Explorer l'espace de séquence pour identifier les sites de liaison pour les protéines de liaison de l'ARN réglementaires

Le protocole est utilisé pour la mutagenèse de saturation d’un site liant les protéines. Si votre site de liaison protéique n’est pas connu, il peut être identifié à l’aide de ce protocole. La technique est pertinente pour le diagnostic et la thérapie de la maladie.

Je crois que son plein potentiel en sciences biomédicales reste à exploiter pleinement. Cette méthode peut être largement appliquée à n’importe quelle protéine ou réaction où les molécules désirées peuvent être séparées des molécules non désirées. Assurez-vous que la bibliothèque est correctement randomisée, et assurez-vous que lors de chaque étape de liaison et de séparation, l’enrichissement des molécules désirées est élevé.

Il implique plusieurs étapes et de nombreux détails qui sont mieux démontrés, plutôt que expliqués en mots. Après avoir regardé cette vidéo, vous devez être à l’aise avec la façon de préparer une bibliothèque aléatoire, synthétiser un pool d’ARN de départ, et effectuer une réaction contraignante à des molécules distinctes désirées et non désirées pour obtenir une affinité élevée et des liants spécifiques. Tout d’abord, synthétiser l’amorce avant et l’amorce inverse par synthèse chimique sur un synthétiseur d’ADN.

En outre, synthétisez un modèle aléatoire d’oligonucléotide de bibliothèque avec 31 positions randomisées. Dans un tube PCR, mélanger un modèle de bibliothèque aléatoire d’ADN d’un micromolaire, amorce avant d’un micromolaire contenant le promoteur et l’amorce inverse de polymése d’ARN de T7, Tris de 20 millimolaires au pH huit, chlorure de magnésium de 1,5 millimolar, chlorure de potassium de 50 millimlaire, 1-microgrammes-par-milliliter albumine bovine de sérum, deux unités de polymése de Taq, et 200 micromolaires chacun des dNTPs. Installez la machine PCR avec cinq cycles de dénaturation, d’annealage et d’extension, suivis d’un cycle d’extension pour attacher le promoteur à la bibliothèque d’ADN.

Mettre en place une réaction de transcription de 100 microlitres contenant le tampon de transcription T7, l’ADN aléatoire d’un micromolaire de piscine de bibliothèque, la TNT de cinq millimolaires, le GTP de deux millimolaires, un millimolaire chacun de l’ATP, du CTP, et de l’UTP, et la polymése d’ARN T7 de deux unités par microlitre. Maintenant, mettez un bouclier en verre acrylique et des gants. Introduire la radioactivité en ajoutant 5 microlitres ou moins d’alpha-32P UTP dans la réaction de transcription pour l’autoradiographie.

Incuber le mélange de réaction dans un tube de microcentrifugeuse pendant deux heures à 37 degrés Celsius. Pour purifier l’ARN, préparez un gel polyacrylamide de 10 %. Chargez des échantillons dans les puits du gel.

Exposez le gel à un film à rayons X, et identifiez l’emplacement des transcriptions sur le gel et découpez la tranche de gel. Placer la tranche de gel dans un tube de centrifugeuse et casser en petits morceaux avec une pointe homogénéisante. Ajouter le tampon proteinase K pour immerger les morceaux de gel.

Laissez le tube sur un nutator pendant au moins deux heures à température ambiante. Ensuite, tournez dans une microcentrifugeuse à grande vitesse pendant cinq minutes à température ambiante pour enlever les débris de gel et récupérer la solution tampon. Ajouter un volume égal de phénol-chloroforme dans le tube avec le supernatant, le vortex et la centrifugeuse.

Répétez l’extraction avec du phénol-chloroforme une fois de plus, puis avec du chloroforme une fois de plus. Ensuite, mélangez la phase aqueuse du tampon proteinase K avec 1/10 volume d’acétate de sodium trois molaires au pH 5,2, 10 microgrammes d’ARN ou 20 microgrammes de glycogène, et deux à trois volumes d’éthanol stockés à moins 20 degrés Celsius. Laissez le tube à moins 80 degrés Celsius pendant une heure.

Faites tourner le tube contenant la solution pendant cinq à dix minutes à quatre degrés Celsius dans une microcentrifugeuse. Jetez soigneusement le supernatant et ajoutez 70 % d’éthanol pour rincer la pastille d’ARN. Tourner de deux à cinq minutes.

Aspirez soigneusement l’éthanol et séchez à l’air le granulé d’ARN. Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’eau traités avec dePC pour solubiliser la pastille d’ARN. Laissez l’échantillon à moins 20 degrés Celsius pour l’entreposage.

Pour lier les protéines et l’ARN dans un volume de réaction de 100 microlitres, préparer d’abord l’hydrochlorure tris de 10 millimillires au pH 7,5 contenant du chlorure de potassium de 50 millimillires, une TNT millimolaire, de l’albumine bovine de sérum 09 microgrammes par microlitre, de l’ARN 5 unités par microlitre, de l’ARN de 15 microgrammes par microlitre et de l’EDTA d’un millimolaire. Ajouter ensuite 30 microlitres de protéine recombinante PTB et 10 microlitres d’ARN du pool approprié. Placez les tubes contenant les réactions de liaison dans un bloc de température pendant environ 30 minutes à 25 degrés Celsius.

Ensuite, fractionnez l’ARN lié de l’ARN non lié à travers quatre tours de sélection et d’amplification. Tout d’abord, filtrer l’échantillon de 100 microlitres à température ambiante à l’aide d’un filtre à nitrocellulose attaché à un collecteur de vide. Le complexe ARN-protéine reste sur le filtre.

À l’aide d’une lame de rasoir stérile, hacher le filtre en fragments et les insérer dans un tube de centrifugeuse. Immerger les morceaux de filtre dans le tampon proteinase K, et le placer sur un tumbler pendant au moins trois heures ou toute la nuit pour récupérer l’ARN. Pour déprotéiniser l’échantillon d’ARN, ajouter un volume égal de phénol-chloroforme, vortex, puis centrifugeuse à grande vitesse pendant cinq minutes à température ambiante.

Obtenir la phase aqueuse, et extraire avec du chloroforme à nouveau. Après cela, mélanger le supernatant avec 1/10 volume d’acétate de sodium trois molaire au pH 5,2 et deux à trois volumes d’éthanol absolu. Laissez le tube dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis centrifugez-le à grande vitesse pendant 10 minutes.

Répétez les étapes de lavage et de séchage avec 70% d’éthanol, et solubilisez l’ARN dans de l’eau traitée par DEPC. Après le premier tour de l’analyse de liaison de filtre, effectuer trois tours de plus. Ensuite, effectuez deux cycles de transcription, de liaison et d’amplification pour séparer les fractions d’ARN liées aux protéines des fractions non liées.

Préfabriquis d’un gel indigène de polyacrylamide de 5% avec le rapport acrylamide-bis-acrylamide 60-to-one dans le tampon 5x TBE. Ensuite, configurer la réaction de liaison ARN-protéine. Placez le gel dans un dispositif d’électrophoresis rempli de tampon 5x TBE dans une pièce froide à quatre degrés Celsius.

Appliquer 250 volts pendant 15 minutes, et pipette la réaction de liaison dans différents puits. Ensuite, fractionnez davantage l’ARN lié de l’ARN non lié en exécutant l’électrophorèse à 250 volts pendant une à deux heures. Ensuite, exposez le gel à un film radiographique et identifiez l’emplacement de l’ARN lié à l’aide de l’autoradiographie.

Découpez la tranche de gel avec l’ARN lié et insérez-la dans un tube. Écraser la tranche de gel et l’incuber dans le tampon proteinase K pendant trois heures ou toute la nuit. Répétez l’extraction avec du phénol-chloroforme et du chloroforme comme décrit précédemment.

Synthétiser l’ADNd à partir de l’ARN dissous. Préparez 20 microlitres de réaction, y compris deux microlitres de tampon 10x RT, deux microlitres de transcriptase inverse AMV, un microlitre d’amorce inverse, cinq microlitres d’eau et 10 microlitres de l’ARN dissous. Incuber à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Amplifiez le CDNA en utilisant 20 à 25 cycles PCR comme décrit précédemment. Répétez le processus de synthèse de l’ARN, de liaison protéique et de séparation des fractions liées aux protéines et non liées. Pour analyser la liaison protéique, utilisez l’analyse de changement de mobilité du gel ou l’analyse de liaison du filtre pour déterminer l’affinité et la spécificité de liaison pour certains pools ou séquences individuelles dans chaque pool.

Utilisez l’autoradiographie ou un imageur de phosphore pour détecter et quantifier les bandes de la fraction liée et de la fraction non liée. Continuez le protocole avec le clonage et l’alignement des séquences. Dans cette étude, une sélection-amplification réussie a été réalisée.

La protéine liant le tractus polypyrimidine mammifère avec une concentration protéique 300 fois plus élevée montre une liaison à peine détectable à la séquence de la piscine zéro, mais une forte affinité pour le pool de séquences sélectionné. Sélection-amplification identifiée avec succès sur les protéines liant l’ARN avec le site de liaison préféré ou consensuel. L’ajout du PTB recombinant, qui se lie à un site d’épissage à trois premiers en amont, conduit à l’activation du site d’épissage alternatif ou en aval à trois premiers.

En revanche, l’ajout de hnRNP C recombinant conduit à la répression des deux sites d’épissage à trois premiers. L’ajout du facteur d’épissage général recombinant U2AF65 a inversé la répression des sites d’épissage à trois premiers à hnRNP C. Il est important de se rappeler qu’une bonne bibliothèque randomisée et des conditions de liaison appropriées qui donnent un enrichissement élevé du pli à chaque étape de liaison sont nécessaires pour le succès.

Des analyses fonctionnelles appropriées et des tests in vivo peuvent être utilisés pour valider les résultats de cette approche. Dans le domaine de l’expression des gènes, les fonctions de nombreuses protéines ont été étudiées à l’aide de cette technique. Il est important d’utiliser des gants et des joints radioactifs pour se protéger tout en travaillant avec le polyacrylamide et la radioactivité.