Utilisation de la microscopie de force atomique pour mesurer les propriétés mécaniques et la pression turgor des cellules et des tissus végétaux

Les propriétés mécaniques des cellules végétales sont essentielles pour être prises en compte lorsque l’on tente de comprendre les mécanismes sous-jacents au développement. La microscopie à force atomique peut être utilisée pour mesurer ces propriétés et suivre la façon dont elles changent, entre les organes, les tissus, toutes les étapes du développement. Les principaux avantages de cette technique, c’est qu’elle n’est pas invasive, qu’elle est relativement rapide et qu’elle ne nécessite pas de traitement afin qu’elle puisse être appliquée directement aux échantillons vivants.

Pour quelqu’un qui est nouveau à cette procédure, cis section de l’échantillon est vraiment critique, alors assurez-vous que vous avez vraiment une fixation mécanique appropriée de l’échantillon. Démonstration visuelle de cette procédure, est essentiel pour mieux comprendre les subtilités de la fixation de l’échantillon, le contrôle de la qualité des fosters et la configuration de mesure. Simone Bovio, ingénieure, et Yuchen Long, post-doc dans mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer, placez un morceau de ruban adhésif à double face au centre d’une boîte pétri de cinq centimètres de diamètre. Ajouter un échantillon de genesium qui a été isolé d’un bourgeon de fleur à la bande. Ajouter rapidement de l’eau au plat jusqu’à ce que l’échantillon soit complètement couvert afin d’éviter la déshydratation.

Ensuite, placez l’échantillon sur une scène AFM et déplacez la tête de sorte qu’il soit sur l’échantillon. Après avoir calibré le porte-à-faux, dans le logiciel, assurez-vous que le système est en mode QI, et l’approche de l’échantillon avec une force de point ensemble de quinze nano newtons. Ensuite, réglez une longueur Z de quatre microns et réglez la zone de balayage à quatre-vingts par quatre-vingts microns au carré avec le nombre de pixels réglés à quarante par quarante.

Ensuite, passez au panneau de paramètres d’imagerie avancés et réglez le mode à vitesse constante. En outre, l’ensemble étendre les vitesses d’entrée de la voie à deux cents microns par seconde, et le taux d’échantillonnage à vingt-cinq kilo hertz. Une fois que les paramètres ont été définis, déplacez la pointe vers la région d’intérêt sur l’échantillon.

Vérifiez que la zone à numériser est exempte de débris, localisez une région aussi plate que possible et engagez-la, puis commencez l’analyse et utilisez l’analyse rapide à faible force pour vérifier si l’échantillon se déplace. Une fois qu’une zone d’intérêt telle qu’elle a été localisée, sélectionnez une région qui est de quarante à soixante par soixante Micron au carré, et augmenter le nombre de pixels à deux pixels par micron. Ensuite, augmenter le point d’ensemble à cinq cents nano newtons, pour obtenir une indentation de cent à deux cents nanomètres.

Diminuer la longueur Z à deux microns, et l’étendre entrer la vitesse du tractus à cent microns par seconde, puis augmenter le taux d’échantillon à cinquante kilohertz, et commencer à numériser l’échantillon. Une fois terminé, enregistrez la sortie en tant qu’image et fichier de données. Ouvrez le logiciel de traitement des données et chargez le fichier de données.

Cliquez sur l’utilisation de cette carte pour le bouton de traitement par lots afin d’utiliser les mêmes paramètres sur toutes les courbes de la carte, puis allez charger le processus prédéfini et sélectionnez hertz fit. Ensuite, passez à l’opération de ligne de base commutable, et réglez la soustracte pour compenser plus l’inclinaison, et X min entre quarante et soixante pour cent. Sur l’onglet position de pointe verticale, sélectionnez sur lisse serré, si vous préférez travailler sur les données brutes.

Pour sélectionner le modèle d’ajustement approprié, rendez-vous à l’onglet ajustement de l’élasticité et sélectionnez l’une des options en fonction de la force d’adhérence attendue. Si aucune adhérence ou faible n’est présente, utilisez la courbe d’approche et préférez utiliser le modèle hertz isnader. En cas d’adhérence plus forte, utilisez le modèle de Dergen Milia Dortoprov ou DMD et travaillez sur une courbe de retard.

Définissez maintenant les paramètres géométriques de pointe basés sur la forme nominale de pointe. La pointe utilisée dans cette expérience est une pointe sphérique, avec un rayon de quatre cents nanomètres. Ensuite, réglez le rapport Poisson à 0,5 et sélectionnez les courbes de décalage.

Ajoutez une deuxième routine d’ajustement d’élasticité, en cliquant sur l’icône par la fenêtre principale, et répétez les mêmes paramètres. Enfin, spécifiez l’indentation désirée en X min puis maintenez et appliquez à tous pour itérer les étapes précédentes sur toutes les courbes de la carte. Enregistrez les résultats pour obtenir une image dans un fichier point tsv.

Pour mesurer avec des changements rapides de solution, montez un échantillon dans une boîte de Pétri, tenant un petit morceau de mastic adhésif. Sceller rapidement l’écart entre le mastic et la base de l’échantillon avec de la colle biocompatible. Attendez que la colle se solidifie, puis submergez l’échantillon dans le milieu de culture d’apex liquide, contenant 0,1 pour cent de mélange de conservation des plantes.

Après avoir calibré le système, ouvrez le logiciel d’acquisition et passez d’abord à la fenêtre de paramètres de contrôle. Il a fixé la constante printanière à la constante de printemps fabriquée du porte-à-faux ou à la constante printanière déterminée. Ensuite, réglez le rayon de pointe à quatre cents nanomètres, le rapport poisson échantillon à 0,5, la ligne d’échantillon à cent vingt-huit pour assurer une acquisition rapide, le taux de balayage à 0,2 hertz et la taille de l’échantillon à un micron.

Ensuite, allez à la fenêtre de la rampe et réglez la taille de la rampe à cinq microns, le seuil trig au maximum, et le nombre d’échantillons à quatre mille six cent huit. Avec tous les paramètres définis, approchez soigneusement l’échantillon manuellement. Lorsque la sonde est relativement proche de la surface de l’échantillon, cliquez sur l’approche.

Au contact, augmentez graduellement la taille de l’analyse et modifiez le taux d’analyse, jusqu’à ce qu’un équilibre désiré soit atteint sans endommager l’échantillon ou la pointe. Déplacez l’analyse si la région de mesure n’est pas comme vous le souhaitez. Lorsque vous êtes satisfait, cliquez sur le bouton, pointez et tirez, pour lancer la fenêtre point et shoot.

Spécifiez un répertoire d’enregistrer et un nom de fichier. Cliquez ensuite sur la rampe d’accès à l’analyse suivante pour lancer l’enregistrement. Lorsque l’analyse est terminée, l’interface logicielle redirige vers la fenêtre de la rampe.

Cliquez sur l’image numérisée pour spécifier les positions à identifier. Choisissez au moins trois sites d’indentation par cellule près de son centre de baies, réglez-le pour répéter l’indentation trois fois de chaque côté, puis cliquez sur rampe et capture. Dans le logiciel d’analyse, ouvrez le fichier MCA point, cela montre la position de chaque courbe de force sur l’image numérisée.

Ensuite, ouvrez une courbe de force à analyser. Cliquez sur le bouton de correction de la ligne de base et faites glisser les lignes de tiret bleues sur la courbe de force, jusqu’à ce que prolonger le démarrage de la ligne de base source et étendre l’arrêt de la ligne de base source, ou à 0 pour cent et 80 pour cent respectivement. Cliquez ensuite sur exécuter.

Cliquez ensuite sur le bouton filtre de la voiture boîte, et cliquez sur exécuter pour lisser la courbe de force. Cliquez ensuite sur le bouton indentation. Dans la fenêtre d’entrée, réglez la courbe active à étendre, la cinquième méthode au modèle linéarisé, la limite d’ajustement de force maximale à 99 pour cent, la limite d’ajustement de force min à 75 pour cent, et le modèle d’ajustement à la rigidité.

Analyser les courbes de force dans un lot. Pour ce faire, cliquez sur le bouton historique d’exécuter, spécifiez l’annuaire des rapports et ajoutez d’autres courbes de force qui nécessitent le même traitement. Une fois terminé, cliquez sur exécuter.

Lorsque la valeur de K est montée par lots, cliquez sur l’historique et passez à cinq indentations pour revenir à la fenêtre d’indentation. Une fois sur place, changer la limite d’ajustement de force maximale à dix pour cent et min force ajustement limite à un pour cent. Ensuite, réglez le modèle d’ajustement à Hertzian.

Ensuite, ouvrez le fichier approprié pour afficher les différents canaux numérisés. Dans la fenêtre du canal élevé, cliquez sur le bouton section. Cela permettra de mesurer la courbure de surface de l’échantillon qui est nécessaire pour la déduction de pression turgor.

Puis tracez une ligne à travers le long axe d’une cellule, déplacez les limites de la ligne de tiret vers les bords de la cellule et enregistrez la valeur du rayon. Enfin suivre dans le protocole de texte, pour calculer le modulus du jeune moyen, constante de ressort, E, K, et la pression turgor pour chaque cellule. L’image de gauche est une carte du module du jeune, obtenue en analysant l’ensemble de l’indentation jusqu’au point défini par l’utilisateur tandis que l’image de droite, montre le résultat de l’analyse des cent premiers nanomètres d’indentation.

Ici, les deux cartes semblent très similaires cependant, la variation de la profondeur d’indentation peut conduire dans certains cas à mieux mettre en évidence les hétérogénéités de l’échantillon, ce qui peut être utile pour identifier l’emplacement ou pour fournir des informations sur le comportement des structures internes. Pour chaque point sur ces cartes, il y a une courbe de force sous-jacente. La courbe montrée ici, a deux effets qui méritent d’être mentionnés.

Tout d’abord, si la partie d’approche de la courbe de force se termine à cinq cents nano newtons. Le mouvement de pointe vers le bas continue. Ce qui signifie que la force finale appliquée par la pointe est plus élevée que prévu.

La deuxième chose à remarquer, c’est la vague sur la courbe de rétractation mis en évidence par l’ellipse. Un tel ondulation peut être un indicateur de déplacement ou de vibration de l’échantillon sous l’action de la pointe et le passage à une méthode de fixation différente peut être nécessaire. En utilisant la procédure documentée dans cet article, tous les paramètres clés pour une déduction de pression turgor, sauf pour l’épaisseur de la paroi cellulaire peuvent être récupérés à partir de scans AFM et indentations.

La courbe de force de l’indentation profonde à la position de croix rouge décrit le module du jeune mur cellulaire et la rigidité apparente de l’échantillon à différents régimes de la courbe. La fixation de l’échantillon est cruciale. Pendant le processus de mesure, faites attention aux signes d’instabilité de l’échantillon.

Choisissez soigneusement une région avec une surface plane pour assurer l’indentation perpendiculaire. Suite à cette procédure, on peut surveiller les propriétés mécaniques au fil du temps et les différentes conditions. On peut également superposer des mesures mécaniques avec des images confocales pour des études corrélatives.

Cette technique ouvre la voie à l’établissement de liens entre la biomécanique et le développement physiologique et d’autres processus biologiques.