Génération de cellules souches neurales induites à partir de cellules mononucléaires périphériques et différenciation vers les précurseurs du neurone dopaminergique pour les études de transplantation

Ce protocole décrit une méthode pour reprogrammer le sang et les cellules mononucléaires aux cellules souches neurales qui peuvent être utilisées pour traiter les maladies neurodégénératives, telles que la maladie de Parkinson. Il offre une source cellulaire autologue pour traiter les maladies neurodégénératives. En outre, le délai requis pour la conversion en cellules souches neurales induites et la différenciation aux types de cellules désirées est plus court que pour les cellules souches pluripotentes induites.

Les cellules souches neurales induites possèdent une bonne capacité proliférative et peuvent être augmentées avant l’application. Étant donné que les INSC peuvent être spécifiés dans différentes cellules neurales spécifiques à chaque région, telles que les neurones de la moelle épinière ou les motoneurones, cette méthode peut être étendue pour le traitement d’autres maladies neurologiques. L’ensemble de la procédure prend beaucoup de temps, avec toutes les étapes liées et critiques, de sorte que la démonstration visuelle donne une idée de la façon dont les cellules ressemblent et fournit quelques conseils pour assurer une génération réussie des cellules désirées.

Pour commencer, transférez le sang veineux périphérique précédemment isolé dans un tube conique de 50 millilitres, et diluez-le avec un volume égal de PBS stérile de Dulbecco. Dans un autre tube conique de 50 millilitres, préparer 15 millilitres de gradient de densité stérilisé moyen. Inclinez le tube à un angle de 45 degrés et fléchez lentement et soigneusement 30 millilitres de sang périphérique dilué sur le milieu de gradient de densité.

Centrifuger le tube à 800 fois g pendant 15 minutes à température ambiante avec le frein centrifugeuse réglé à la position hors tension. Aspirez la couche de plasma jaune supérieure et jetez-la. Utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer la couche de film mince blanche et trouble contenant des cellules mononucléaires dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.

Ajouter 30 millilitres de D-PBS au tube avec des MNC, et centrifugeuse à 600 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le supernatant, ajouter 45 millilitres de D-PBS et résuspendre les cellules. Après avoir centrifugé le tube à 400 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le supernatant.

Resuspendez les cellules avec cinq millilitres de D-PBS, comptez les cellules vivantes avec la méthode d’exclusion bleue trypan, mettez de côté les MNC nécessaires à l’expansion, et congelez les cellules restantes pour une utilisation future. Le jour moins 14, les MNC de graine à une densité de deux à trois millions de cellules par millilitre par puits de plaque de six puits avec 1.5 millilitres de 37 degrés Celsius, milieu préchauffé de MNC. Incuber à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant deux jours.

Le jour moins 11, utilisez une pipette stérilisée pour recueillir les cellules avec le milieu et transférer dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifugeuse à 250 fois g pendant cinq minutes à température ambiante, jeter le supernatant, et resuspendre les cellules dans un millilitre de milieu MNC préchauffé. Après avoir compté les cellules viables avec le bleu trypan, ensemencer les MNC à une densité d’un million de cellules par millilitre dans le milieu MNC préchauffé dans une plaque de six puits.

Incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone pendant trois jours et répéter la collecte, le centrifugage et le placage des cellules dans le milieu du MNC les jours moins huit et moins quatre. Sendai virus dans cette procédure est dangereux, et toutes les procédures impliquant le virus Sendai doit être effectuée dans un cabinet de sécurité. Et tous les conseils et tubes exposés au virus Sendai doivent être traités avec de l’éthanol ou de l’eau de Javel avant l’élimination.

Le jour zéro, recueillir les cellules dans le milieu MNC et transférer à un tube conique de 15 millilitres. Après avoir centrifugé les cellules à 200 fois g pendant cinq minutes, aspirer le supernatant et résusquer les cellules avec un millilitre de milieu MNC préchauffé. Comptez les cellules viables avec du bleu trypan, puis résuspendez-les avec un milieu MNC préchauffé à une concentration de 200 000 cellules par puits dans des plaques de 24 puits.

Décongeler les tubes retirés du stockage de moins 80 degrés Celsius contenant le virus Sendai dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant cinq à dix secondes, puis les laisser décongeler à température ambiante. Une fois décongelés, placez-les immédiatement sur la glace. Ajouter le virus Sendai décongelé aux puits de la plaque de 24 puits avec des MNCs à une multiplicité d’infection de 10.

Pour faciliter l’attachement des cellules, centrifuger les plaques à 1000 fois g pendant 30 minutes et après ça placer les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone. Le premier jour, transférer les cellules avec le milieu à un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Pour détacher davantage les cellules restantes, rincez les puits avec un millilitre de MNC moyen par puits et ajoutez les cellules à moyen au tube.

Après avoir centrifugé la suspension cellulaire à 200 fois g pendant cinq minutes, aspirer le supernatant, resuspendre les cellules avec 500 microlitres de mnc frais préchauffé moyen, et ajouter à un puits d’une plaque de 24 puits. Le deuxième jour, utilisez un millilitre par puits de 50 microgrammes dilués par microlitre poly-D-lysine dans D-PBS pour enrober les plaques de six puits pendant au moins deux heures à température ambiante. Aspirer la poly-d-lysine des plaques de six puits et sécher sur le banc vertical propre pendant environ 10 minutes.

Ajouter ensuite un millilitre par puits d’un microgramme précédemment dilué de cinq microgrammes par laminine millilitre aux plaques de six puits, et incuber pendant quatre à six heures à 37 degrés Celsius pour enrober. Laver les assiettes avec du D-PBS avant de l’utiliser. Le troisième jour, plaquez tous les MNCs induits par le virus Sendai dans le milieu de cellules souches neurales induites sur les plaques de six puits recouvertes de poly-D-lysine/laminine.

Les jours cinq et sept, ajouter délicatement un millilitre de 37 degrés Celsius, moyen iNSC préchauffé à chaque puits des plaques de six puits. Du jour neuf au jour 28, remplacez le milieu par un iNSC frais préchauffé par jour. Surveiller l’émergence des colonies de l’iNSC et, dans environ deux à trois semaines, cueillir les colonies avec une morphologie appropriée à l’aide de pipettes en verre brûlé et transférer chaque colonie dans un puits distinct d’une plaque de six puits pour expansion.

Pour établir unilatérale 6-hyroxydopamine-lesioned modèles de souris, raser la tête d’une souris anesthésié, adulte, mâle, SCID-beige, et appliquer l’onguent d’oeil d’érythromycine. Placez la souris sur l’appareil stéréotaxique et fixez la souris avec des barres incisives. Insérez correctement les oreillettes pour positionner correctement et correctement la tête de la souris.

Stériliser la tête avec de l’iode povidone et de l’alcool isopropylique, puis utiliser une lame de scalpel pour faire une incision sagittale d’environ 1,5 centimètre sur la peau de la tête, exposant le crâne. Ajustez la barre incisive et les barres d’oreille pour réduire la différence de hauteur entre bregma et lambda à moins de 0,1 millimètre. Déplacez-vous lentement et abaissez la pointe de l’aiguille de la microsyringe vers bregma, et traitez le bregma comme le point zéro.

Déplacez la pointe vers une position avec des coordonnées antérieures de 0,5 millimètres et latérales de 2,1 millimètres par rapport au bregma. Rétractez la pointe, marquez le point avec un stylo marqueur, et, avec une perceuse électronique, bavure un petit trou dans le crâne. Extraire deux microlitres de cinq microgrammes par millilitre solution 6-hyroxydopamine dans la microsyringe.

Remettre l’aiguille au point marqué et insérer l’aiguille à 3,2 millimètres dorsal/ventral. Injecter la solution 6 hyroxydopamine de la seringue à raison d’un microlitre par minute, laisser l’aiguille d’injection en place pendant encore cinq minutes, puis la rétracter lentement. Après avoir fermé l’incision avec des sutures, appliquer l’onguent d’oeil d’érythromycine sur les yeux encore.

Retirez la souris de l’appareil stéréotaxique, mettez-la dans la cage de récupération et laissez accès à la nourriture et à l’eau jusqu’à ce qu’elle reprenne conscience. Après que les PBMNCs aient été infectés par sev, leur morphologie changeait et les cellules ont subi une mort radicale jusqu’au cinquième jour. Les colonies de l’INSC ont émergé le jour 12.

Après avoir choisi et transféré des clones iNSC pour l’expansion pour un certain nombre de passages, ils ont montré une bonne morphologie et pourraient se renouveler de façon durable dans le milieu iNSC, soit sous une forme monocouche ou comme sphères. Après 24 jours de différenciation, les iNSC ont été identifiés comme neurones dopaminergiques comme une majorité d’entre eux ont exprimé l’hydroxylase de tyrosine, la boîte de fourche A2, et les marqueurs bêta-tubulin de classe III neurone-spécifiques. Après l’établissement des modèles unilatéraux de souris de la maladie de Parkinson 6-hyroxydopamine-lesioned, l’évaluation comportementale a été conduite pour estimer les symptômes de la maladie de Parkinson.

Les souris qui avaient reçu la transplantation cellulaire ont montré l’amélioration significative de la fonction motrice. L’ampleur de la lésion 6-hyroxydopamine-induite a été vérifiée par la coloration immunofluorescente post-mortem pour TH au striatum, au faisceau médial de forebrain, et au compacta de nigra de substantia. Les signaux TH-positifs ont été considérablement récupérés dans le striatum où des cellules ont été implantées et également légèrement récupérées au SN. Trois mois après transplantation, parmi les cellules survivantes, environ 13,84% étaient des neurones dopaminergiques TH-positifs.

Environ 91,72 % des cellules séropositives ont exprimé des récepteurs nucléaires orphelins, environ 86,76 % ont exprimé foxa2 et environ 98,77 % ont été co-étiquetées avec du potassium rectifier vers l’intérieur couplé aux protéines G. Lors de la pose de 30 mils de sang périphérique dilué sur le milieu de gradient de densité, s’il vous plaît le faire lentement et soigneusement, de ne pas perturber l’interface de gradient. Il faut veiller à éviter le dégel et le gel répétés du virus Sendai afin d’assurer une forte activité virale.

Lors de la reprogrammation des cellules mononucléaires sanguines périphériques en cellules souches neurales induites, veuillez observer de près la morphologie des cellules tous les jours. En outre, 6-hydroxydopamine est sensible à la lumière et à la température. Veillez à protéger la solution de la lumière et gardez-la sur la glace avant utilisation.

Après cette procédure, on peut continuer à étudier les mécanismes de la maladie en utilisant des neurones dopaminergiques d’origine familiale de la MP en culture. On peut également continuer à étudier comment les cellules transplantées influencent les circuits neuronaux endommagés.