuée efficacement, est la partie la plus importante de la procédure, suivie par le démarrage de l’essai de mise au point avec des cellules de haute qualité.Cette procédure a été utilisée pour quantifier le virus pour plusieurs familles virales. Ce protocole peut également être adapté pour dépister les composés thérapeutiques et quantifier les titres neutralisants d’anticorps. Ces techniques sont utilisées pour quantifier les virus vivants et des mesures de sécurité appropriées devraient être prises conformément aux lignes directrices énoncées dans le BMBL.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La vidéo montre une procédure de quantification du virus Zika dans plusieurs organes de souris au moyen d’un test de formation de foyer. Le processus consiste à infecter des monocouches de cellules de mammifères avec des homogénats de tissus infectés par le virus, puis à utiliser de la méthylcellulose pour prévenir la propagation virale. Par la suite, l’immunomarquage est utilisé pour permettre une quantification et une mesure précises de l’infectiosité spécifique d’un organe.

Dosage de la formation de focalisation pour quantifier les titres de virus dans les organes d’une souris infectée

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