Enregistrement optique à grand champ à un seul photon dans des tranches de cerveau à l'aide de teinture sensible à la tension
20 juin 2019
Nous introduisons une méthode d'enregistrement optique reproductible et stable pour les tranches de cerveau à l'aide de colorant sensible à la tension. L'article décrit la coloration de colorant tension-sensible et l'enregistrement des signaux optiques utilisant les préparations conventionnelles de tranche hippocampal.
La méthode d’enregistrement optique avec colorant sensible à la tension est considérée comme une technologie idéale pour visualiser le fonctionnement du cerveau. Cette méthode nous a permis d’enregistrer une dynamique neuropsychique de façon stably et fiable sur 12 heures, nous a donné un point de vue sur l’activité psychique. Nous essayons d’élargir l’application pour détecter les changements de circuit causés par les produits chimiques à toutes les étapes du développement, comme l’application d’acide précieux aux mères.
La technique est déjà bien établie. S’il vous plaît essayer de reproduire les études en suivant la méthode présentée ici. Pour commencer cette procédure, immerger la tête décapitée dans l’ACSF glacé dans un plateau chirurgical en acier inoxydable.
Extraire le cerveau en une minute et le placer dans un bécher contenant de l’ACSF réfrigéré pendant cinq minutes. Ensuite, divisez la section du cerveau à la ligne médiane avec un scalpel et placez les deux hémisphères sur un bloc d’agar de 4%. Ensuite, placez le bloc cérébral avec les deux hémisphères sur un bloc d’agar de 4%.
Essuyer l’excès d’ACSF du bloc à l’aide d’un papier filtre. Par la suite, appliquez de la superglue sur la plate-forme vibratoire. Placez le bloc d’agar dessus et essuyez l’adhésif excessif avec un papier filtre.
Appliquez doucement une petite quantité d’ACSF glacé à partir du haut du bloc d’agar du cerveau pour aider à solidifier l’excès de superglue et pour empêcher la colle de couvrir le cerveau et de perturber le tranchage. Par la suite, fixez la plate-forme au plateau vibratoire et versez l’ACSF modifié. Réglez le vibratome à une vitesse lente et avoir la fréquence de la lame à son réglage maximum.
Ensuite, commencez à trancher. Placez les tranches dans le coin de la chambre de tranche dans l’ordre de sorte que l’ordre des tranches puisse être facilement distingué. Habituellement, trois à cinq tranches peuvent être obtenues à partir d’un hémisphère.
Ensuite, coupez la partie du tronc cérébral à l’aide d’une aiguille de calibre 30. À l’aide d’un petit pinceau à pointes, placez la tranche sur le filtre membranaire retenu avec un anneau en plexiglas. Placez l’anneau dans une chambre de récupération humide et fixez le couvercle pour maintenir la pression intérieure élevée.
Lorsque vous placez la tranche sur le filtre membranaire, ajustez la direction et la position de la tranche à l’intérieur de l’anneau pour vous assurer qu’elle est bien centrée et qu’elle a une direction uniforme. Laissez le spécimen à 28 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à température ambiante pendant au moins 10 à 30 minutes pour la récupération. Pour tacher les tranches, appliquer délicatement 100 microlitres de la solution de coloration sur chaque tranche et incuber à 20 minutes pour la température ambiante.
Ensuite, préparez 50 à 100 millilitres d’ACSF dans un récipient. Placez l’anneau avec le spécimen dedans pour rincer la solution de coloration. Ensuite, transférez les tranches rincées dans une autre chambre d’incubation.
Attendez plus d’une heure pour récupérer avant l’expérience. Pour commencer cette procédure, allumez l’amplificateur, l’ordinateur et le système de caméra et ouvrez le logiciel. Verser l’ACSF dans un tube de 50 millilitres et le bouillonner de carbogen.
Utilisez une pompe périssaltique pour faire circuler l’ACSF et ajuster le débit à environ un millilitre par minute. Ensuite, ajustez la hauteur de la pipette d’aspiration de sorte que le niveau liquide à l’intérieur de la chambre d’expérience est toujours constant. Placez l’électrode au sol dans la chambre.
Par la suite, remplissez l’électrode de verre avec une petite quantité d’ACSF et placez-la dans le support d’électrode. Attachez le support à la tige du manipulateur. À l’aide d’un amplificateur, assurez-vous que la résistance aux électrodes est d’environ un mégaohm.
Dans la session d’enregistrement, transférer une tranche de la chambre humide à une chambre expérimentale. Appuyez fermement sur le bord de l’anneau dans l’anneau en silicone. Veillez à ne pas briser la membrane ou le fond de la chambre d’expérimentation.
Sous le microscope placer la pointe de l’électrode stimulante et l’électrode d’enregistrement potentiel sur le terrain sur la tranche. Vérifiez la réponse évoquée en fournissant un stimulus. Confirmez que le champ de vision couvre le circuit neuronal droit dans le système d’enregistrement optique.
Ensuite, ajustez l’intensité lumineuse d’excitation à environ 70 à 80% de la capacité maximale de la caméra. À l’aide de la source de lumière fluorescente, réglez la mise au point avec le système d’acquisition. Ensuite, démarrez l’enregistrement et analysez les données dans un logiciel d’acquisition d’images après l’acquisition.
Ce chiffre montre le signal optique représentatif lors de la stimulation électrique du collaterol schaffer dans la zone CA1 d’une tranche hippocampale de souris. Ces images consécutives montrent le signal optique avant que des filtres spacial et temporels aient été appliqués tandis que ces images montrent les mêmes données après application d’un filtre cube cinq par cinq par cinq deux fois. En raison de la vitesse d’image élevée et de la haute résolution spatiale, l’application du filtre n’a pas changé le signal, mais filtré le bruit qui peut également être observé dans le cours du temps enregistré en pixels dans un seul essai.
Voici la comparaison des réponses typiques dans la zone CA1 des tranches hippocampiques entre la souris et le rat. La petite réponse hyperpolarisante est observée dans le côté distal du CA1 après 24 millisecondes dans la tranche hippocampal de souris, mais la réponse hyperpolarisante plus massive a dépassé la réponse dépolarisante dans la tranche hippocampal de rat. Une fois que les tranches sont tachées, elles devraient durer plus de 12 heures et vous pouvez effectuer d’autres enregistrements électrophysiologiques sur eux.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode d'enregistrement optique stable utilisant un colorant sensible au voltage pour des tranches de cerveau, en se concentrant sur la signalisation des neurones hippocampiques. La technique offre une vision fiable des dynamiques neurophysiologiques sur des périodes prolongées, facilitant l'étude des modifications des circuits induites par des applications chimiques.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Électrophysiologie
- Imagerie optique
Contexte
- Le colorant sensible à la tension est essentiel pour visualiser les activités cérébrales.
- Les préparations conventionnelles de tranches d'hippocampe servent de modèle biologique.
- L'étude explore les dynamiques neuropsychiques et les modifications des circuits.
- Les méthodes antérieures manquaient de fiabilité pendant des durées d'enregistrement prolongées.
Objectif de l'étude
- Présenter une méthode reproductible d'enregistrement optique dans des tranches cérébrales.
- Fournir des informations sur les effets des produits chimiques sur la dynamique des circuits cérébraux.
- Permettre une observation à long terme de l'activité neuronale et des réponses.
Méthodes utilisées
- La plateforme utilisée est constituée de tranches cérébrales ex vivo préparées à partir de l'hippocampe de souris.
- Le modèle clé comprend des tranches hippocampiques, facilitant les études sur l'activité électrique.
- Aucun flux de travail multiomique n'est mentionné ; l'accent est mis sur les techniques optiques et électrophysiologiques.
- La préparation implique des étapes minutieuses telles que le refroidissement, la coloration et l'incubation des tranches.
- Les séances d'enregistrement sont réalisées dans une chambre expérimentale aux exigences précises de configuration.
Résultats principaux
- La méthode optique permet une collecte de données fiable sur une période de 12 heures.
- La comparaison des réponses entre tranches hippocampiques de souris et de rat révèle des profils neurophysiologiques distincts.
- Les changements électrophysiologiques, tels que les réponses hyperpolarisantes, sont confirmés par les enregistrements optiques.
- La technique améliore notre compréhension de la dynamique des circuits neuronaux dans diverses conditions.
Conclusions
- Cette méthode constitue une avancée importante pour l'étude des circuits cérébraux et des phénomènes neuropsychiques.
- Elle permet aux chercheurs d'observer en temps réel les changements dans la signalisation neuronale.
- La compréhension de ces mécanismes pourrait fournir des informations sur la plasticité et des applications thérapeutiques potentielles.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
L'imagerie optique à grande surface par colorant sensible à la tension utilisant un seul photon permet une évaluation fonctionnelle stable et à long terme des circuits neuronaux dans des tranches de cerveau, répondant ainsi à un défi majeur dans la validation des cibles en neurosciences. Cette méthode permet une détection mécanistique des risques en fournissant des signaux optiques quantitatifs et à haute résolution de l'activité neuronale sur des périodes prolongées, ce qui est essentiel pour évaluer les effets des composés sur la dynamique des circuits en découverte préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en visualisant en temps réel la dynamique de la signalisation neuronale dans les circuits hippocampiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit des enregistrements stables et reproductibles pendant plus de 12 heures, permettant une évaluation longitudinale de l'engagement de la cible et de la modulation des voies.
- Valeur prédictive : Facilite la détection des modifications des circuits induites par des applications chimiques, contribuant à l'identification précoce des effets de composés neuroactifs.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l'emploi du test : Atteint une fréquence d'images de 10 kHz et une résolution de 100×100 pixels, permettant une analyse temporelle et spatiale à haut débit des réponses neuronales.
- Qualité du signal : Le filtrage après l'enregistrement améliore le rapport signal sur bruit, permettant une détection fiable des modifications sous-seuil des circuits, essentielles à la sensibilité du test.
- Reproductibilité : Des protocoles stables de manipulation et de coloration des tranches minimisent les artefacts mécaniques, assurant une cohérence des données entre réplicats et séances expérimentales.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Permet l'évaluation des altérations des circuits dans les réseaux hippocampiques, une région impliquée dans les troubles cognitifs et neuropsychiatriques.
- Continuité translationnelle : Permet des enregistrements optiques et électrophysiologiques parallèles, renforçant la validation des résultats fonctionnels à travers différentes modalités de mesure.
- Progrès ajusté au risque : Des profils de réponse distincts entre tranches de souris et de rat éclairent la transposition entre espèces et aident à réduire les risques dans le choix des candidats précliniques.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase initiale de découverte en fournissant des lectures fonctionnelles des circuits qui font le lien entre la validation de la cible et l'identification de composés candidats, en particulier pour les composés neuroactifs nécessitant une évaluation phénotypique au niveau des circuits.
- Biologie de la découverte : Soutient le test d'hypothèses sur les dynamiques neuro-psychiques et la clarification des voies grâce à la visualisation directe de signaux optiques induits dans des circuits neuronaux définis.
- Criblage : Fournit des sorties optiques quantitatives et haute résolution adaptées à l'analyse automatisée et à la comparaison des modifications induites par des composés sur l'activité neuronale.
- Analytique : Permet l'application de filtres spatio-temporels afin d'extraire le signal du bruit, facilitant la quantification objective des réponses des circuits et l'évaluation de leur variabilité.
- Recherche translationnelle : Relie les observations de circuits en phase de découverte à la validation préclinique en permettant des enregistrements répétés sur des durées prolongées pour évaluer la stabilité et la reproductibilité des effets des composés.
- Réutilisation en entreprise : La préparation normalisée des tranches et la plateforme d'imagerie favorisent la réutilisation dans plusieurs projets et séries de composés, réduisant ainsi la variabilité méthodologique dans les cascades de criblage en neurosciences.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit des éclairages mécanistiques sur le fonctionnement des circuits neuronaux, réduit l'ambiguïté dans la validation des cibles et renforce la confiance prédictive dans le criblage neuropharmacologique.
- Valeur opérationnelle : Préserve les conditions physiologiques et empêche les mouvements des tranches, assurant une acquisition de données stable et sans artefacts pour un criblage fiable des composés.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'orientation (go/no-go) en permettant la détection précoce d'effets indésirables ou hors cible au niveau du circuit, réduisant ainsi le risque d'échec en phase avancée du développement de médicaments du système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des composés en fonction de leurs profils fonctionnels au niveau du circuit, améliorant ainsi l'efficacité du capital dans les filières précliniques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en électrophysiologie, en imagerie optique et en manipulation de tissus pour assurer la viabilité adéquate des tranches et l'efficacité de la coloration.
- Dépend de systèmes de caméras rapides, de sources de lumière fluorescente et de dispositifs de perfusion capables de maintenir des conditions physiologiques pendant des enregistrements prolongés.
- Exige une standardisation de l'orientation des tranches, de la durée de coloration et des protocoles de récupération entre les équipes afin de minimiser la variabilité de la ligne de base du signal optique et de la réponse.
- L'adaptation à d'autres régions cérébrales ou à d'autres modèles de maladie peut nécessiter une validation de l'efficacité de la coloration et de l'expression du signal spécifique aux circuits.
- Les limitations pratiques incluent la nécessité d'une optimisation minutieuse de l'intensité de la lumière d'excitation pour éviter la phototoxicité tout en maintenant une amplitude de signal suffisante pour la détection.
