Name: Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 s
Description: Découvrez l'analyse fonctionnelle des variants missens humains liés aux maladies rares utilisant Drosophila melanogaster. Cette méthode in vivo rapide et économique facilite le diagnostic et l'étude des mécanismes pathologiques.

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Nous remercions Jose Salazar, Julia Wang et karen Schulze pour la lecture critique du manuscrit. Nous reconnaissons les Drs Ning Liu et Xi Luo pour la caractérisation fonctionnelle des variantes TBX2 discutées ici. Le Centre de dépistage des organismes modèles du Réseau des maladies non diagnostiquées a reçu l'appui du National Institutes of Health (NIH) Common Fund (U54 NS093793). H. T. C. a également reçu l'appui des NIH[CNCDP-K12 et NINDS (1K12 NS098482)], de l'American Academy of Neurology (Neuroscience Research grant), burroughs Wellcome Fund (Career Award for Medical Scientists), Child Neurology Society et Child Neurology Foundation ( PERF Elterman), et le Prix pour l'indépendance anticipée du directeur des NIH (DP5 OD026426). M. F. W. a également reçu le soutien de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479). S. Y. a également reçu le soutien des NIH (R01 DC014932), de la Fondation Simons (Prix SFARI : 368479), de la Alzheimer's Association (New Investigator Research Grant : 15-364099), du Fonds familial Naman pour la recherche fondamentale et du Fonds de droit Caroline Wiess pour la recherche en Médecine moléculaire. La microscopie confocale au BCM est appuyée en partie par la subvention U54HD083092 des NIH au centre de neurovisualisation du Centre de recherche sur les déficiences intellectuelles et développementales (CRDI).

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les études expérimentales utilisant le melanogaster de Drosophila fournissent un système d'ascompte robuste pour évaluer les conséquences des variantes humaines maladie-associées. Cela est dû à l'ampleur des connaissances et des divers outils génétiques qui ont été générés par de nombreux chercheurs dans le domaine de la mouche au cours du siècle dernier89. Tout comme tout autre système expérimental, cependant, il est important de reconnaître les mises en garde et les limites qui existent...

Les patients atteints de maladies rares subissent souvent un voyage ardu appelé « odyssée diagnostique » pour obtenir un diagnostic précis1. On pense que la plupart des maladies rares ont une forte origine génétique, ce qui rend les analyses génétiques/génomiques des éléments critiques de la prise de contrôle clinique. En plus du séquençage des panneaux génétiques candidats et de l'analyse de la variation des nombres de copies basée sur les microréseaux chromosomiques, les technologies de séquençage du génome entier (WGS) sont devenues des outils de plus en plus précieux au cours de la dernière décennie2, 3. À l'heure actuelle, le taux de diagnostic pour l'identification d'une variante pathogène connue dans WES et WGS est de 25 % (plus élevé dans les cas pédiatriques)4,5. Pour la plupart des cas qui restent non diagnostiqués après le WES/WGS clinique, un problème commun est qu'il y a beaucoup de gènes et de variantes de candidat. Le séquençage de nouvelle génération identifie souvent des variantes nouvelles ou ultra-rares dans de nombreux gènes, et il est difficile d'interpréter si ces variantes contribuent aux phénotypes de la maladie. Par exemple, bien que la plupart des mutations absurdes ou de changement d'image dans les gènes soient considérées comme des allèles de perte de fonction (LOF) en raison de la désintégration non-écrite de la transcription codée, les mutations tronquantes trouvées dans les derniers exons échappent à ce processus et peuvent fonctionner comme alleles bénins ou de gain de fonction (GOF)6.
En outre, prédire les effets d'un allèle de mauvais sens est une tâche intimidante, car il peut entraîner un certain nombre de scénarios génétiques différents comme décrit pour la première fois par Herman Muller dans les années 1930 (c.-à-d., amorphe, hypomorphe, hypermorphe, antimorphe, néomorphe, ou isomorphe)7 . De nombreux programmes et méthodologies silico ont été développés pour prédire la pathogénicité des variantes de mauvais sens basées sur la conservation évolutive, le type de changement d'acide aminé, la position dans un domaine fonctionnel, la fréquence d'allèle dans la population générale, et d'autres paramètres8. Cependant, ces programmes ne sont pas une solution complète pour résoudre le problème complexe de l'interprétation des variantes. Fait intéressant, une étude récente a démontré que cinq algorithmes de prédiction de la pathogène variante largement utilisés (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutation Taster) s'accordent sur la pathogénicité 80 % du temps8 . Notamment, même lorsque tous les algorithmes sont d'accord, ils renvoient une prédiction erronée de la pathogénicité jusqu'à 11% du temps. Ceci mène non seulement à l'interprétation clinique défectueuse mais peut également dissuader des chercheurs de suivre vers le haut de nouvelles variantes en les énumérant faussement comme bénins. Une façon de compléter la limitation actuelle de la modélisation silico est de fournir des données expérimentales qui démontrent l'effet de la fonction de variante in vitro, ex vivo (par exemple, les cellules cultivées, les organoïdes), ou in vivo.
Les études fonctionnelles in vivo des variantes associées aux maladies rares dans MO ont des forces uniques13 et ont été adoptées par de nombreuses initiatives de recherche sur les maladies rares à travers le monde, y compris le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) aux États-Unis et Rare Diseases Models and Mechanisms (RDMM) Networks in Canada, Japan, Europe, and Australia14. En plus de ces efforts coordonnés visant à intégrer les chercheurs de MO dans le flux de travail du diagnostic des maladies rares et des études mécanistes à l'échelle nationale, un certain nombre d'études individuelles en collaboration entre les chercheurs cliniques et les chercheurs de MO ont mené à la découverte et la caractérisation de nombreux nouveaux gènes et variantes pathogènes82,83,84.
Dans l'UDN, un centre centralisé de dépistage des organismes modèles (MOSC) reçoit des soumissions de gènes et de variantes candidats avec une description de l'état du patient et évalue si la variante est susceptible d'être pathogène à l'aide d'outils informatiques et in vivo Expériences. Dans la phase I (2015-2018) de l'UDN, le MOSC composé d'un drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] et Zebrafish Core (University of Oregon) qui a travaillé en collaboration pour évaluer les cas. En utilisant l'analyse informatique et un certain nombre de stratégies expérimentales différentes dans la drosophile et le poisson zèbre, le MOSC a jusqu'à présent contribué au diagnostic de 132 patients, l'identification de 31 nouveaux syndromes55, la découverte de plusieurs nouveaux humains gènes de la maladie (par exemple, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) et l'expansion phénotypique de la maladie connue (p. ex., CACNA1A21,ACOX122).
En plus des projets au sein de l'UDN, les chercheurs du MOSC Drosophila Core ont contribué à de nouvelles découvertes de gènes pathogènes en collaboration avec les Centers for Mendelian Genomics et d'autres initiatives (p. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) en utilisant le même ensemble d'informatique et de génétique stratégies développées pour l'UDN. Compte tenu de l'importance des études de MO sur le diagnostic des maladies rares, le MOSC a été élargi pour inclure un noyau de C. elegans et un deuxième noyau de poisson zèbre (tous deux à l'Université de Washington à St. Louis) pour la phase II (2018-2022) de l'UDN.
Ce manuscrit décrit un protocole d'étude fonctionnel in vivo qui est activement utilisé dans le noyau d'ODN MOSC Drosophila pour déterminer si les variantes de mauvais sens ont des conséquences fonctionnelles sur la protéine d'intérêt à l'aide de mouches transgéniques qui expriment l'homme Protéines. L'objectif de ce protocole est d'aider les chercheurs de MO à travailler en collaboration avec des groupes de recherche clinique afin de fournir des preuves expérimentales qu'une variante candidate d'un gène d'intérêt a des conséquences fonctionnelles, facilitant ainsi le diagnostic clinique. Ce protocole est le plus utile dans un scénario dans lequel un chercheur de Drosophila est approché par un chercheur clinique qui a un patient rare de maladie avec une variante spécifique de candidat dans un gène d'intérêt.
Ce protocole peut être divisé en trois éléments : (1) la collecte d'informations pour évaluer la probabilité que la variante d'intérêt soit responsable du phénotype du patient et la faisabilité d'une étude fonctionnelle dans Drosophila, (2) la collecte d'outils génétiques existants et d'en établir de nouveaux, et (3) d'effectuer des études fonctionnelles in vivo. Le troisième élément peut en outre être subdivisé en deux sous-éléments en fonction de la façon dont la fonction d'une variante d'intérêt peut être évaluée (expérience de sauvetage ou stratégies basées sur la surexpression). Il est important de noter que ce protocole peut être adapté et optimisé à de nombreux scénarios en dehors de la recherche sur les maladies monogéniques rares (p. ex., maladies courantes, interactions gènes-environnement et écrans pharmacologiques/génétiques pour identifier des cibles thérapeutiques). La capacité de déterminer la fonctionnalité et la pathogénicité des variantes profitera non seulement au patient d'intérêt en fournissant un diagnostic moléculaire précis, mais aura également des impacts plus larges sur la recherche scientifique translationnelle et fondamentale.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Stocks pour la transgenèse UAS-ADNc humain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Souches d’injection pour la transgenèse (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24871</td><td>Réactif spécifique : VK33 (3ème chromosome) Ligne d’injection</td></tr><tr><td>Souches d’injection pour la transgenèse (D. melanogaster)</td><td>BDSC</td><td>#24872</td><td>Réactif spécifique : VK37 (2e chromosome) Ligne d’injection</td></tr><tr><td><fort>ADN plasmidique </fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vecteur de clonage</td><td>Thermo Fisher</td><td>#12536-017</td><td>Réactif spécifique : vecteur de transgenèse pDONR221</td></tr><tr><td>Drosophila</td><td>Don des Drs Johannes Bischof et Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS)</td><td></td><td>Réactif spécifique : pGW-HA.attB</td></tr><tr><td>Kits et réactifs de biologie moléculaire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A2790</td><td>Réactif spécifique : Agarose (grade de biologie moléculaire)</td></tr><tr><td>Cellules chimiquement compétentes (E. coli)</td><td>Thermo Fisher</td><td>#18265017</td><td>Réactif spécifique : DH5&alpha ;</td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel d’ADN</td><td>Thermo Fisher</td><td>#K210012</td><td>Réactif spécifique : Kit d’extraction de gel PureLink</td></tr><tr><td>Kit d’isolement et de purification de l’ADN</td><td>Qiagen</td><td>#27104</td><td>Réactif spécifique : QIAprep Spin Miniprep Kit Miniprep</td></tr><tr><td>Haute Fidélité Polymérase</td><td>NEB</td><td>#M0491</td><td>Réactif spécifique : Q5 Kit de polymérase</td></tr><tr><td>Système de clonage médié par recombinase</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11789020</td><td>Réactif spécifique : Gateway BP Clonase kit</td></tr> de <tr><td>clonase Système de clonage médié par recombinase</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11791100</td><td>Réactif spécifique : Gateway LR Clonase II Kit enzymatique</td></tr><tr><td>Kit de mutagenèse dirigée</td><td>Agilent</td><td>#200523</td><td>Réactif spécifique : Quick Change II Kit de mutagenèse</td></tr> <tr><td>Electroretinogram Équipement associé au banc d’essai</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ERG Analysis</td><td>Dispositifs moléculaires</td><td>N/A</td><td>Réactif spécifique : Axon pCLAMP 10 Data Software</td></tr><tr><td>Package ERG Data Collection</td><td>LabX</td><td>#R150358</td><td>Réactif spécifique : ISO-DAM Amplificateur biologique isolé</td></tr><tr><td>Stimulateur ERG</td><td>Astro-Med</td><td>#S48</td><td>Réactif spécifique : Stimulateur à impulsions carrées</td></tr></tbody></table>

Étude fonctionnelle in vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Les progrès de la technologie de séquençage ont rendu les ensembles de données à génome entier et à l'exome entier plus accessibles pour le diagnostic clinique et la recherche de pointe en génétique humaine. Bien qu'un certain nombre d'algorithmes in silico aient été développés pour prédire la pathogénicité des variantes identifiées dans ces ensembles de données, les études fonctionnelles sont essentielles pour déterminer comment des variantes génomiques spécifiques affectent la fonction protéique, en particulier pour le mauvais sens Variantes. Dans le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) et d'autres consortiums de recherche sur les maladies rares, des organismes modèles (MO), y compris Drosophila, C. elegans, le poisson zèbre et les souris sont activement utilisés pour évaluer la fonction de la maladie humaine putative causant des maladies Variantes. Ce protocole décrit une méthode pour l'évaluation fonctionnelle des variantes humaines rares utilisées dans le centre de dépistage des organismes modèles Drosophila Core de l'UDN. Le flux de travail commence par la collecte d'informations humaines et MO à partir de plusieurs bases de données publiques, en utilisant la ressource Web MARRVEL pour évaluer si la variante est susceptible de contribuer à l'état d'un patient ainsi que la conception d'expériences efficaces basées sur disponibles connaissances et ressources. Ensuite, des outils génétiques (p. ex., T2A-GAL4 et UAS-human cDNA lines) sont générés pour évaluer les fonctions des variantes d'intérêt dans Drosophila. Lors du développement de ces réactifs, des essais fonctionnels à deux volets basés sur des expériences de sauvetage et de surexpression peuvent être effectués pour évaluer la fonction de la variante. Dans la branche de sauvetage, les gènes de la mouche endogène sont « humanisés » en remplaçant le gène orthologue Drosophila par des transgènes humains de référence ou de variante. Dans la branche de surexpression, les protéines humaines de référence et de variante sont exogènes entraînées dans une variété de tissus. Dans les deux cas, tout phénotype évolutif (p. ex. létalité, morphologie des yeux, électrophysiologie) peut être utilisé comme lecture, quelle que soit la maladie d'intérêt. Les différences observées entre les alleles de référence et les alleles de variante suggèrent un effet variante-spécifique, et donc la pathogénie probable. Ce protocole permet des évaluations rapides et in vivo des variantes humaines présumées causant des maladies des gènes avec des fonctions connues et inconnues.

Étude fonctionnelle de la variante de de novo Missense dans EBF3 liée aux phénotypes neurodéveloppementaux Chez un homme de 7 ans présentant des phénotypes neurodéveloppementaux, y compris l'hypotonie, l'ataxie, le retard de développement global et le trouble de la parole expressif, les médecins et les généticiens humains du National Institutes of Health Undiagnosed Diseases Project (UDP) a identifié une variante de de novo missense (p.R.R163Q) dans EBF3 (Early B-Cell Factor 3</e...

L'objectif de ce protocole est de décrire la conception et la performance d'expériences in vivo dans Drosophila melanogaster pour évaluer les conséquences fonctionnelles des variantes génétiques rares associées aux maladies humaines.

Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Ce protocole nous permet de déterminer si les variantes de faux sens dans les gènes humains qui sont liés à des maladies affectent la fonction protéique. C’est difficile à réaliser sur le plan informatique, même avec des algorithmes de pointe. Cette technique permet une analyse rapide des variantes de missense dans les protéines humaines à l’aide d’un système in vivo Drosophila melanogaster qui est plus rapide et plus rentable que les organismes modèles vertébrés.Démontrer qu’une variante spécifique affecte la fonction protéique contribue directement au diagnostic des maladies rares et sert de point de départ pour l’analyse des mécanismes de la maladie et les thérapies potentielles. Ce protocole est particulièrement utile lors de l’étude des variantes liées aux maladies rares, mais il peut être appliqué à des maladies plus courantes comme l’autisme et le cancer. Il peut être difficile d’identifier les phénotypes reproductibles chez les mouches qui reflètent la fonction protéique.Les phénotypes peuvent varier d’un gène à l’autre et peuvent être subtils. Les études fonctionnelles des variantes des protéines humaines utilisant la drosophile peuvent être réalisées sur la base d’expériences de sauvetage ou d’études sur la surexpression. Avant de commencer la procédure, recueillir des informations sur le gène humain d’intérêt et son organisme modèle orthologs.Pour tester la fonction variante en surexprimant les protéines humaines de référence et de variante dans le système visuel de mouche, générer des mouches transgéniques qui expriment des références ou des variantes d’ADN humains d’intérêt sous le contrôle de la séquence d’activation en amont gal4 ou système UAS. Pour sélectionner une lignée Gal4 spécifique pour exprimer les protéines humaines dans un tissu moucheté spécifique, croisez trois à cinq femelles vierges de la lignée Gal4 avec trois à cinq mâles de chacune des lignées transgéniques humaines de l’ADCA du SAMU en flacons simples ou en doublons. Transférez les croix tous les deux à trois jours pour obtenir le plus grand nombre possible d’animaux qui s’approchent d’une seule croix et examinez l’animal enfermé au microscope à dissection afin d’identifier toute différence entre les souches de référence et les souches variantes.S’il y a un défaut visible, imagez les mouches pour documenter les phénotypes. Pour générer des mouches à tester pour les défauts fonctionnels dans le système visuel, croisez les femelles vierges de la lignée rhodopsine 1 Gal4 aux mâles avec des transgènes cDNA humains de référence ou de variante UAS pour exprimer les protéines humaines d’intérêt pour les photorécepteurs R1 à R6 dans la rétine volante. Une fois que les mouches commencent à s’enfermer, rassembler la descendance dans des flacons frais et remettre les flacons dans un incubateur réglé à la température expérimentale appropriée pendant trois jours supplémentaires pour permettre au système visuel de mûrir.À la fin de l’incubation, immobiliser les mouches avec une méthode d’anesthésie appropriée et coller délicatement un côté de chaque mouche sur une lame de microscope en verre. Après avoir mis en place une plate-forme d’électrorétogramme, placez un capillaire en verre de 1,2 millimètre dans un tire-aiguille et brisez le tube capillaire pour obtenir deux électrodes coniques creuses pointues de moins de 0,5 millimètre de diamètre. Remplissez les capillaires d’une solution saline de 100 millimlaires en prenant soin d’éviter les bulles d’air et faites glisser les capillaires de verre sur les électrodes de fil d’argent.Serrer les capillaires en place et acclimater les mouches pour compléter l’obscurité pendant au moins 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’accoutumabilité, placez la glissière contenant les mouches sur l’appareil d’enregistrement et déplacez les micromanipulateurs portant les électrodes de référence et d’enregistrement près de la mouche d’intérêt. En regardant le bout de l’électrode, placez soigneusement l’électrode de référence dans le thorax de la mouche pénétrant la cuticule et placez l’électrode d’enregistrement sur la surface de l’œil.Pour réussir les enregistrements d’électrorétogrammes, prenez soin d’appliquer une quantité appropriée de pression sur l’électrode d’enregistrement afin qu’elle provoque une petite fossette sans pénétrer dans l’œil. Lorsque les électrodes ont été placées, éteignez la lumière primaire pendant trois minutes pour réacclimater les mouches à l’environnement sombre. À la fin de la période de re-acclimation, ouvrez et fermez l’obturateur une fois par seconde pendant 20 secondes en enregistrant les électrorétogrammes d’au moins 15 mouches par glissière par génotype par condition à l’aide des mêmes électrodes.Lorsque les enregistrements des mouches de référence et de variante sont terminés, comparez les enregistrements d’électrorétogrammes de la référence, de la variante et des contrôles pour évaluer les différences. Évaluez ensuite les données de l’électrorétogramme pour décelér les changements sur les transitoires, la dépolarisation, les transitoires et la repolarisation. Dans cette expérience représentative, des études basées sur la surexpression ont été réalisées pour TBX2 puisque la référence humaine TBX2 n’a pas été en mesure de remplacer fonctionnellement le gène orthologue de mouche rendant impossibles les stratégies basées sur le sauvetage.Lorsque la référence TBX2 humaine a été surexprimée dans l’œil en développement et les parties du cerveau en utilisant Gal4 sans yeux, la surexpression se traduit par une létalité d’environ 85% et une réduction significative de la taille des yeux. En revanche, la variante transgène est moins puissante pour causer la létalité et induit un petit phénotype oculaire utilisant le même conducteur dans des conditions expérimentales identiques suggérant que la variante affecte la fonction protéique. En outre, lorsqu’un TBX2 humain de référence est surexprimé dans les photorécepteurs à l’aide de rhodopsine Gal4, la surexpression provoque une altération significative de la trace d’électroréinogramme.Ce phénotype est plus doux lorsque la protéine variante est exprimée fournissant d’autres preuves que la variante d’intérêt affecte la fonction protéique in vivo. Il est important de noter que chaque gène est unique, il n’y a donc pas d’expérience unique qui puisse évaluer l’impact de toutes les variantes associées à la maladie. En plus de travailler avec les ADN humain, on peut également déterminer si la variante a des conséquences fonctionnelles en introduisant des variantes analogues dans les résidus conservés évolutionnellement du gène de la mouche orthologue.En utilisant cette méthode, nous avons contribué à un certain nombre d’études sur la découverte de gènes de maladies humaines en collaboration avec le Réseau des maladies non diagnostiquées et d’autres groupes.

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