Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux

Parmi plusieurs protocoles existants pour la préparation des tissus à la microscopie électronique de transmission, nous avons sélectionné des méthodes qui produisent une préservation structurelle optimale et des micrographes à haute résolution pour effectuer une analyse morphométrique de la distribution des vésicules synaptiques dans les terminaux présynaptiques. Les images à contraste élevé obtenues avec ces méthodes permettent de quantifier des paramètres tels que la distance des vésicules synaptiques par rapport au nombre de vésicules présynaptiques amarrées à la membrane présynaptique et aux distances inter vésicules. Tous ces paramètres sont indicatifs de la fonction synaptique.

Puisque des changements dans l’organisation spatiale des vésicules synaptiques peuvent être associés à la perturbation de la fonction synaptique, ces méthodes ont été employées pour examiner les effets des anesthésiques généraux sur le développement synaptique. Ces méthodes pourraient également être utilisées pour examiner les effets de tout médicament ou traitement sur la morphologie détaillée des synapses afin de donner un aperçu de leur fonction. Commencez par préparer le tétroxide d’osmium pour la post fixation des sections de cerveau de rat précédemment fixées avec le paraformaldéhyde et le glutaraldehyde par perfusion vasculaire.

Les sections deviennent rigides après traitement par tétoxyde d’osmium. Par conséquent, la manipulation des tissus nécessite une attention à partir de là. En outre, avant d’ajouter de l’osmium, assurez-vous que vos sections sont aplaties car n’importe quel pli entraînera probablement une fracture des tissus.

Ouvrez un ampule en verre de cinq millilitres de 4% de tétoxyde d’osmium et d’eau et déposez-le à l’intérieur d’une bouteille en verre brun. Ajouter cinq millilitres de tampon de phosphate molaire de 0,2 molaire, puis ajouter 10 millilitres supplémentaires de tampon de phosphate molaire de 0,1 molar pour atteindre une solution finale de 1%. Utilisez une seringue de 20 millilitres munie d’une longue aiguille pour élaborer le tétoxyde d’osmium de 1 %, puis ajoutez le tétoxyde d’osmium à un bocal en verre brun recouvert de papier d’aluminium.

Après s’être assuré que le spécimen a été déplié et aplati, ajouter 1% de tétoxyde d’osmium et 0,1 PB molaire au flacon de spécimen. Incuber le spécimen dans du tétoxyde d’osmium pendant une heure à température ambiante. Extraire le tétoxyde d’osmium avec un micropipet après l’incubation est terminé et rincer les sections telles que décrites dans le protocole.

Pour préparer l’acétate d’uranyl, placez un flacon de verre volumétrique de 200 millilitres contenant 100 millilitres de 70% d’éthanol sur une plaque d’agitation. Ajouter quatre grammes d’acétate d’uranyle au flacon, envelopper une feuille d’aluminium pour éviter les précipitations par la lumière et remuer continuellement. Déshydrater les sections à 50 % d’éthanol.

Tache avec l’acétate 4% uranyl préparé pendant une heure et suivre avec déshydratation en série et rinçage tel que décrit dans le manuscrit. Retirez le piston de seringue d’une seringue de gavage de 60 millilitres et capuchonez-le à l’aide d’une aiguille de sécurité. Placez la seringue avec le côté ouvert vers le haut et ajoutez chaque ingrédient du mélange de résine un par un.

Terminer en ajoutant 525 microlitres de DMP30 à l’aide d’un pipet. Déplacer le piston de la pipet très lentement que DMP est très visqueux. Remets le piston dans la seringue.

Inverser la seringue à quelques reprises pour mélanger le contenu. La couleur va passer du jaune à l’ambre. Évacuer l’air à l’intérieur de la seringue.

Ensuite, placez-le sur un rocker avec des secousses continues pendant au moins 30 minutes. Ajouter un volume de résine époxy et un volume d’acétone à un flacon de scintillation et secouer pour mélanger. Appliquez celui-ci sur une résine sur le mélange d’acétone sur la section tissulaire après le dernier rinçage à l’acétone en gardant couvert pour éviter l’évaporation de l’acétone.

Retirer le mélange un à un de résine et d’acétone après deux à quatre heures et le remplacer par de la résine complète et incuber pendant quatre heures. Mettez tous les déchets de résine dans un récipient de collecte sous le capot pour polymériser et être éliminés plus tard. Couper deux morceaux rectangulaires de film en polychlorotrifluoroéthylène clair et les essuyer avec 70% d’éthanol.

Coupez-les de sorte qu’il y ait au moins 1,5 centimètre de plastique sans tissu de chaque côté de la section, en s’assurant qu’ils ont la même largeur, mais la hauteur de la feuille sur le dessus est d’environ 2/3 de la feuille inférieure. Inclinez lentement le flacon et utilisez un pinceau à chameau fin et une micro-spatule flexible pour soulever très doucement le spécimen du fond. Déplacez ensuite soigneusement la section le long des parois du flacon et transférez-la sur la feuille pctfe inférieure.

Retirer l’excès de résine à l’aide d’une micro-spatule et couvrir délicatement le spécimen de la feuille supérieure. Poussez doucement les bulles d’air emprisonnées sans appliquer de pression directe sur la section tissulaire et éliminez l’excès de résine. Utilisez un stylo résistant aux solvants pour étiqueter les feuilles et les placer au four à 60 degrés Celsius pendant deux à trois jours pour polymériser.

Retirez délicatement les feuilles de PCTFE en sandwich pour les ouvrir. Utilisez un stylo résistant aux solvants pour marquer le côté de la feuille qui contient la section d’adhérence qui le marque près du tissu. Utilisez un poinçon de disque pour obtenir un échantillon circulaire de la section en vous assurant que la marque de stylo fait partie du tissu perforé.

La marque de stylo brillera lorsque la lumière brillera sur le spécimen. Placez le capuchon d’une capsule d’intégration côté vers le haut sur un support de capsule. Placez une goutte de résine sur le bouchon et insérez le disque perforé à l’intérieur du bouchon avec la section tissulaire orientée vers le haut.

Insérez une capsule dans le bouchon à l’aide d’un léger mouvement de tire-bouchon. Utilisez de fines pinces à épiler pour rouler et abaisser une étiquette imprimée de deux centimètres de long dans la capsule, en vous assurant qu’elle s’adapte à la courbure des parois latérales de la capsule. Verser la résine d’intégration à l’intérieur de la capsule, remplir jusqu’au bord de la capsule et utiliser un bâton en bois pointu pour pousser le spécimen de tissu vers le bas.

Placer la capsule au four à 60 degrés Celsius pendant deux à trois jours pour la polymérisation. Et puis continuer avec la section et la coloration comme décrit dans le protocole. Le micrographe électronique de la conservation satisfaisante de la structure neuronale de cellules montre des membranes cellulaires superposées sans ruptures.

Le cytoplasme est finalement granulaire et sans espaces vides. Les mitochondries ne sont ni gonflées ni rétrécies avec une double membrane externe conservée et une cristae interne intacte. La préservation optimale de l’ultrastructure neuronale et des détails morphologiques fins est essentielle pour visualiser les vésicules synaptiques et mesurer leur distance par rapport à la membrane présynaptique.

Les vésicules synaptiques doivent être distinctes et doublées d’une membrane unique ininterrompue. Afin de faciliter l’analyse morphométrique de la distribution synaptique de vésicule, les membranes présynaptiques et postsynaptiques devraient être parallèles dans leur continuité préservée. Le micrographe électronique de la conservation défectueuse de la structure tissulaire montre la distorsion et la rupture des membranes cellulaires neuronales et la présence d’espaces extracellulaires nettement agrandis.

Les mitochondries semblent distendues et ont sillonné gonflé. Dans un autre exemple de conservation défectueuse de structure de tissu, il y avait de grands espaces vides blancs dans le cytoplasme à la place de la substance cytoplasmique finement granulaire avec les espaces extracellulaires agrandis. Une membrane artificielle comme forall a probablement résulté de la mobilisation des lipides pendant la fixation avec le glutaraldehyde.

Lorsque vous travaillez jeune tissu cérébral utiliser 1 tampon de phosphate molaire comme un solvant pour toutes vos solutions afin que vous gardez la tonicité aussi proche que possible de celle du cerveau de rat nouveau-né et de minimiser le rétrécissement des tissus artefactual et ou l’enflure. Les micrographes obtenus avec ces méthodes peuvent être utilisés pour étudier la morphologie détaillée et les relations structurelles dimensionnelles d’un certain nombre de composants cellulaires autres que les vésicules synaptiques. Par exemple, mitochondries, appareil golgi et chromatine nucléaire.

Plusieurs étapes de ce protocole nécessitent des produits chimiques qui peuvent être toxiques. Travaillez toujours sous un capot de fumée et portez de l’équipement de protection individuelle lorsque vous manipulez des aldéhydes, de l’osmium, de l’uranium et des composés de plomb.