Transplantation sous-capsulaire rénale du thym embryonnaire Murine traité à la déoxyguanosine de 2'-Deoxyguanosine chez les souris nues

La transplantation de thymus est une méthode importante pour étudier la fonction épithéliale de cellules de thymus et la maturation de T-cellule in vivo. Ce protocole simple et efficace peut être employé pour isoler et la souris de culture 18.5 thymus pour la transplantation suivante dans une capsule rénale. Le protocole pour la transplantation de thymus 18.5 peut être modifié pour la transplantation thymique à d’autres étapes développementales ou pour d’autres tissus d’une taille semblable.

En outre, cette procédure est très simple. Les détails de certains timbres de cas doivent être examinés attentivement lors de l’exécution de cette technique pour la première fois. Cette procédure contient des manipulations détaillées qui peuvent être mieux illustrées par la visualisation.

Après sacrifice, essuyez le jour embryonnaire 18,5 souris enceinte avec 70% d’éthanol et utilisez des instruments stérilisés autoclavés pour faire une coupe en forme de V sur l’abdomen de la vessie jusqu’à chaque corne de l’utérus. Utilisez des ciseaux pour couper le mésometrium et les zones cervicales et vaginales et récolter l’utérus dans une boîte de Pétri contenant du PBS froid sur la glace. Couper la paroi utérine antérieure d’une corne utérine à l’autre pour exposer les embryons dans l’enveloppe à decidua et utiliser des pinces fines pour peler les tissus decidual.

Couper le cordon ombilical pour libérer les embryons pour les transférer dans une nouvelle boîte de Pétri sur la glace. Pour récolter le premier thymus, essuyer un embryon avec 70% d’alcool et transférer l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri. Après la décapitation, fixer l’embryon dans le plat en position supinée et utiliser des ciseaux stériles pour couper la paroi latérale de la poitrine horizontalement le long du front axillaire.

Couper le diaphragme pour ouvrir la poitrine. Le thymus doit être visible sous forme de deux lobes blancs situés devant la trachée et adjacents au cœur. Insérez soigneusement des forceps de pointe pliés derrière le thymus et tirez doucement vers le haut pour récolter le tissu.

Vérifiez l’intégrité du thymus pour confirmer qu’il contient deux lobes jointés. Lavez ensuite le thymus avec du PBS avant d’utiliser un microscope stéréo pour couper les tissus conjonctifs et les vaisseaux sanguins. Lorsque tous les thymi ont été recueillis, transférer chaque tissu propre dans des puits individuels d’une plaque de puits de 24 contenant 500 microlitres de milieu de culture par puits.

Et ajouter 2'deoxygranosine à une concentration finale de 1,25 millimolar par puits. Ensuite, placez le thymi isolé dans l’incubateur de culture cellulaire pendant huit jours. Le dernier jour de la culture, utilisez des ciseaux pour couper une aiguille de veine du cuir chevelu sur la partie du tube d’infusion à un angle de 45 degrés et confirmer un manque de réponse à la pincement des orteils chez un animal receveur nu.

Placez la souris sur la table d’opération dans une position latérale droite et utilisez un écouvillon d’iode de 0,5% povidone pour écouvillonner la peau dans la zone chirurgicale deux fois de l’intérieur à l’extérieur du corps. Utilisez le scalpel pour faire une incision cutanée de cinq à neuf millimètres parallèle à la colonne vertébrale dans la zone rénale gauche et couper à travers le tissu sous-cutané et le muscle pour ouvrir la cavité abdominale. À l’aide d’une paire de pinces à épiler d’une main, soulevez le muscle et le tissu adipeux du bord d’incision côté colonne vertébrale du rein exposé et utilisez l’autre main pour presser doucement le rein.

Pour garder la capsule rénale humide pendant la chirurgie, mouiller la surface du rein avec de la solution saline et utiliser l’aiguille du cuir chevelu pour gratter doucement la capsule rénale sur le côté inférieur droit d’environ 1/2 à 2/3 de la largeur du rein. Faites glisser le tube d’infusion dans l’entaille de la capsule et détachez doucement la capsule rénale du rein longtemps le long côté du rein d’environ trois à quatre millimètres dans la capsule rénale. Puis rétractez le tube d’infusion.

Pour implanter le thymus dans l’espace subcapsulaire créé, lavez un thymus de culture deux fois en solution saline fraîche et connectez le tube d’infusion coupé à une seringue. Aspirez lentement le thymus préparé dans le tube d’infusion modifié. Et insérez doucement le tube d’infusion dans la capsule rénale jusqu’à ce qu’il atteigne le pôle supérieur.

Pour livrer le thymus dans la capsule rénale, rétractez le tube lentement tout en déprimant doucement le piston. À l’aide d’une lampe à alcool, chauffer légèrement l’aiguille du cuir chevelu et après avoir confirmé que tout le thymus se trouve à l’intérieur de l’espace subcapsulaire, utilisez l’aiguille chauffée pour cautériser l’entaille. Restaurer le rein cautérisé à la cavité abdominale et fermer le péritoine et le muscle avec des sutures.

À l’aide d’une suture de matelas vertical interrompue modifiée, fermez l’incision cutanée avec au moins trois nœuds et utilisez un écouvillon d’iode povidone pour désinfecter l’incision. Ensuite, fournir une injection sous-cutanée d’antibiotiques et d’analgésie et placer la souris sous une lampe infrarouge avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Ici, on peut observer un thymus embryonnaire isolant de jour 18,5 contenant deux lobes complets.

Immédiatement après l’implantation, le thymus peut être visualisé sous la capsule rénale à la pointe du rein receveur. Après huit semaines de croissance chez l’animal receveur de souris nues, le thymus reste sous la capsule, mais augmente vigoureusement en taille. Les t-cellules sont produites à la fois dans le thymus transplanté et dans le sang périphérique des receveurs de souris nues.

Mais comme prévu, aucune cellule T n’est détectée dans le périphérique des animaux nus non transplantés. De plus, dans cette expérience représentative, aucun gène LacZ n’a été détecté dans les cellules T périphériques récoltées à partir du sang périphérique des receveurs de souris nues transplantés avec des lobes de thymus contenant l’allèle lacz, ce qui indique que des cellules T périphériques ont été générées à partir des animaux receveurs. Soyez doux lorsque vous glissez le tube dans une capsule rénale.

Évitez de casser la capsule. Et assurez-vous d’avoir suffisamment d’espace dans le pour la livraison thymus. Les populations de lymphocytes T thymiques ou périphériques peuvent être analysées à l’aide d’un cytomètre d’écoulement.

Où, les réponses immunitaires dans les tissus périphériques du receveur peuvent être analysées par I2d et l’analyse histochimique immunitaire.