Un test de stabilité cible sensible à l'affinité semi-quantitative des médicaments (DARTS) pour étudier l'interaction Rapamycin/mTOR

La stabilité de la cible sensible à l’affinité médicamentuse, le DARTS, est une méthode robuste de détection de nouvelles cibles protéiques à petites molécules. Il peut être utilisé pour vérifier les interactions connues de protéines à petites molécules et pour trouver des cibles protéiques potentielles pour les produits naturels. Dans cette étude, nous rehaussons davantage les capacités d’analyse des données de l’expérience DARTS en surveillant les changements dans la stabilité des protéines et en estimant l’affinité des interactions protéine-ligand.

Les interactions protéine-ligand peuvent être tracées contre deux courbes, une courbe protéolytique et une courbe dose-dépendance. Nous avons utilisé l’interaction mTOR-rapamycine comme un cas exemplaire pour l’établissement de notre protocole. Cultiver 293T cellules en utilisant DMEM avec 10% sérum bovin fœtal, glutamine de deux millimolaires, et 1% antibiotiques.

Incuber les cultures à 37 degrés Celsius sous 5% de dioxyde de carbone. Lorsque la culture atteint 80 à 90% de confluence, laver les cellules deux fois avec pbs froid. Utilisez un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules dans une quantité appropriée de tampon de lyse à cellules froides et transférer les cellules de lysing dans un tube de 1,5 millimètre.

Inverser pour bien mélanger le tampon de lyse et les cellules de lysing et incuber le tube sur la glace pendant 10 minutes. Centrifuger le tube à 18 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et garder au frais sur la glace.

Effectuez un test BCA pour rapprocher la concentration protéique des lysates et calculer la dilution de la pronase en fonction de la concentration en protéines. Tout d’abord, transférer le lysate en deux tubes de 1,5 millilitre, 99 microlitres chacun. Ajouter un microlitre de solution de bouillon de petites molécules à chaque aliquot de lysate et incuber les deux tubes pendant 30 à 60 minutes à température ambiante avec secousses.

Sur la glace, établir des dilutions périodiques de la solution de pronase fraîchement décongelée en 1x TNC. Après l’incubation avec la petite molécule, diviser chaque aliquot en 20 microlitres d’échantillons en cinq tubes. Pour assurer le même temps de digestion, à des intervalles spécifiques toutes les 30 secondes, ajoutez deux microlitres des solutions de pronase préparées aux échantillons en conséquence.

Pour le seul groupe témoin, ajouter deux microlitres de tampon TNC. Après cinq à 20 minutes, arrêter la digestion des six tubes par l’ajout de deux microlitres de froid 20x protéase inhibiteur cocktail à intervalles de 30 secondes. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant 10 minutes.

Diluer chaque échantillon avec six microlitres de tampon de chargement SDS-PAGE 5x et faire bouillir les échantillons dans un bain d’eau à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Maintenant, pour effectuer la tache occidentale, chargez des quantités égales de protéine dans les puits d’un gel de 8%SDS-PAGE, avec un marqueur de poids moléculaire approprié. Faire fonctionner le gel pendant 30 minutes à 80 volts, puis régler la tension à 120 volts et continuer à courir pendant une à deux heures.

Vérifiez que la petite molécule peut se lier directement aux protéines cibles potentielles. Dans ce protocole, l’incubation avec la petite molécule a confirmé la protection contre la protéolyse. Trois bandes se sont trouvées protégées par incubation avec de la rapamycine sur le contrôle du véhicule.

Le ballonnement occidental a illustré la présence de protéine de mTOR aux rapports bas de pronase à protéine et sa réduction et perte avec des rapports croissants. La protéolyse du mTOR par pronase a été clairement inhibée par la présence de rapamycine et l’addition de rapamycine a généré un décalage évident dans la courbe protéolytique. Rapamycin dose dépendante a augmenté le niveau de mTOR, suggérant la stabilité croissante de mTOR avec le traitement de rapamycine.

La quantification des intensités de bande protéique cible suggère que le mTOR est la protéine cible de la rapamycine. Afin d’obtenir le meilleur effet stepwise, cette expérience peut devoir être répétée plusieurs fois pour obtenir une gamme appropriée de pronase au-dessus des rapports de protéine.