Contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome murin à partir de cellules souches de mélanocytes mutants

Le mélanome est largement diagnostiqué dans le monde entier, avec une incidence croissante. Ces protocoles permettent de contrôler soigneusement les premiers stades de l’initiation du mélanome, ce qui facilite l’étude de son développement. En contrôlant l’heure et l’emplacement de l’activation des cellules souches mélanocytes, nous avons la capacité de discerner les changements au sein de la population de cellules souches et son initiation du mélanome de souche nouvelle souche.

Dahihm Kim et Luye An, étudiants diplômés du laboratoire, démontreront la procédure. Deux à trois jours avant le début de l’intervention, utilisez une tondeuse électrique pour raser la peau dorsale de chaque souris anesthésiée de sept semaines. Le jour de l’expérience, utilisez un coton-tige pour appliquer une fine couche de crème depilatory sur la peau exposée.

Une fois que la crème a été appliquée uniformément, utilisez des cotons-tiges propres pour enlever la crème, suivie d’un léger essuyage avec un chiffon humide pour enlever toute crème résiduelle. Retournez ensuite chaque souris dans sa cage d’accueil avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie. Pour l’irradiation UV-B, couvrez la peau dorsale d’un matériau protecteur UV-B de sorte que seule la région désirée soit exposée, et couvrez la chambre UV d’un couvercle résistant aux UV.

Allumez ensuite la lampe UV-B pour irradier la souris pendant la période expérimentale appropriée avant de retourner la souris dans une cage vide avec surveillance jusqu’à la récupération complète. Pour isoler les échantillons de peau, utilisez une tondeuse électrique pour enlever les cheveux de la zone dorsale de la peau des souris irradiées euthanasiées, et brossez légèrement la peau exposée avec un tissu sans peluche pour dégager la zone. Faire une petite incision avec des ciseaux pointus juste au-dessus de la base de la queue et insérer de grands ciseaux émoussés dans l’incision pour séparer les tissus conjonctifs sous-dermaux.

À l’aide de ciseaux pointus, couper soigneusement le long du bord de la région de la peau d’intérêt pour isoler l’échantillon de tissu et placer le tissu de la peau excisée sur une serviette en papier propre. Ensuite, utilisez des forceps ternes pour étirer la peau afin qu’elle adhère à la serviette et est tendue. Lorsque tous les échantillons ont été récoltés, placez un échantillon de peau et un support de serviette en papier dans un morceau de papier filtre plié immédiatement à côté du pli, en prenant soin que l’échantillon est lisse et non plié ou froissé.

Fermez les côtés du papier filtre avec des agrafes et coupez le papier. Puis submergez complètement les échantillons dans de la formaline tamponnée neutre à 10 % pendant trois à cinq heures à température ambiante avant de laver les tissus avec deux lavages de cinq minutes dans de l’eau déionisée. Après le deuxième lavage, retirez soigneusement tout matériau résiduel des tissus de la peau et coupez les bords des échantillons afin qu’ils ne soient pas déchiquetés.

Ensuite, faire trois coupes sagittales dans chaque échantillon de sorte que la largeur des bandes n’est pas plus de cinq millimètres, et faire des coupes transversales de sorte que les échantillons ne sont pas plus de 20 millimètres de large. Placez un moule cryo contenant une température de coupe optimale ou un milieu OCT dans une orientation portrait, et placez quatre à cinq morceaux de peau sur le dessus de l’OCT. Lorsque tous les morceaux sont en place, utilisez deux paires de forceps fins pour apporter le long bord de chaque morceau de peau au fond du moule cryo de sorte que les échantillons sont verticaux dans l’OCT et perpendiculairement à la base du moule.

Remplissez ensuite le moule avec oct supplémentaire à la deuxième lèvre et placez le moule sur une surface plane d’un morceau de glace sèche, en utilisant des forceps pour ajuster tous les morceaux de peau qui peuvent avoir changé pendant le transfert que le bloc commence à geler si nécessaire. Lorsque les souris sont sept semaines après la naissance, leur peau dorsale est en telogène. Pendant le telogen, le follicule pileux et les cellules souches de mélanocyte sont connus pour être dans un état de repos quiescent, et la peau ne devrait montrer aucune croissance significative de cheveux après rasage.

La dépilation chimique, cependant, peut induire l’activation de cellules souches de follicule pileux, induisant la croissance significative de cheveux dans la région d’intérêt. Comme la déppilation chimique peut induire de manière significative l’activation des cellules souches du follicule pileux et des mélanocytes, les cellules souches mélanocytes sujettes au mélanome à l’état actif peuvent former des tumeurs et l’initiation microscopique du mélanome peut être observée dans les deux semaines suivant la déppilation chimique. L’irradiation UV-B peut également induire l’initiation de tumeur des cellules souches de mélanocytes quiescentes et tumeur-enclines.

Fait important, les UV-B induit la translocation directe des cellules souches mélanocytes de leur niche folliculaire de cellules souches à l’épiderme inter folliculaire. En outre, UV-B peut induire la formation cutanée de mélanome d’origine de cellules souches dans tout l’épiderme interfollicular. Semblable à la peau dorsale, l’initiation du mélanome induite par les UV-B peut être observée notamment dans d’autres zones de la peau, comme la peau de l’oreille.

En effet, comparée à la peau d’oreille de contrôle, couverte par le tissu UV-résistant, la peau d’oreille exposée aux UV-B démontre une pigmentation plus élevée due à une charge plus élevée d’initiation de mélanome. Différentes doses d’UV-B peuvent avoir des effets différents sur la peau de la souris et l’activité des mélanocytes. Par conséquent, il est important de déterminer et d’optimiser la dose d’irradiation avant de commencer votre expérience.