Name: Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Apprenez une méthode ELISA sandwich indirecte pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage en utilisant l'anticorps monoclonal mAb-D1. Cette technique rapide offre une alternative fiable au test NIH in vivo.

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5 minutes

La Dre Sylvie Morgeaux et le Dr Jean-Michel Chapsal doivent être reconnus pour leur participation clé à l’établissement de l’analyse ELISA sur les lots de vaccins et à l’organisation d’ateliers internationaux et d’études collaboratives. Nous remercions Sabrina Kali pour la lecture critique du manuscrit. Le Dr Pierre Perrin était responsable de l’isolement et de la caractérisation de mAb-D1. Ce travail a été principalement soutenu par le financement de l’Institut Pasteur.

1. Précautions de sécurité
REMARQUE : Cette méthode s’applique à la fois au RABV vivant et au vaccin inactivé.
<ol><li>Utilisez de bonnes procédures de pratique et de sécurité en laboratoire.</li>
	<li>Portez un équipement de protection personnelle (EPI) adéquat, y compris un manteau jetable, des gants, un masque, des lunettes, etc.</li>
	<li>Lorsque le virus vivant est titré, utilisez un coffret biologique de sécurité de classe II.<ol>
<li>Considérez tout matériau en contact avec les échantillons (réactifs, solutions de lavage, etc.) comme matière infectieuse.</li>
		<li>Traiter le matériau contaminé en immergeant dans la solution d’eau de Javel (2,5% d’hypochlorite de sodium) pendant 30 min pour la décontamination.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manipuler les produits chimiques conformément à la pratique du bon laboratoire.</li>
</ol>2. Préparation
<ol><li>Utilisez des réactifs de qualité analytique lorsque c’est possible.</li>
	<li>Préparer de nouvelles solutions de tampon de revêtement/tampon carbonate, tampon de passivation, diluant et tampon de citrate(tableau 1), filtrer à travers 0,45 ou 0,22 m filtres et stocker à 4 oC pendant une journée avant l’utilisation pour préserver leur pureté analytique.</li>
	<li>Permettre aux réactifs d’atteindre la température ambiante (18 à 25 oC) 30 min avant l’utilisation et homogénéiser par un mélange doux avant l’utilisation.</li>
</ol>3. Sensibilisation aux microplaques
REMARQUE : Utilisez 96 plaques d’immunoassay d’adsorption qui sont optimisées pour lier de grandes quantités d’immunoglobulines (p. ex., voir Tableau des matériaux).
<ol><li>À chaque puits, ajouter 200 L de l’anticorps monoclonal (mAb-D1) dilué dans le tampon de carbonate. REMARQUE : Une concentration optimale d’environ 1 g/mL a été déterminée expérimentalement et correspond à une dilution approximative de 1/2000 du mAb-D1 purifié. Cette concentration recommandée est indiquée pour chaque lot mAb-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le contrôle positif.</li>
	<li>Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber la microplaque pendant 3 h à 37 oC dans une atmosphère humidifiée.</li>
	<li>Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.</li>
	<li>Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 5 min.</li>
</ol>4. Passivation microplaque
<ol><li>À chaque puits, ajoutez 300 L du tampon de passivation.</li>
	<li>Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber pendant 30 minutes à 37 oC.</li>
	<li>Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.</li>
	<li>Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min. REMARQUE : La microplaque peut être immédiatement utilisée ou stockée scellée à -20 oC jusqu’à 3 mois jusqu’à l’utilisation.</li>
</ol>5. Analyse ELISA
REMARQUE : Pour établir la courbe de contrôle du vaccin de référence, l’étape 5.3 n’est pas requise; pour titrer le vaccin testé toutes les étapes 5.1 à 5.6 sont nécessaires.
<ol><li>Lavage de la microplaque sensibilisée<ol>
<li>À chaque puits, ajoutez 300 lil du tampon de lavage.</li>
		<li>Aspirez soigneusement et transférez la teneur en puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.</li>
		<li>Répétez les étapes 5.1.1 et 5.1.2 cinq fois de plus pour laver largement la plaque sensibilisée.</li>
		<li>Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Dilutions du vaccin de référence pour la courbe de contrôle<ol>
<li>Reconstituer le vaccin de référence (antigène de validation Lot 09) dans 1 ml d’eau distillée correspondant à une concentration de 10 g/mL de glycoprotéine du virus de la rage.</li>
		<li>Préparer une dilution décuplée du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre 1 g/mL de glycoprotéine du virus de la rage.</li>
		<li>Préparer 6 dilutions doubles séries de ce vaccin de référence dans le diluant comme indiqué dans le tableau 1.</li>
		<li>Distribuez 200 L du diluant en double (puits 1H/2H) pour servir de contrôle vierge.</li>
		<li>Distribuer 200 ll par puits de chaque dilution vaccinale de référence en double (puits G1/G2 à A1/A2).</li>
	</ol></li>
	<li>Dilutions du vaccin testé pour sa titration<ol>
<li>Préparer une dilution décuplée du vaccin testé dans le diluant.</li>
		<li>Préparer 7 dilutions en série doubles du vaccin testé dans le diluant comme indiqué dans le tableau 2.</li>
		<li>Distribuer 200 ll par puits de chaque dilution vaccinale testée en double (puits H3/H4 à A3/A4).</li>
	</ol></li>
	<li>Incubation/lavage de la plaque ELISA<ol>
<li>Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber pendant 1 h à 37 oC.</li>
		<li>Retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.</li>
		<li>À chaque puits, ajoutez 300 L de tampon de lavage.</li>
		<li>Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant 2,5 % de solution d’hypochlorite de sodium.</li>
		<li>Répétez les étapes 5.4.3 et 5.4.4 cinq fois pour enlever l’antigène non lié et conserver les garnitures de protéines G liées à l’anticorps enduit (mAb D1).</li>
		<li>Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Liaison du peroxidase conjugué mAb-D1<ol>
<li>Distribuez 200 ll par puits de la dilution recommandée (1/2000) de mAb-D1 étiqueté peroxidase dans le diluant (concentration approximative de 1 g/mL). Une concentration recommandée est indiquée pour chaque lot mAb-D1 et doit être vérifiée périodiquement avec le contrôle positif.</li>
		<li>Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber pendant 1 h à 37 oC.</li>
		<li>Retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,5 %.</li>
		<li>Ajouter à chaque puits, 300 l de la mémoire tampon de lavage.</li>
		<li>Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un destinataire contenant 2,5 % de solution d’hypochlorite de sodium.</li>
		<li>Répétez les étapes 5.5.4 et 5.5.5 cinq fois pour enlever l’anticorps non lié étiqueté peroxidase (mAb D1).</li>
		<li>Inverser la microplaque et laisser sécher sur un papier adsorbent à température ambiante pendant 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Révélation à l’aide d’un substrat-chromogen<ol>
<li>Distribuer 200 ll par puits de solution substrat-chromogène.</li>
		<li>Sceller la microplaque avec un film et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 min. Une couleur jaune-orange développe l’intensité de ce qui est proportionnelle à la quantité d’anticorps peroxidase lié (mAb D1).</li>
		<li>Arrêtez la réaction en ajoutant 50 L de solution d’arrêt par puits.</li>
		<li>Essuyez soigneusement le fond de la microplaque et placez-la dans un spectrophotomètre pour déterminer la densité optique (OD) à 492 nm de tous les puits utilisés : contrôle négatif (blanc), vaccin de référence et vaccin testé.</li>
		<li>Recueillir des données OD comme format de fichier .xlsx ou .xlsx pour analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Dessiner la courbe vaccinale de référence, la teneur en glycoprotéines trimériques, en fonction de la densité optique (492 nm)<ol>
<li>Calculer la moyenne de la DMO à 492 nm pour chaque double aux différentes dilutions du vaccin de référence (puits G1/G2 à A1/A2 dans le tableau 2)</li>
		<li>Soustrayez la moyenne de la DMO du Blank (puits, H1/H2 dans le tableau 2)de chaque OD moyen calculé.</li>
		<li>Tracez les valeurs oD qui en résultent sur l’axe vertical (échelle linéaire) et la concentration correspondante dans les garnitures de glycoprotéine (ng/mL) sur l’axe horizontal (échelle logarithémique).</li>
		<li>Dessinez la courbe de référence en joignant des points(figure 1).</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’épitope reconnu par le mAb-D1 est situé dans le site antigénique III de la glycoprotéine RABV qui est non seulement immuno-dominant pour l’induction de VNAbs, mais aussi impliqué dans la neurovirulence, la pathogène40,41 et la reconnaissance des récepteurs42. Il ya un autre site antigénique important le long de la glycoprotéine, site II43, contre lequel plusieurs MAbs ont été isolés tels que mAb-WI-1112<sup class=...

Depuis plus de 50 ans, le test1 des NIH est utilisé comme méthode de référence pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage avant la libération du lot. Ce test consiste en une vaccination intrapétoninenelle de groupes de souris avec le vaccin à tester suivie d’un défi intra-cérébral (IC) 14 jours plus tard avec la souche Challenge Virus Standard (CVS) du virus de la rage (RABV). La puissance est évaluée à partir de la proportion de souris survivant au défi IC. Bien que l’OMS2 et la pharmacopée européenne3 nécessitent toujours le test niSH pour évaluer la puissance vaccinale, ce test subit plusieurs obstacles : les résultats sont très variables4; LE RABV infectieux est utilisé pendant le défi, ce qui exige à la fois des compétences techniques et des mesures de biosécurité strictes; un grand nombre d’animaux sont utilisés, et la gravité du défi soulève de sérieuses préoccupations éthiques5. Une variation moins grave de ce test a été développée : deux semaines après la vaccination intra-péritonéale, les souris ne sont pas contestées par IC mais saignées et testées pour la présence d’anticorps neutralisant RABV spécifiques (VNAbs) dans leur sérum à l’aide d’un test de neutralisation in vitro. Cependant, ce test nécessite encore de sacrifier un grand nombre de souris de laboratoire, bien qu’il soit déjà utilisé pour les vaccins vétérinaires6,7 et a été considéré pour les vaccins humains8.
À l’heure actuelle, les recommandations internationales9 et européennes10 encouragent les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle (Laboratoires officiels de contrôle des médicaments - OMCL) à mettre en œuvre le remplacement, la réduction et le raffinement des essais sur les animaux de laboratoire, appelé la stratégie 3R. La directive européenne 2010/63/UE (en vigueur depuis 2013/01/01) relative à la protection et au bien-être des animaux a également renforcé les contraintes pour les fabricants de vaccins et les laboratoires impliqués dans le contrôle de la qualité des vaccins antirabiques ainsi que dans la recherche sur la rage11. En conséquence, le développement, la validation et l’utilisation d’approches in vitro alternatives sont maintenant devenus une priorité. Ceux-ci sont non seulement éthiquement sains, mais peuvent également réduire les coûts de test par lots et raccourcir le temps pour les résultats à des heures au lieu de semaines3.
À la surface de la particule RABV, la glycoprotéine adopte une forme trimétérique12,13,14,15,16. Dans le vaccin contre la rage, cette forme trimériique indigène constitue l’immunogène majeur induisant VNAbs17 tandis que les glycoprotéines monomériques, solubles ou dénaturées sont mal immunogéniques18,19. Ainsi, la préservation des garnitures de la glycoprotéine le long du processus de production du vaccin est un bon indicateur pour la préservation d’un potentiel immunogène optimal. Plusieurs méthodes immunochimiques, telles que l’anticorps-contraignant-test20,21, letest d’immunodiffusion radiale unique (SRD) et le test ELISA23,24,25,26,27 sont recommandés par le rapport technique de l’OMS Série2 et la monographie européenne3 pour quantifier la teneur en antigènes dans les vaccins contre la rage. Ceux-ci sont utilisés par les fabricants pour surveiller l’uniformité de la production de vaccins et par l’OMCL pour évaluer la formulation cohérente de lots de vaccins humains28, même si le test des NIH est toujours considéré pour la puissance.
Cependant, toutes ces méthodes immunochimiques ne sont pas équivalentes. Le test SRD nécessite un pré-traitement qui peut modifier les garnitures à la membrane et entraîner une forme soluble ou dénaturée de la glycoprotéine22,29. Par conséquent, SRD n’est pas très efficace en discriminant entre les glycoprotéines immunogéniques et non immunogènes résultant en une évaluation imparfaite de l’immunogénicité d’un lot vaccinal. En revanche, le test ELISA est plus sensible22, préserve la structure indigène de la glycoprotéine, et est plus approprié pour déterminer le contenu des garnitures pliées indigènes de glycoprotéine. Le test ELISA peut utiliser soit des anticorps anti-glycoprotéines monoclonals de lapin ou de souris purifiés ou concentrés avec du sulfate d’ammonium. Des études ont démontré une bonne concordance entre le test des NIH et le contenu antigène évalué par ELISA dans les vaccins et ont conclu que les méthodes ELISA conviennent au test de puissance in vitro. Cela préconise que les tests ELISA pourraient au moins compléter ou même remplacer le test des NIH4,26,27,30,31,32,33. Aujourd’hui, la Pharmacopoeia européenne recommande l’utilisation d’essais sérologiques ou immunochimiques validés comme alternatives au test des NIH3. L’évitement complet de l’utilisation animale de la puissance vaccinale est devenu une perspective réaliste.
La méthode présentée ci-dessous est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant un clone d’anticorps monoclonal de souris (mAb-D1) qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabVtrimeric 15,34. Cette méthode a d’abord été développée à l’Institut Pasteur26,30 puis optimisée et validée par le laboratoire de l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM), c’est-à-dire le Français OMCL4,33. Le mAb-D1 est utilisé à la fois pour sensibiliser la plaque et par la suite pour détecter l’antigène capturé. Cela permet la quantification spécifique des garnitures de glycoprotéine, c’est-à-dire l’antigène RABV immunogénique. Le mAb-D1 utilisé pour la détection est étiqueté avec peroxidase, qui se révèle en présence du substrat et du chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique. Il est à noter que le même type d’essai peut être appliqué pour différents mAbs reconnaissant différents sites antigéniques de la glycoprotéine RABV35. La méthode pour obtenir et purifier ou se concentrer avec l’ammonium sulfate anti-glycorotein polyclonal rabbit immunoglobulins G (IgG) ou globulines monoclonal de souris ont été largement décrits précédemment36 avec la méthode pour conjuguer des anticorps avec peroxidase37.

<table><tbody><tr><td>Enceinte de sécurité biologique de classe II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10445753</td><td>en cas de titrage du virus vivant</td></tr><tr><td>Transparent Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates, 400 & micro ; L, MAXISORP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>439454</td><td>bon pour la liaison à l’anticorps chargé</td></tr><tr><td>Equip Labo Hotte de laboratoire en polypropylène</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12576606</td><td>pour la préparation de l’acide sulfurique Plaque d’immunologie</td></tr><tr><td>Strong Adsorption MAXISORP Flat Bottom Well F96</td><td>Dutscher</td><td>55303</td><td>bon pour la liaison à l’anticorps chargé</td></tr><tr><td>Étanchéité des microplaques Bande(100 feuilles)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur monomode Sunrise</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitateur-incubateur de microplaques</td><td>Dutscher</td><td>441504</td><td></td></tr><tr><td>Laveur de microplaques Wellwash</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5165000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette multicanaux (30-300 &micro ; L) Pipettes monocanal 12 canaux</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4661180N</td><td></td></tr><tr><td>(Kit 2 : Finnpipettes F2 0.2-2 &mu ; L micro, 2-20 &mu ; L, 20-200 &mu ; L & 100-1000 &mu ; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific 4700880</td><td></td></tr></tbody></table>

test elisa in vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

La préoccupation mondiale croissante pour le bien-être animal encourage les fabricants et les Laboratoires nationaux de contrôle (OMCLs) à suivre la stratégie 3R pour le remplacement, la réduction et le raffinement des tests de laboratoire sur les animaux. Le développement d’approches in vitro est recommandé aux niveaux de l’OMS et de l’Europe comme solutions de rechange au test des NIH pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage. À la surface de la particule du virus de la rage (RABV), les garnitures de glycoprotéine constituent l’immunogène majeur pour induire des anticorps neutralisants viraux (VNAb). Un test ELISA, où neutraliser les anticorps monoclonals (mAb-D1) reconnaître la forme trimétérique de la glycoprotéine, a été développé pour déterminer le contenu de la glycoprotéine trimérique pliée indigène avec la production des lots vaccinaux. Ce test de puissance in vitro a démontré une bonne concordance avec le test des NIH et a été jugé approprié dans les essais collaboratifs par les fabricants de vaccins RABV et les OMCLs. L’évitement de l’utilisation des animaux est un objectif réalisable dans un proche avenir.
La méthode présentée est basée sur une immunocapture indirecte de sandwich ELISA utilisant le mAb-D1 qui reconnaît les sites antigéniques III (aa 330 à 338) de la glycoprotéine rabV trimeric, c’est-à-dire, l’antigène immunogénique RABV. mAb-D1 est utilisé pour le revêtement et la détection des garnitures de glycoprotéine présentes dans le lot vaccinal. Puisque l’épitope est reconnue en raison de ses propriétés conformationnelles, la glycoprotéine potentiellement dénaturée (moins immunogène) ne peut pas être capturée et détectée par le mAb-D1. Le vaccin à tester est incubé dans une plaque sensibilisée au mAb-D1. Les glycoprotéines rabV trimeric bound sont identifiées en ajoutant le mAb-D1 encore, étiqueté avec le peroxidase et puis révélé en présence de substrat et de chromogen. La comparaison de l’absorption mesurée pour le vaccin testé et le vaccin de référence permet de déterminer la teneur en glycoprotéines immunogénique.

Dans l’exemple suivant, le vaccin de référence Lot 09, composé de particules purifiées du virus de la rage inactivée (souche vaccinale photovoltaïque), est utilisé. La teneur en glycoprotéines (10 g/ml) a été établie après la détermination de la quantité totale de protéines virales (test BCA) et l’évaluation du pourcentage de glycoprotéine par l’électrophoresis du gel SDS-polyacrylamide. Alternativement, un vaccin de référence calibré, par exemple, la normeinternationale (IS) d...

Ici, nous décrivons une immunocapture indirecte de sandwich d’ELISA pour déterminer le contenu immunogénique de glycoprotéine dans les vaccins de rage. Ce test utilise un anticorps monoclonal neutralisant (mAb-D1) reconnaissant les garnitures de glycoprotéine. Il s’agit d’une alternative au test in vivo NIH pour suivre la cohérence de la puissance vaccinale pendant la production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...

Dans le but de réduire les tests sur les animaux et en raison de la variabilité du test nh, l’OMS encourage à développer des approches in vitro pour évaluer la puissance vaccinale de la rage. Ce test ELISA montre une bonne concordance avec un test NH classique dans la reconnaissance de la forme immunogénique de la glycoprotéine, montre une sensibilité élevée, et peut être effectué en seulement une journée. L’évaluation de la puissance vaccinale de la rage in vitro par ELISA est une alternative au test in vivo NH.Il est promu par les fabricants et les laboratoires nationaux de contrôle. Il est essentiel de distribuer des volumes pré-dimensionnés en double pour chaque dilution et de bien sécher la plaque sur du papier absorbant après les lavages pour éviter de commencer cette procédure, mettre sur un équipement de protection personnelle adéquat, y compris manteau jetable, gants, masque, et des lunettes. Traitez les matières contaminées en les immergeant dans une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 % pendant 30 minutes pour la décontamination.Ensuite, installez une plaque d’immunoassay de 96 puits et ajoutez 200 microlitres de l’anticorps monoclonal dilués dans le tampon de carbonate à chaque puits. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber la microplaque à 37 degrés Celsius pendant trois heures dans un environnement humidifié. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez le contenu du puits dans un receveur contenant une solution d’hypochlorite de sodium de 2,6 %.Inverser la microplaque et la laisser sécher sur du papier absorbant à température ambiante pendant cinq minutes. Tout d’abord, ajouter 300 microlitres du tampon de passivation à chaque puits. Couvrir la plaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après cela, transférer le contenu du puits à celui contenant une solution de 2,6% hypochlorite de sodium. Pour laver la plaque, ajouter 300 microlitres du tampon de lavage à chaque puits. Ensuite, aspirez soigneusement et transférez la teneur du puits dans un receveur contenant une solution d’hypochlorite de sodium à 2,6 %.Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour laver abondamment la plaque sensibilisée. Après cela, inverser la microplaque et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Reconstituer le vaccin de référence dans un millilitre d’eau distillée de telle sorte que la concentration finale de virus de la rage glycoprotéine est de 10 microgrammes par millilitre.Préparer une dilution 10 fois du vaccin de référence reconstitué dans le diluant pour atteindre une concentration de glycoprotéine du virus de la rage d’un microgramme par millilitre. Ensuite, effectuez six dilutions périodiques doubles de ce vaccin de référence dans le diluant tel que décrit dans le tableau un du protocole de texte. Distribuer 200 microlitres du diluant dans des puits en double pour servir de contrôle aveugle et 200 microlitres par puits pour chaque dilution vaccinale de référence en double.Préparez ensuite une dilution 10 fois du vaccin testé dans le diluant et préparez sept dilutions en série doubles du vaccin testé en diluant tel que décrit dans le tableau deux du protocole du texte. Distribuez 200 microlitres de chaque dilution vaccinale testée en double à chaque puits de la microplaque. Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après cela, retirez le film. Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,7 %. Pour laver la plaque, ajouter 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits, aspirer soigneusement et transférer le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,6 %.Répétez le processus de lavage cinq fois de plus pour enlever l’antigène non lié et conserver les garnitures de protéine G liées à l’anticorps enduit. Inverser la microplaque lavée et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute. Ensuite, distribuez 200 microlitres de la dilution recommandée de l’anticorps monoclonal D1 étiqueté peroxidase en diluant à chaque puits.Couvrir la microplaque d’un film adhésif et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, retirez le film, aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite de sodium de 2,6 %. Pour laver la microplaque, ajouter 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits.Aspirez soigneusement et transférez le contenu de chaque puits dans un receveur contenant une solution hypochlorite à 2,6 % de sodium. Répétez ce processus de lavage cinq fois de plus pour enlever l’anticorps non lié étiqueté peroxidase. Inverser la microplaque lavée et la laisser sécher sur un morceau de papier absorbant à température ambiante pendant une minute.Ensuite, distribuez 200 microlitres de solution substrat-chromogène dans chaque puits. Sceller la microplaque avec du film et l’incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits pour arrêter la réaction.Essuyez soigneusement le fond de la microplaque et placez-le dans le spectrophotomètre. Déterminer la densité optique à 492 nanomètres pour tous les puits utilisés. Collectez ces données dans un fichier de feuille de calcul pour analyse.Après cela, créez des parcelles pour la courbe vaccinale de référence et les valeurs de densité optique décrites dans le protocole textuel. Dans cette étude, le test ELISA in vitro est utilisé pour évaluer la puissance vaccinale de la rage. Des valeurs de densité optique représentatives d’une expérience typique sont affichées ici.Ces valeurs sont utilisées pour dessiner la courbe vaccinale de référence en traçant la densité optique moyenne pour les différentes dilutions du vaccin de référence sur l’axe vertical et la concentration de la glycoprotéine sur l’axe horizontal. La teneur en glycoprotéines du vaccin testé est ensuite estimée à l’aide de cette courbe. L’évaluation est précise pour les dilutions qui ont une valeur moyenne de densité optique dans la zone du revêtement de la courbe vaccinale de référence.Compte tenu de la dilution de un à 40, la projection verticale de l’OD 1534 sur l’axe x correspond à 500 nanogrammes par millilitre. Ainsi, le vaccin testé est estimé à 20 microgrammes par millilitre de glycoprotéine. Lorsque la puissance in vitro est établie, il est nécessaire de comparer le vaccin testé à la référence six normes internationales de l’OMS calibrées dans des unités internationales.La même méthode peut être utilisée avec d’autres anticorps pour élargir la détection d’un plus grand nombre de souches vaccinal, y compris celles utilisées dans les vaccins vétérinaires qui sont classiquement plus variables. Les anticorps peuvent également être utilisés en compétition pour la titration d’anticorps antirabies dans le sérum équin ou humain. Des précautions doivent être prises avec des vaccins qui ne sont pas inactivés ou avec des virus.Assurez-vous d’utiliser de l’équipement de protection individuelle, de porter des gants et de tout décontaminer correctement. Aussi, soyez prudent avec les comprimés de car ils sont cancérigènes et avec la solution acide d’hypochlorite de sodium.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre la coloration immunohistochimique pour la détection de l’antigène du virus de la rage dans les tissus cérébraux de souris infectés. Le processus comprend la déparaffinisation et le traitement à l’alcool, suivis d’un traitement protéolytique pour améliorer l’accessibilité de l’antigène. La coloration immunohistochimique révèle des précipités rouges, confirmant la présence d’antigènes de la rage dans la coupe tissulaire.

Une coloration immunohistochimique pour la détection des antigènes du virus de la rage

Cette vidéo présente un test immuno-enzymatique indirect ou un test d’immunocapture sandwich ELISA conçu pour évaluer les niveaux de glycoprotéines immunogènes dans les vaccins. La plaque de test, contenant des anticorps spécifiques aux glycoprotéines, est incubée avec des échantillons de vaccin dilués en série, y compris des vaccins de référence et d’essai, suivie d’un immunodosage pour quantifier la teneur en glycoprotéines du vaccin testé.

Utilisation d’un ELISA sandwich pour déterminer la teneur en glycoprotéines immunogènes d’un vaccin

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Évaluation d’une réaction en chaîne de polymérase de transcription inverse imbriquée universelle pour la détection des lyssavirus

Nous présentons un protocole complet pour le diagnostic post mortem de la rage animale dans des conditions de terrain utilisant un essai immunochromagraphic rapide de diagnostic (RIDT), de l’échantillonnage de biopsie de cerveau à l’interprétation finale. Nous décrivons également d’autres applications utilisant le dispositif pour l’analyse moléculaire et le génotypage viral.

Test de diagnostic immunochromatographique rapide sur le terrain postmortem pour les paramètres limités par les ressources avec d’autres applications moléculaires

Nous présentons ici un protocole de test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du virus de la rage en tant que test de diagnostic alternatif pour les tissus fixés au for formel.

Test d’immunohistochimie pour la détection de l’antigène du lyssavirus à partir de tissus fixés au for formel

Ce protocole présente une approche basée sur qRT-PCR pour déterminer le numéro de copie de gène de nucléoprotéine de virus de rage (N) dans diverses structures anatomiques de cerveau bovin utilisant la transcription in vitro.

Quantitation du virus de la rage dans diverses structures cérébrales bovines

Cette méthode décrit l’encapsulation de l’antigène rabique dans des microparticules polymères biodégradables ayant des propriétés structurelles et matérielles qui permettent une libération pulsatile après un délai prédéterminé. L’évaluation par dosage immunoenzymatique (ELISA) de l’antigène extrait du noyau de particules confirme la présence intacte de glycoprotéine trimérique du virus de la rage par fabrication de particules.

Fabrication de microparticules polymères pulsatiles encapsulant l’antigène antirabique

L’objectif de ce manuscrit est d’examiner l’utilisation du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage pour la détection des anticorps IgG et IgM spécifiques de la rage.

Détection des anticorps antirabiques IgG et IgM à l’aide du test d’anticorps fluorescents indirects contre la rage

Ce protocole fait la démonstration de l’essai RT-PCR (transcription inverse en chaîne par polymérase en temps réel du pan-lyssavirus LN34), de la collecte de tissus à l’interprétation des résultats, y compris les mises à jour des séquences d’amorces et des formulations afin d’améliorer les performances des tests pour certains lyssavirus et lagomorphes non enragés. Nous démontrons également la configuration de l’essai pour un format LN34 multiplexé à puits unique (LN34M).

Diagnostic post-mortem de la rage chez les animaux par le test actualisé et multiplexé LN34 Real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Apprenez une méthode ELISA sandwich indirecte pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage en utilisant l'anticorps monoclonal mAb-D1. Cette technique rapide offre une alternative fiable au test NIH in vivo.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

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