Fluorescence quantitative In Situ Hybridization (FISH) et Immunofluorescence (IF) de produits génétiques spécifiques dans les cellules infectées par le KSHV

Le protocole est utile pour obtenir un aperçu quantitatif de la régulation temporelle des produits génétiques viraux, dans le contexte des cellules hôtes, en particulier en ce qui concerne les virus de l’herpès. Cette technique peut aider à répondre aux questions de recherche liées aux ARN et aux protéines de l’hôte et du virus. En outre, cette technique est compatible avec des analyses biochimiques simultanées.

Pour adhérer aux cellules à huit diapositives de chambre, appliquez 200 microlitres d’une suspension cellulaire inhérente à chaque chambre d’une glissière stérile à huit cellules chambées et laissez la croissance des graines pendant 12-24 heures, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. À la fin de l’incubation, aspirer les cellules supernatantes et non attachées, et fixer immédiatement les cellules avec du formaldéhyde pré-réfrigéré de 4% dans PBS sur la glace, pendant 30 minutes. À la fin de la fixation, laver les cellules avec trois lavages de cinq minutes dans 200 microlitres de 4 degrés Celsius PBS par lavage.

Après le dernier lavage, perméabiliser les cellules fixes avec 200 microlitres de pré-refroidi 0,5%Triton-X en PBS par puits, pendant 10 minutes sur la glace. À la fin de la perméabilisation, retirez soigneusement les chambres sans casser la lame et rincez les cellules avec du PBS pré-refroidi. Bloquer les cellules rincées avec pré-réfrigéré 4%BSA en PBS pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius, suivie de l’incubation avec un anticorps primaire polyclonal approprié d’intérêt dans 0,1%BSA en PBS pendant une heure, à quatre degrés Celsius.

À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois avec du PBS frais et incuber les cellules avec un anticorps secondaire approprié conjugué à un fluorophorique compatible avec l’anticorps de détection FISH pendant une heure, à quatre degrés Celsius. Après trois lavages de PBS comme démontré, fixez les échantillons encore dans le formaldéhyde de 4% dans PBS pendant 10-15 minutes avant une deuxième permeablization comme démontré. Couvrez ensuite la glissière de papier d’aluminium pour préserver le signal fluorescent et empêcher le photobleaching.

Et laver les cellules avec 2x citrate de sodium salin, avant d’appliquer 45 microlitres de solution d’hybridation. Après une heure à 37 degrés Celsius dans une chambre humidifiée, ajouter de l’eau distillée aux oligonucléotides antisens d’intérêt pour porter le volume de dénaturation à 10 microlitres. Dénorez les oligonucléotides à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, avant d’ajouter 35 microlitres de solution d’hybridation fraîche par diapositive.

Puis incuber les échantillons de 10-24 heures dans la chambre humidifiée à 37 degrés Celsius, protégés avec du papier d’aluminium. Le lendemain, lavez les cellules avec deux, 10 minutes. 2X citrate de sodium salin se lave à température ambiante, suivi d’un lavage au citrate de sodium salin 1X pendant 10 minutes, à 25 degrés Celsius.

Après le dernier lavage, fixer les cellules avec du formaldéhyde pré-réfrigéré de 4% dans PBS, pendant 10-15 minutes sur la glace, suivie de trois lavages avec PBS frais. Ensuite, perméabilize les échantillons tels qu’ils ont été démontrés, suivis de l’incubation avec anti-dioxigenin FTC et pré-refroidi 0,1%BSA dans PBS, pendant une heure à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois en PBX frais et fixez les échantillons avec du paraformaldéhyde pré-réfrigéré de 4 % dans le PBS, pendant 10 à 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Après trois lavages en PBS, étiqueter les noyaux avec 0,4 microgramme par millilitre de DAPI et pré-réfrigéré 0,5%Triton-X en PBS pendant 15 minutes sur la glace, suivie de trois lavages finaux en PBS. Montez des glissières avec des perles fluorescentes, comme expérimentalement pertinentes et dans le milieu de montage approprié. Après avoir enlevé l’excès de montage moyen avec des lingettes stériles, sceller un coverslip à chaque diapositive avec plusieurs couches de vernis à ongles clair, et utiliser un microscope fluorescent pour confirmer l’exécution réussie de l’expérience.

Les images peuvent ensuite être prises au microscope confocal pour recueillir des images des échantillons dans l’heure à une semaine qui suit le montage, à un grossissement 630 fois. Ces résultats représentatifs de FISH et d’immunofluorescence sont semiquantitatifs et offrent un aperçu de la localisation des oligonucléotides, plutôt que des comparaisons entre les intensités des différentes taches fluorescentes, parce que ces expériences n’incluaient pas une perle fluorescente dans la préparation de la diapositive. Dans ces expériences, les zones cytoplasmiques et nucléaires et leurs ratios étaient différents pour les cellules infectées par le KSHV latent et lytique.

Comme illustré dans ce chiffre, la zone est contrôlée dans le rapport nucléocytoplasmique. Quand la réplication d’ADN de KSHV est inhibée dans la phase lytique, la protéine lytique tôt de transcription d’oligonucléotide de KSHV se déplace à une localisation principalement cytoplasmique. L’ARN polyadéthylé de KSHV, cependant, localise aux emplacements nucléaires spécifiques en dépit de l’inhibition de la réplication virale d’ADN.

Lorsque vous retirez les chambres des glissières, faites en sorte qu’il y ait très peu de résidus adhésifs sur l’outil et utilisez de l’éthanol pour perméfèrer les cellules et affaiblir l’adhésif. Des essais biochimiques tels que QPCR, western blot, et séquençage à haut débit, peuvent être effectués en tandem pour augmenter les données quantitatives recueillies à partir des micrographes.