Micromanipulation de cellules tumorales circulantes pour l’analyse moléculaire en aval et l’évaluation du potentiel métastatique

Ce protocole est particulièrement pertinent car il permet la détection et la sélection de cellules individuelles à partir d’un pool de cellules mixtes pour une analyse ultérieure en aval à une seule résolution cellulaire. Le principal avantage de cette technique est le potentiel de séparer les cellules tumorales circulantes individuelles, ou CTC, des cellules sanguines pour une gamme d’analyses qui nécessitent une grande pureté. Commencez par démarrer le logiciel micromanipulateur et allumer le micromanipulateur.

Connectez le micromanipulateur à l’ordinateur et cliquez sur Connect and Initialize Device pour initialiser le bras robotique au stade du microscope. Nettoyez les surfaces externes et internes de l’armoire de protection avec de l’éthanol et fermez l’armoire de protection après chaque manipulation de la machine pour être en mesure de manœuvrer l’appareil à travers l’ordinateur. Installez un nouveau capillaire en verre de 20 à 30 micromètres sur le bras robotique et l’huile du système de chasse d’eau à travers le système pour éliminer les bulles dans le tube.

Remplissez le réservoir de stérilisation un avec 70% d’éthanol, le réservoir de stérilisation deux avec de l’eau stérile sans nucléase, et le réservoir tampon avec le PBS stérile de Dulbecco. Stériliser le capillaire deux fois avec 70% d’éthanol et remplacer le réservoir de stérilisation un par le réservoir de stérilisation deux pour utiliser la fonction de stérilisation pour laver le capillaire dans l’eau au moins trois fois. Dans le logiciel de micromanipulateur, démarrez une nouvelle expérience et sélectionnez le type d’expérience de sélection à partir des modes de sélection automatique et manuel.

Configurer le plateau de pont pour spécifier les positions du réservoir de stérilisation, du réservoir tampon et du plateau de dépôt, et régler la température des réservoirs liquides dans le bac de dépôt sélectionné à quatre degrés Celsius. Placez une plaque de fixation ultra-basse contenant la solution CTC libérée sous le microscope à l’intérieur de l’armoire du micromanipulateur. Retirer le couvercle de la plaque et fermer l’armoire.

Centrifugeuse une plaque de 384 puits contenant 20 microlitres de milieu de culture de la CCT par puits afin de s’assurer que le milieu est séquestré au fond de chaque puits et de placer la plaque dans la position cible d’une position du plateau de dépôt sélectionné à quatre degrés Celsius. Sélectionnez manuellement l’objectif microscope pour la cueillette et le temps d’exposition de tous les canaux nécessaires. Sélectionnez Show Well Navigator pour visualiser et sélectionner le type de plaque de ramassage.

Calibrez ensuite une position de ramassage au milieu du puits contenant la solution CTC sans cellules au centre du champ de vision. Utilisez le capteur pour toucher doucement le fond de la plaque avec un capillaire et réglez la position de ramassage à 0,05 millimètre au-dessus du bas de la plaque. Abaissez soigneusement le bras robotique de 10 micromètres à la fois pour éviter d’endommager le capillaire.

Sélectionnez le type de cellule et les paramètres de sélection. Pour la cueillette d’une seule cellule, sélectionnez le mode manuel. Utilisez le joystick pour naviguer dans le capillaire de verre à l’intérieur du puits et placez le capillaire sur une seule cellule d’intérêt à au moins un millimètre de la bordure du puits.

Ajoutez ensuite manuellement des particules et sélectionnez Pick Activated Particles pour commencer la cueillette. Lorsque toutes les cellules ont été cueillies, centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules au fond de chaque puits. La coloration bio-aminé avec l’anticorps de molécule d’adhérence de cellules anti-épithéliales permet la visualisation des cellules cancéreuses dans la suspension avec une distinction précise des événements positifs de CD45.

L’isolement précis de la CCT se caractérise par l’aspiration de la cible désirée sans les cellules contaminantes environnantes. Comme on le soupçonne, les grappes de la CCT démontrent une survie plus importante que les CTC simples, ce qui donne lieu à des colonies cellulaires dans les 56 jours suivant la culture in vitro. Notamment, les grappes de la CCT présentent également un taux de prolifération plus élevé et atteignent ainsi des nombres de cellules finales plus élevés, ce qui indique que le contact direct avec d’autres cellules tumorales a un impact à la fois sur la viabilité des cellules tumorales et le taux de prolifération.

Le séquençage à cellules individuelles des CTC directement isolés des patientes atteintes d’un cancer du sein révèle un voisin stochastique distribué en T intégrant des cellules individuelles dérivées de ctcs simples, de grappes de CCT ou de grappes de globules blancs de la CCT. N’oubliez pas d’installer le capillaire en verre pour enlever les bulles d’air dans le système fluidique du micromanipulateur et pour calibrer la position de ramassage afin d’assurer une cueillette efficace à une seule cellule. Les cellules individuelles peuvent être ensemencées ou traitées pour le séquençage de prochaine génération afin de permettre l’analyse ex vivo et la caractérisation de la CCT à une résolution à cellule unique pour étudier le processus métastatique.