Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

Ce protocole nous permet de déterminer si les variantes de faux sens dans les gènes humains qui sont liés à des maladies affectent la fonction protéique. C’est difficile à réaliser sur le plan informatique, même avec des algorithmes de pointe. Cette technique permet une analyse rapide des variantes de missense dans les protéines humaines à l’aide d’un système in vivo Drosophila melanogaster qui est plus rapide et plus rentable que les organismes modèles vertébrés.

Démontrer qu’une variante spécifique affecte la fonction protéique contribue directement au diagnostic des maladies rares et sert de point de départ pour l’analyse des mécanismes de la maladie et les thérapies potentielles. Ce protocole est particulièrement utile lors de l’étude des variantes liées aux maladies rares, mais il peut être appliqué à des maladies plus courantes comme l’autisme et le cancer. Il peut être difficile d’identifier les phénotypes reproductibles chez les mouches qui reflètent la fonction protéique.

Les phénotypes peuvent varier d’un gène à l’autre et peuvent être subtils. Les études fonctionnelles des variantes des protéines humaines utilisant la drosophile peuvent être réalisées sur la base d’expériences de sauvetage ou d’études sur la surexpression. Avant de commencer la procédure, recueillir des informations sur le gène humain d’intérêt et son organisme modèle orthologs.

Pour tester la fonction variante en surexprimant les protéines humaines de référence et de variante dans le système visuel de mouche, générer des mouches transgéniques qui expriment des références ou des variantes d’ADN humains d’intérêt sous le contrôle de la séquence d’activation en amont gal4 ou système UAS. Pour sélectionner une lignée Gal4 spécifique pour exprimer les protéines humaines dans un tissu moucheté spécifique, croisez trois à cinq femelles vierges de la lignée Gal4 avec trois à cinq mâles de chacune des lignées transgéniques humaines de l’ADCA du SAMU en flacons simples ou en doublons. Transférez les croix tous les deux à trois jours pour obtenir le plus grand nombre possible d’animaux qui s’approchent d’une seule croix et examinez l’animal enfermé au microscope à dissection afin d’identifier toute différence entre les souches de référence et les souches variantes.

S’il y a un défaut visible, imagez les mouches pour documenter les phénotypes. Pour générer des mouches à tester pour les défauts fonctionnels dans le système visuel, croisez les femelles vierges de la lignée rhodopsine 1 Gal4 aux mâles avec des transgènes cDNA humains de référence ou de variante UAS pour exprimer les protéines humaines d’intérêt pour les photorécepteurs R1 à R6 dans la rétine volante. Une fois que les mouches commencent à s’enfermer, rassembler la descendance dans des flacons frais et remettre les flacons dans un incubateur réglé à la température expérimentale appropriée pendant trois jours supplémentaires pour permettre au système visuel de mûrir.

À la fin de l’incubation, immobiliser les mouches avec une méthode d’anesthésie appropriée et coller délicatement un côté de chaque mouche sur une lame de microscope en verre. Après avoir mis en place une plate-forme d’électrorétogramme, placez un capillaire en verre de 1,2 millimètre dans un tire-aiguille et brisez le tube capillaire pour obtenir deux électrodes coniques creuses pointues de moins de 0,5 millimètre de diamètre. Remplissez les capillaires d’une solution saline de 100 millimlaires en prenant soin d’éviter les bulles d’air et faites glisser les capillaires de verre sur les électrodes de fil d’argent.

Serrer les capillaires en place et acclimater les mouches pour compléter l’obscurité pendant au moins 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’accoutumabilité, placez la glissière contenant les mouches sur l’appareil d’enregistrement et déplacez les micromanipulateurs portant les électrodes de référence et d’enregistrement près de la mouche d’intérêt. En regardant le bout de l’électrode, placez soigneusement l’électrode de référence dans le thorax de la mouche pénétrant la cuticule et placez l’électrode d’enregistrement sur la surface de l’œil.

Pour réussir les enregistrements d’électrorétogrammes, prenez soin d’appliquer une quantité appropriée de pression sur l’électrode d’enregistrement afin qu’elle provoque une petite fossette sans pénétrer dans l’œil. Lorsque les électrodes ont été placées, éteignez la lumière primaire pendant trois minutes pour réacclimater les mouches à l’environnement sombre. À la fin de la période de re-acclimation, ouvrez et fermez l’obturateur une fois par seconde pendant 20 secondes en enregistrant les électrorétogrammes d’au moins 15 mouches par glissière par génotype par condition à l’aide des mêmes électrodes.

Lorsque les enregistrements des mouches de référence et de variante sont terminés, comparez les enregistrements d’électrorétogrammes de la référence, de la variante et des contrôles pour évaluer les différences. Évaluez ensuite les données de l’électrorétogramme pour décelér les changements sur les transitoires, la dépolarisation, les transitoires et la repolarisation. Dans cette expérience représentative, des études basées sur la surexpression ont été réalisées pour TBX2 puisque la référence humaine TBX2 n’a pas été en mesure de remplacer fonctionnellement le gène orthologue de mouche rendant impossibles les stratégies basées sur le sauvetage.

Lorsque la référence TBX2 humaine a été surexprimée dans l’œil en développement et les parties du cerveau en utilisant Gal4 sans yeux, la surexpression se traduit par une létalité d’environ 85% et une réduction significative de la taille des yeux. En revanche, la variante transgène est moins puissante pour causer la létalité et induit un petit phénotype oculaire utilisant le même conducteur dans des conditions expérimentales identiques suggérant que la variante affecte la fonction protéique. En outre, lorsqu’un TBX2 humain de référence est surexprimé dans les photorécepteurs à l’aide de rhodopsine Gal4, la surexpression provoque une altération significative de la trace d’électroréinogramme.

Ce phénotype est plus doux lorsque la protéine variante est exprimée fournissant d’autres preuves que la variante d’intérêt affecte la fonction protéique in vivo. Il est important de noter que chaque gène est unique, il n’y a donc pas d’expérience unique qui puisse évaluer l’impact de toutes les variantes associées à la maladie. En plus de travailler avec les ADN humain, on peut également déterminer si la variante a des conséquences fonctionnelles en introduisant des variantes analogues dans les résidus conservés évolutionnellement du gène de la mouche orthologue.

En utilisant cette méthode, nous avons contribué à un certain nombre d’études sur la découverte de gènes de maladies humaines en collaboration avec le Réseau des maladies non diagnostiquées et d’autres groupes.