Name: Analyse Dépendante de DNAzyme de rRNA 2-O-Methylation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Découvrez une méthode rapide et économique pour analyser la méthylation 2'-O de l'ARN ribosomique de levure Saccharomyces cerevisiae en utilisant des DNAzymes. Ce protocole permet de détecter les événements de méthylation guidés par les snoRNA.

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Nous remercions Maya Wilson et Aneika Leney pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par une bourse Sir Henry Dale financée conjointement par le Wellcome Trust et la Royal Society (200473/Z/16/Z).

1. Strains, Media, et Buffer Recettes
<ol><li>Préparer la levure (S. cerevisiae) médias comme détaillé ici: YP (1% w / v extrait de levure, 2% w / v peptone bactériologique), et le glucose et les stocks de galactose à 20% w / v.</li>
	<li>Préparer le tampon d'acétate de sodium (NaAc)-EDTA (AE) tel que détaillé ici : 50 mM NaAc pH 5,3 et 10 mM EDTA.</li>
	<li>Préparer 10-23 DNAzyme 4x Incubation Buffer comme détaillé ici: 24 mM Tris pH 8.0, 60 mM NaCl et 10-23 DNAzyme 4x Reaction Buffer: 200 mM Tris pH 8.0 et 600 mM NaCl.</li>
	<li>Préparer 8-17 DNAzyme 2x Reaction Buffer tel que détaillé ici: 200 mM KCl, 800 mM NaCl, 100 mM HEPES pH 7,0, 15 mM MgCl2, et 15 mM MnCl2.</li>
	<li>Préparer 10x MOPS Buffer tel que détaillé ici: 200 mM MOPS, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA; pH 7.0 et 1.5x Sample Denaturing Buffer: 50% v/v formamide, 20% v/v formaldehyde, 1.5x MOPS buffer.</li>
	<li>Obtenir des souches S. cerevisiae, BY4741 (MATa his3-1 leu2-0 met150 ura30); GAL1::SNR13 (comme BY4741 mais GAL1::SNR13:KANmX); GAL1::SNR47 (comme BY4741 mais GAL1::SNR47:HIS3mX). Toute autre souche de levure peut être utilisée pour cette analyse.</li>
</ol>2. Conception DNAzyme
<ol><li>Trouvez la séquence d'ARN d'intérêt ou le site de méthylation putative à l'aide d'une base de données appropriée. Pour les cibles S. cerevisiae snoRNA, utilisez la base de données snoRNA de levure : http://people.biochem.umass.edu/fournierlab/snornadb/mastertable.php14
</li>
	<li>Pour trouver le site de méthylation d'intérêt, par exemple, snR13-dépendant site, sélectionnez "snR13" et prendre note de la position du nucléotide modifié (par exemple, snR13-guidé A2281 dans 25S rRNA).</li>
	<li>Trouvez des séquences en amont et en aval du nucléotide modifié à l'aide d'une base de données appropriée. Pour S. cerevisiae, utilisez la base de données du génome de Saccharomyces : https://www.yeastgenome.org/</li>
	<li>Rechercher le nom du gène cible, par exemple, RDN25 (codage 25S rRNA).</li>
	<li>À partir de l'onglet « séquence », sélectionnez 10 à 15 nucléotides en amont (bras 5) et en aval (3 bras) du site de méthylation lors de l'utilisation d'un étoptod 10-23 DNAzyme et de 20 nucléotides en amont (bras 5' et en aval (3'bras) du site de méthylation pour un 8-17 DNAzyme.</li>
	<li>Créez des séquences complémentaires de bras de 5' et 3'.</li>
	<li>Flank 10-23 ou 8-17 Séquence catalytique DNAzyme avec des séquences complémentaires de 5' et 3' bras.</li>
	<li>Commandez DNAzyme comme oligonucléotide normal d'ADN du fournisseur.</li>
</ol>3. Conditions de croissance de S. cerevisiae
REMARQUE: S. cerevisiae BY4741 dérivés de la souche ont été utilisés, dans lequel l'expression de SNR13 ou SNR47 snoRNA est tirée du promoteur inductible GAL1. Afin d'induire ou d'inhiber leur synthèse, les cellules de croissance sur le milieu contenant le galactose(gal1-transcription dépendante de) ou le glucose(GAL1-transcription dépendante hors). Comme contrôle, utilisez la souche de type sauvage (BY4741) cultivée soit sur le galactose ou le glucose.
<ol><li>Cultivez des souches de levure dans un milieu et des conditions appropriés. Pour analyser gal1::SNR13 et GAL1::SNR47 souches ainsi que la souche isogénique de type sauvage, les cellules de croissance dans 50 ml de milieu x yP avec soit 2% de glucose (YPD) ou galactose (YPGal) à 30 oC à la phase médiane moyenne exponentielle.</li>
	<li>Cellules centrifugeuses à 1 000 x g,pendant 3 min à 4 oC.</li>
	<li>Jeter le supernatant et garder les granulés.</li>
	<li>Congelez les granulés de cellules dans de l'azote liquide et entreposez-les à -80 oC. MISE EN GARDE: L'azote liquide peut causer de graves brûlures cryogéniques. Portez toujours des vêtements de protection et faites preuve de sécurité. REMARQUE: Les granulés cellulaires peuvent être stockés à -80 oC jusqu'à 1 mois. Le protocole peut être mis en pause ici si nécessaire.</li>
</ol>4. ISOLATION DE l'ARN15
REMARQUE: Utilisez la méthode la plus appropriée pour isoler l'ARN. Pour la levure S. cerevisiae, extraction d'ARN de phénol à chaud peut être utilisé.
<ol><li>Ajouter 1 ml d'eau glacée, resuspendre les granulés et transférer les cellules en suspension dans des microtubes de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugeuse à 20 000 x g pour 10 s à 4 oC et retirer le supernatant.</li>
	<li>Ajouter 400 l de tampon AE et resuspendre les cellules. REMARQUE: Les étapes 4.4-4.15 sont exécutées à température ambiante sauf indication contraire.</li>
	<li>Ajouter 40 l de 10 % de SDS et 400 l de phénol acide (pH 4,5). MISE EN GARDE: Le phénol est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du phénol. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle.</li>
	<li>Bien mélanger en vortexant pendant 20 s.</li>
	<li>Incuber à 65 oC pendant 10 min. Toutes les 2 minutes, ouvrez doucement et fermez le tube pour relâcher la pression et retournez le tube 2-3 fois pour mélanger les phases.</li>
	<li>Transférer les tubes à -80 oC et couver pendant 10 min.</li>
	<li>Décongeler les tubes sur le banc et la centrifugeuse à 20 000 x g,pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer la phase supérieure dans un nouveau tube contenant 400 l de phénol acide:chloroform:isoamyl alcool (25:24:1). Ne perturbez pas l'interphase. MISE EN GARDE: Le chloroforme est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du chloroforme. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle.</li>
	<li>Bien mélanger en vortexant pendant 30 s et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer la phase supérieure (400 l) dans un nouveau tube contenant 400 l de chloroforme.</li>
	<li>Bien mélanger en vortexant pendant 30 s et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Transférer la phase supérieure (300-350 l) dans un nouveau tube contenant 1 ml d'EtOH et 40 oL d'acétate d'ammonium de 7,5 M (NH4AC). Mélanger en retournant le tube à quelques reprises.</li>
	<li>Incuber à -80 oC pendant 2 h ou toute la nuit à -20 oC. REMARQUE: La procédure peut être interrompue ici.</li>
	<li>Centrifugeuse à 20 000 x g, pendant 10 min à 4 oC. Une petite pastille d'ARN blanche deviendra visible au fond du tube.</li>
	<li>Retirez EtOH par pipetting pour éviter de déranger la pastille.</li>
	<li>Ajouter 1 ml d'EtOH à 70 % et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Retirez 70% EtOH par pipetting.</li>
	<li>Centrifugeuse à 20 000 x g pour 15 s et retirez le reste de l'EtOH avec une pipette de 2 à 20 l.</li>
	<li>Laisser le tube ouvert sur le banc pendant 5 minutes pour sécher le granule d'ARN. REMARQUE: Le granule d'ARN change sa couleur du blanc au transparent une fois sec.</li>
	<li>Resuspendre le granule d'ARN dans 30 OL de H2O sans RNase/DNase, transférer le tube immédiatement sur la glace et mesurer la concentration d'ARN sur microspectrophotomètre.</li>
	<li>Congeler les échantillons à -20 oC. REMARQUE: L'ARN peut être stocké à -20 oC jusqu'à 1 mois et à -80 oC jusqu'à 1 an. La procédure peut être interrompue ici ou procéder directement à l'étape suivante.</li>
</ol>5. Digestion DNAzyme
<ol><li>
10-23 Digestion DNAzyme
	<ol>
<li>Dans des tubes de 1,5 ml, préparez un mélange d'incubation en combinant 5 g d'ARN, 200 pmol de 10 à 23 DNAzymes (2 l de 100 ml de solution de stock) et 2,5 l de tampon d'incubation 4x 10-23 dans un volume total de 10 oL. Gardez les tubes sur la glace.</li>
		<li>Transférer les tubes dans un bloc de chaleur sèche réglé à 95 oC et couver pendant 3 min.</li>
		<li>Transférer les tubes immédiatement sur la glace et couver pendant 5 min.</li>
		<li>Faites tourner brièvement et remettez les tubes sur la glace.</li>
		<li>Ajouter 20 U of RNase inhibitor (p. ex., 0,5 'L RiboLock RNase inhibitor).</li>
		<li>Placer les tubes dans un bloc de chaleur sèche réglé à 25 oC et couver pendant 10 min.</li>
		<li>Pendant ce temps, préparer un mélange de réaction dans un tube de 1,5 l en combinant 5 l de 4x 10-23 Reaction Buffer avec 4 'L de 300 mM MgCl2 et 1 O H2.Placez le tube dans un bloc sec réglé à 37 oC.</li>
		<li>Transférer le mélange d'incubation dans un bloc de chaleur sèche réglé à 37 oC et ajouter 10 l de mélange de réaction préréchauffé.</li>
		<li>Incuber la réaction à 37 oC pendant 1 h.</li>
		<li>Transférer les tubes sur la glace et passer à l'étape 5.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
8-17 Digestion DNAzyme
	<ol>
<li>Préparer un microtube de 1,5 ml avec 5 g d'ARN dans un volume total de 6 L. Maintenir le tube sur la glace.</li>
		<li>Préparer un microtube de 1,5 ml avec 400 pmol de 8-17 DNAzyme (4 L sur 100 mM de stock). Gardez le tube sur la glace.</li>
		<li>Transférer les tubes dans un bloc de chaleur sèche réglé à 95 oC et couver pendant 2 min.</li>
		<li>Déplacer l'échantillon d'ARN sur la glace.</li>
		<li>Faites tourner le tube avec DNAzyme pendant 5 s et incubez à 25 oC pendant 10 min.</li>
		<li>Dans le même temps, préparer un tube de 1,5 ml avec 10 l de 2x 8-17 Reaction Buffer et incuber à 25 oC.</li>
		<li>Préparer un mélange de réaction en ajoutant 10 l de tampon de réaction 2x préréchauffé au tube avec DNAzyme.</li>
		<li>Transférer 14 L du mélange de réaction au tube avec de l'ARN et ajouter 20 U d'inhibiteur de rNase.</li>
		<li>Incuber la réaction à 25 oC pendant 2 h.</li>
		<li>Transférer le tube sur la glace et procéder à la purification de l'ARN (étape 5.3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purification de l'ARN
	<ol>
<li>Ajouter 350 l d'eau et 400 l de chloroforme au tube de réaction, bien mélanger en vortexant pendant 30 s et centrifugeuse à 20 000 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
		<li>Transférer la phase supérieure (300-350 l) dans un nouveau tube contenant 1 ml d'EtOH, 40 oL de 7,5 M NH4AC et 1 l de glycogène (10 g/L). Mélanger en retournant le tube à quelques reprises.</li>
		<li>Incuber à -80 oC pendant 2 h ou toute la nuit à -20 oC. REMARQUE: La procédure peut être interrompue ici.</li>
		<li>Répétez les étapes de 4.15 à 4.21.</li>
		<li>Resuspendre le granule d'ARN dans 10 oL de H2O sans RNase/DNase et transférer les tubes immédiatement sur la glace.</li>
		<li>Congeler les échantillons à -20 oC. REMARQUE: L'ARN peut être stocké à -20 oC jusqu'à un mois et à -80 oC jusqu'à 1 an. La procédure peut être interrompue ici ou procéder à l'électrophoresis d'ARN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Électrophorésis d'ARN
<ol><li>Vaporiser l'équipement d'électrophorèse (réservoir, plateau, peigne) avec 1% SDS, laisser pendant 15 min et rincer avec beaucoup de ddH2O.</li>
	<li>Dissoudre 1,5 g d'agarose dans 127,5 ml de ddH2O en le chauffant au micro-ondes.</li>
	<li>Ajouter 15 ml de MOPS 10x et 7,5 ml de formaldéhyde à 37 % à la solution d'agarose (volume total est de 150 ml). MISE EN GARDE: Le formaldéhyde est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du formaldéhyde. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle.</li>
	<li>Ajoutez une quantité appropriée d'une tache de gel de choix à la solution d'agarose (p. ex., 15 l de tache de gel d'ADN SYBR Safe). Bien mélanger et verser l'agarose sur le plateau.</li>
	<li>Insérez immédiatement un peigne dans le gel.</li>
	<li>Laissez-le 45 min sous le capot de fumée. Couvrir le plateau de papier d'aluminium lorsque vous utilisez une tache de gel sensible à la lumière.</li>
	<li>Préparer 600 ml de tampon MOPS 1x.</li>
	<li>
Préparation de l'échantillon d'ARN
	<ol>
<li>Dans un tube de 1,5 ml, combiner 10 l l de l'échantillon d'ARN digéré et purifié, 5 l de tampon dénaturant d'échantillon et 0,5 l de teinture de chargement 6x. MISE EN GARDE: Le formamide est toxique et doit être manipulé sous une hotte de fumée. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes lorsque vous travaillez avec du formamide. Éliminer les déchets conformément à la réglementation institutionnelle.</li>
		<li>Incuber les échantillons d'ARN à 70 oC pendant 5 min. Transférer les échantillons sur la glace. Incuber 5 min.</li>
		<li>Faites tourner brièvement avant de charger sur le gel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mettre le gel dans le réservoir d'électrophorèse et remplir avec 1x tampon MOPS. Chargez tout le volume de chaque échantillon (15 l) sur le gel. Courir à 80 V jusqu'à ce que le bleu bromophenol atteigne les 2/3 de la longueur du gel.</li>
	<li>Imagez le gel à l'aide d'un imageur approprié pour détecter la tache de gel choisie (p. ex., transilluminator UV).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

La digestion Dépendante du DNAzyme peut être utilisée comme méthode simple et rapide pour analyser l'ARN 2'-O-méthylation12,13. DNAzymes cliver ARN si le nucléotide en amont du site de clivage n'est pas méthylé. Contrairement à d'autres approches, y compris la digestion dirigée par RNase H, la dégradation alcaline ou la transcription inverse dans la faible concentration de nucléotides suivie par le PCR quantitatif ou le séquençage8,10,11 ,16, l'approche DNAzyme nécessite un oligonucléotide d'ADN simple et des réactifs de base qui sont présents dans n'importe quel laboratoire de biologie moléculaire. En outre, DNAzymes peut être utilisé d'une manière similaire pour analyser la pseudouridylation de l'ARN médié par la boîte H/ACA snoRNA12, ce qui en fait des outils polyvalents dans l'étude des cibles snoRNA.
Les approches dépendantes du DNAzyme ne sont limitées que par des séquences de consensus sur le site de clivage17. 10-23 DNAzymes peuvent être utilisés pour analyser 2'-O-méthylation seulement à la position R du dinucleotide RY, tandis que 8-17 DNAzymes reconnaissent la modification du nucléotide situé en amont de la guanine. En conséquence, des modifications telles que 2'-O-méthylation du premier nucléotide dans les dinucléotides guanine-adenine (GA), adénine-adénine (AA), pyrimidine-adénine (YA) et pyrimidine-pyrimidine (YY) ne peuvent pas être analysées. En outre, la faible efficacité du clivage12 dépendant de DNAzyme devrait être considérée. Bien que certains DNAzymes clivent l'ARN presque complètement (Figure 3B), beaucoup de DNAzymes ne digèrent que partiellement leurs cibles (Figure 3B). L'efficacité peut dépendre de la séquence entourant le site de clivage. Par exemple, les régions d'ARN avec des tronçons du même nucléotide peuvent affecter le positionnement correct de la séquence active DNAzyme. En outre, les régions d'ARN formant la structure secondaire forte peuvent ré-hybrider et supprimer la liaison de DNAzyme à la séquence cible. Pour surmonter ces problèmes, des cycles de chauffage et de refroidissement du 10-23 DNAzyme et de son substrat d'ARN peuvent être appliqués18.
Nous avons utilisé l'approche DNAzyme pour étudier 2'-O-méthylation de l'ARNr. On peut également utiliser cette technique pour analyser d'autres modifications de l'ARN, telles que N6-méthyladenosine19. L'ARN ribosomal, en raison de son abondance, peut être analysé par électrophorèse et les produits de clivage peuvent être visualisés sous la lumière UV. Cependant, cela ne s'applique pas aux ARN moins abondants comme les ARN De polymère II (ARNM) et les ARN non codants (NcRNA). Ces ARN ne peuvent généralement pas être détectés directement par l'ARN colorant dans les gels d'agarose ou de polyacrylamide. Dans de tels cas, le clivage dépendant du DNAzyme peut être visualisé par le ballonnement nordique, indirectement détecté par PCR/quantitative PCR ou analysé par PCR quantitatif avec des polymères (par exemple, KlenTaq DNA Polymerase) capable de discriminer l'ARN 2o-O-méthylé de ARN non méthylé20,21.

Les modifications de l'ARN jouent un rôle important dans la régulation de l'expression génique. RNA 2'-O-méthylation et pseudouridylation, qui sont guidés par la boîte C/D et la boîte H/ACA petits ARN nucléolaires (snoARN) respectivement, protègent l'ARN de la dégradation et stabilisent leurs structures d'ordre supérieur1,2,3 . Des cibles de SnoRNA ont été identifiées principalement dans les ARN ribosomal (rRNA) et les petits ARN nucléaires (snRNAs). Cependant, dans les eucaryotes plus élevés, il y a potentiellement des centaines de snoRNA sans fonctions assignées et certains d'entre eux peuvent reconnaître plusieurs ARN1,4,5,6,7. Par conséquent, les méthodes qui permettent l'identification et l'analyse des modifications guidées par l'ARNrs sont des outils importants pour découvrir les mécanismes régissant les processus cellulaires.
Un site de méthylation putative 2'-O-méthylation de boîte C/D snoRNA-guided peut être identifié bioinformatiquement et confirmé expérimentalement par de nombreuses techniques, y compris le clivage dirigé par RNase H, ou des méthodes spécifiques au site et à l'échelle du génome, qui emploient la transcription inversée dans les nucléotides bas (dNTP) approche de concentration8,9,10,11. Ces techniques sont très sensibles mais aussi laborieuses et coûteuses, par conséquent, peuvent ne pas convenir pour les essais initiaux ou rapides. L'une des méthodes les plus simples et peu coûteuses pour identifier les sites de méthylation 2'-O est le clivage à ARN dépendant de dNAzyme12. Les AdnNAzymes sont des molécules d'ADN courtes, à brin unique et catalytiques actives capables de clivage endonucleolytique de l'ARN à des positions spécifiques. Il s'agit d'une séquence de noyau conservée et catalytiquement active et de bras de liaison de 5' et 3' composés de séquences variables conçues pour s'hybrider par Watson-Crick base-appariement à la cible d'ARN (Figure 1). Ainsi, les bras de 5' et 3' livrent la séquence catalytique au site spécifique d'ARN. Le clivage Dépendant de l'ADNestin est inhibé par 2'-O-méthylation du nucléotide placé directement en amont du site de clivage12,13. Cela rend les DNAzymes des outils très pratiques pour l'analyse des sites putatifs ou connus d'ARN 2'-O-méthylation.
Deux types de DNAzymes sont utilisés pour les analyses de modifications d'ARN12. La séquence active de 10-23 DNAzyme (Figure 1A) se compose de 15 nucléotides (5'RGGCTAGCTACAACGA3') qui forment une boucle autour de l'ARN ciblé purine-pyrimidine (RY) dinuccléotide et catalysent le clivage entre ces deux nucléotides. La purine d'ARN (R) n'est pas base-appariée avec le DNAzyme et le 2'-O-méthylation présente sur le DNAzyme inhibe le clivage. Les bras de liaison de 10-23 DNAzymes sont généralement 10-15 nucléotides longs. La deuxième classe DNAzyme, 8-17 DNAzymes (Figure 1B) contiennent 14 nucléotides catalytiques (5'TCCGACGACGA3'). Les nucléotides C2, C3 et G4 s'associent à C9 G10 et G11 formant une courte structure en boucle de tige. 8-17 DNAzymes censer l'ARN en amont de toute guanine qui est imparfaitement jumelé avec la première thymine de la séquence active DNAzyme. Le nucléotide d'ARN en amont de la guanine n'est pas de base-appariement avec DNAzyme et son 2'-O-méthylation altère le clivage. 8-17 DNAzymes nécessitent des bras d'homologie plus longs d'environ 20 nucléotides pour diriger DNAzyme à sa séquence spécifique.
Ici, nous fournissons un protocole étape par étape pour l'analyse de 2'-O-méthylation de l'ARNr dans Saccharomyces cerevisiae en utilisant 10-23 et 8-17 DNAzyme-dépendant s'approche12,13 (Figure 1C). Ce protocole peut être facilement adapté à d'autres organismes et espèces d'ARN et utilisé pour les analyses rapides, préliminaires ou majeures de l'ARN 2'-O-méthylation spécifique au site.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acid phenol</td><td>SIGMA</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>A2114</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium</td><td>SIGMA</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Chlorophorm</td><td>Fisher scientific</td><td>10293850</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase eau libre</td><td>Fischer Scientific</td><td>10526945</td><td></td></tr><tr><td>DNAzyme</td><td>Integrated DNA Technology Custom</td><td>oligo DNA</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Absolute</td><td>Fisher</td><td>scientific 10437341</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>sigma</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>SIGMA</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>SIGMA</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl</td><td>SIGMA</td><td>W205702</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SIGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>SIGMA</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>SIGMA</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Oxoid Peptone Bactériologique</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d’extrait de levure oxoïde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase Inhibiteur (40 U/&micro ; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>SIGMA</td><td>74255</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium trihydraté</td><td>SIGMA</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nom</td><td>Company </td><td>Numéro de catalogue</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microtubes</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>152VR5C01M -80&deg ; C congélateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Erlenmeyer flacons</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes coniques</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Combicup VX200 vortex</td><td>Appleton Woods</td> DS-11 Denovix Chambre d’électrophorèse <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> (plateau de 20 cm)SIGMA <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH-mètre FiveEasy F20</td><td>Appleton Woods Système de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>documentation en gel</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Fresco 21 microcentrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 8R centrifugeuse avec rotateur adaptée aux tubes coniques de 50 mL Mini</td> centrifugeuse <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini Fuge Plus</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur HC bloc thermique</td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OLS26 Bain d’eau agitante</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerPac fournisseur d’énergie</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse dépendante de dnazyme de rrna 2'-o-methylation

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Boîte de guide C/D petits ARN nucléolar (snoRNAs) catalysent 2'-O-méthylation de ribosomal et petit ARN nucléaire. Cependant, un grand nombre de snoRNA dans les eucaryotes plus élevés peuvent proscêtrer promiscuité d'autres espèces d'ARN et 2'-O-méthylate cibles multiples. Ici, nous fournissons un guide étape par étape pour l'analyse rapide et non coûteuse de la méthylation 2'-O spécifique au site à l'aide d'une méthode bien établie utilisant de courts oligonucléotides d'ADN appelés DNAzymes. Ces fragments d'ADN contiennent des séquences catalytiques qui cenferment l'ARN à des positions consensuelles spécifiques, ainsi que des bras d'homologie variables orientant Le DNAzyme vers ses cibles d'ARN. L'activité de DNAzyme est inhibée par 2-'O-méthylation du nucléotide adjacent au site de clivage dans l'ARN. Ainsi, les DNAzymes, limités seulement par le consensus de la séquence clivée, sont des outils parfaits pour l'analyse rapide de l'ARN snoRNA-mediated 2'-O-méthylation. Nous avons analysé snR13- et snR47-guidé 2'-O-méthylation de l'ARN ribosomal 25S dans Saccharomyces cerevisiae pour démontrer la simplicité de la technique et pour fournir un protocole détaillé pour l'analyse DNAzyme-dépendante.

L'utilité du clivage DNAzyme-dépendant dans l'analyse des modifications de rRNA a été montrée récemment dans le contexte de la maturation de snoRNAs13. L'assay DNAzyme-dépendant a été employé pour montrer que le manque de traitement pré-snoRNA de 5'-end affecte des niveaux de 2'-O-méthylation de 25S et 18S rRNA dans S. cerevisiae13.
Ici, nous avons utilisé un système de transcription snoRNA inductible pour démontrer l'efficacité et la simplicité de la technique. La boîte C/D snR13 guide la méthylation à deux positions dans 25S rRNA, y compris adenine 2281 (figure 2A). Ce nucléotide est suivi par l'uracil, qui constitue le consensus dinucleotide (RY) cleavable par un 10-23 DNAzyme. La boîte C/D snR47 guide également la méthylation de deux nucléotides dans 25S rRNA (Figure 2B). L'adénine en position 2220 est suivie d'un résidu de guanine et ce dinuccléotide peut être clivé par un 8-17 DNAzyme. Afin d'induire ou d'inhiber la synthèse de snR13 ou snR47 snoRNA, nous avons inséré le promoteur INductible GAL1 en amont des gènes SNR13 ou SNR47 et des cellules cultivées dans le milieu contenant galactose(GAL1-dépendant transcription sur) ou glucose (GAL1-transcription dépendante). Ensuite, l'ARN isolé des cellules GAL1::SNR13 ont été incubés avec 10-23 DNAzyme conçu pour couper 25S rRNA au site snR13-dépendant, entre les nucléotides 2281 et 2282 (Figure 2C). L'ARN de la souche GAL1::SNR47 a été traitée avec 8-17 DNAzyme ciblant le site dépendant du snR47 entre les nucléotides 2220 et 2221 (figure 2D). Comme un contrôle, l'ARN de la souche sauvage-type BY4741 de plus en plus sur le galactose ou le glucose a été incubé avec les deux DNAzymes. L'électrophorèse de l'ARN DNAzyme-traité a indiqué que le rRNA 25S extrait de GAL1::SNR13 et GAL1::SNR47 souches de plus en plus sur galactose (GAL) est resté intact (Figure 3A,B; voies 3). En revanche, l'ARN isolé de GAL1::SNR13 et GAL1:SNR47 cellules de plus en plus sur le glucose (GLC) a été digéré par les DNAzymes respectifs (Figure 3A,B;voies 4). Dans les deux cas, la bande de rRNA 25S a diminué et des produits de clivage de coupure de 5' et 3' (A et B) ont été observés. Ceci indique que dans GAL1::SNR13 et GAL1:SNR47 souches, 25S rRNA a été 2'-O-méthylé aux sites snR13- ou snR47-guidé slorsque galactose a été utilisé comme source de carbone et ces snoRNA ont été exprimés. L'absence de méthylation de rRNA 25S quand l'expression de snR13 ou de snR47 a été coupée sur le glucose a permis pour le clivage DNAzyme-dépendant. Aucune digestion d'ARN n'a été observée pour les échantillons de type sauvage(figure 3A,B; voies 1 et 2), car l'expression de snR13 et snR47 est galactose/glucose-indépendant dans cette souche. Par conséquent, rRNA était normalement méthylé et si résistant à l'activité de DNAzymes.
Dans l'ensemble, notre expérience montre que l'activité de clivage de 10-23 (figure 3A) et 8-17 (Figure 3B) DNAzymes corrélée avec l'absence de la boîte C/ D snR13 ou snR47, indiquant clairement que ces snoRNA sont responsables de 25S rRNA 2'-O-méthylation à des sites particuliers.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig1.jpg"> Figure 1 : Les DNAzymes et leurs substrats d'ARN. (A) 10-23 DNAzymes cleave a purine-pyrimidine (RY) RNA dinucleotide. R dans l'ARN n'est pas jumelé avec DNAzyme, tandis que Y est complémentaire à la base R dans le DNAzyme. La méthylation de la purine (R) dans l'ARN supprime le clivage DNAzyme-dépendant. (B) 8-17 DNAzymes censer l'ARN en amont de la guanine qui est imparfaitement jumelé avec la première thymine dans la séquence catalytique DNAzyme. Le nucléotide précédant la guanine n'est pas apparié et sa méthylation protège contre le clivage Dépendant du DNAzyme. L'ARN est représenté en gris (à l'exception du site de méthylation), le DNAzyme est représenté en violet. N - n'importe quel nucléotide, R et purine : adénine ou guanine, Y et pyrimidine : cytosine ou uracil ; CH3- dénote la méthylation de l'ARN. L'appariement de base dans les séquences actives DNAzyme est marqué par des lignes pointillées. Un éclair bleu marque le site de clivage. (C) Graphique de flux montrant les étapes d'une analyse dépendante du DNAzyme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig2.jpg"> Figure 2 : DNAzymes ciblant les sites de méthylation dépendants de snR13 et de snR47 dans le rRNA 25S. (A, B) Captures d'écran du navigateur montrant snR13-dépendant (A) et snR47-dépendants (B) sites de méthylation dans 25S rRNA (C) 25S séquence rRNA entourant snR13-dépendant site de méthylation (A2281) et 10-23 DNAzyme (montré en violet) conçu pour couper l'ARN entre A2281 et U2282. Un2281 n'est pas jumelé avec le DNAzyme tandis que U2282 forme une paire avec le premier nucléotide de la séquence active DNAzyme (marqué par une ligne bleue). Un éclair bleu marque le clivage. (D) séquence rRNA 25S entourant le site de méthylation dépendant de snR47 (A2220) et 8-17 DNAzyme (montré en violet) conçu pour couper l'ARN entre A2220 et G2221. Un2220 n'est pas hybride avec le DNAzyme tandis que G2221 est imparfaitement jumelé à la thymine (dénoté avec une ligne pointillée). Un éclair bleu marque le site de clivage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59700/59700fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse de l'analyse de 2'-O-méthylation de 25S rRNA spécifique au site à l'aide de 10-23 et 8-17 d'analyse dépendante du DNAzyme. (A) Analyse de la méthylation 25S rRNA dépendante de snR13 utilisant 10-23 DNAzyme. (B) Analyse de la méthylation 25S rRNA dépendante de snR47 utilisant 8-17 DNAzyme. L'ARN a été visualisé la coloration dans un gel d'agarose dénaturant. Les produits de clivage A et B sont marqués par des flèches rouges. WT - variété de type sauvage; GAL - galactose, GLC et glucose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59700/59700fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ici nous présentons un protocole pour le clivage DNAzyme-dépendant de l'ARN. Cela permet une analyse rapide et dépendante du site de l'ARN 2'-O-méthylation. Cette approche peut être utilisée pour l'évaluation préliminaire ou majeure de l'activité du snoRNA.

Analyse Dépendante de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

La digestion dépendante du DNAzyme est une méthode utile pour étudier les fonctions des snoARN. Il s’agit d’une méthode simple et rapide pour analyser la méthylation de l’ARN propre au site. Il nécessite un oligonucléotide d’ADN court et des reagents de base présents dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire.Commencez par concevoir le DNAzyme pour la séquence d’intérêt. Trouvez la séquence arn ou le site de méthylation putative à l’aide d’une base de données appropriée. Pour les cibles S.cerevisiae snoRNA, utilisez la base de données snoRNA levure.Pour trouver un site de méthylation d’intérêt, par exemple, un site dépendant du snR13, sélectionnez snR13 et notez la position du nucléotide modifié. Trouvez la séquence en amont et en aval du nucléotide modifié à l’aide d’une base de données appropriée, telle que saccharomyces Genome Database. Recherchez le nom du gène cible.Si vous utilisez un essai de 10 à 23 DNAzyme, sélectionnez 10 à 15 nucléotides en amont et en aval du site de méthylation. Si vous utilisez le DNAzyme 8-17, sélectionnez 20 nucléotides. Créez des séquences complémentaires des bras à cinq et trois premiers et utilisez-les pour flanquer la séquence catalytique DNAzyme aux extrémités à trois et cinq premiers.Commandez le DNAzyme comme oligonucléotide normal d’ADN. Cultiver des souches de levure d’intérêt dans un milieu approprié et des conditions. Lorsque les cellules atteignent la phase exponentielle moyenne, pelletez-les en les centrifugant à 1000 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et jetez le milieu.Procéder à l’isolement de l’ARN selon les directives manuscrites. Ensuite, réutilisez la pastille d’ARN dans 30 microlitres d’eau sans RNase et DNase. Placez le tube sur la glace et mesurez la concentration d’ARN sur un microspectrophotomètre.Pour effectuer la digestion du DNAzyme à l’aide du DNAzyme de 10 à 23, préparez un mélange d’incubation avec cinq microgrammes d’ARN, 200 picomoles de 10 à 23 DNAzyme et un tampon d’incubation x 10 à 23 dans un volume total de 10 microlitres. Ensuite, incuber les tubes sur un bloc thermique sec réglé à 95 degrés Celsius pendant trois minutes. Immédiatement après, placez les tubes sur la glace et laissez-les là pendant cinq minutes.Tournez brièvement les tubes et remets-les sur la glace. Ajouter 20 unités d’inhibiteur de la RNase et placer les tubes sur un bloc thermique sec réglé à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pendant ce temps, préparer un mélange de réaction en combinant cinq microlitres de tampon de réaction de quatre x 10 à 23 avec quatre microlitres de chlorure de magnésium de 300 molaires et une eau microlitre.Préchauffer ce mélange de réaction sur un bloc thermique sec réglé à 37 degrés Celsius. Placez le tube avec le mélange d’incubation sur le bloc thermique sec de 37 degrés Celsius et ajoutez 10 microlitres du mélange de réaction préchauffé. Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant une heure, puis, placer le tube sur la glace.Pour effectuer la digestion du DNAzyme à l’aide du DNAzyme 8-17, préparez un microtube de 1,5 millilitre avec cinq microgrammes d’ARN dans un volume total de six microlitres. Ensuite, préparer un tube séparé avec 400 picomoles de la DNAzyme 8-17. Pendant le travail, gardez les deux tubes sur la glace.Transférer les deux tubes dans un bloc thermique sec réglé à 95 degrés Celsius et les incuber pendant deux minutes. Déplacez l’échantillon d’ARN sur la glace et faites tourner le tube avec le DNAzyme pendant cinq secondes. Incuber le DNAzyme à 25 degrés Celsius pendant 10 minutes.Pendant que le DNAzyme est en incubation, préparez 10 mircoliters de tampon de réaction de deux X 8-17 et préchamez-le à 25 degrés Celsius. Ajouter le tampon préchauré au tube avec le DNAzyme, puis, transférer 14 microlitres de ce mélange de réaction au tube avec l’ARN, avec 20 unités d’inhibiteur de la RNase. Incuber la réaction à 25 degrés Celsius pendant deux heures, puis placer le tube sur la glace.Pour purifier l’ARN après la digestion du DNAzyme, ajouter 350 microlitres d’eau et 400 microlitres de chloroforme au tube de réaction. Vortex pendant 30 secondes et centrifugeuse à 20 000 fois g pendant cinq minutes. Après centrifugation, transférer la phase supérieure dans un nouveau tube contenant un millilitre d’éthanol, 40 microlitres d’acétate d’ammonium de 7,5 molaires et un microlitre de glycogène.Retournez le tube à quelques reprises pour mélanger et incuber soit à 80 degrés Celsius négatifs pendant deux heures ou à 20 degrés Celsius négatifs pendant la nuit. Procéder à la purification de l’ARN selon les instructions manuscrites, puis, re-suspendre la pastille d’ARN dans 10 microlitres RNase et DNase-libre d’eau. Placez le tube d’ARN sur la glace immédiatement après la purification.Pour effectuer l’électrophoresis d’ARN, commencez par dissoudre 1,5 grammes d’agarose dans 127,5 millilitres d’eau distillée double en chauffant le mélange au micro-ondes. Ajoutez ensuite 15 millilitres de MOPS 10X et 7,5 millilitres de formaldéhyde à 37% à la solution agarose. Ajouter une quantité appropriée de tache de gel à la solution agarose.Verser l’agarose dans le plateau et laisser refroidir pendant 45 minutes. Préparer les échantillons d’ARN en combinant 10 microlitres de l’ARN digéré et purifié avec cinq microlitres de tampon dénaturant l’échantillon et 0,5 microlitres de colorant de chargement de six X. Incuber les échantillons à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis sur la glace pendant cinq minutes.Mettez le gel préparé dans le réservoir d’électrophoresis et remplissez le réservoir avec un tampon MOPS d’un X. Chargez les 15 microlitres entiers de l’échantillon sur le gel et exécutez le gel à 80 volts jusqu’à ce que le bleu bromothymol atteigne les 2/3 de la longueur du gel. Analyser le gel avec l’imageur approprié.La valeur de cette technique peut être démontrée sur un système inductible de transcription de snoRNA. L’insertion d’un promoteur GAL1 inductible en amont des gènes snR13 ou snR47 permet d’analyser la méthylation dépendante de l’ARN ribosomal 25S. Lorsque les cellules sont cultivées sur la galactose, l’ARN ribosomal 25S est méthylé aux sites guidés par snoRNA et reste intact après le traitement au DNAzyme.En revanche, lorsque l’expression de snoRNA est arrêtée en raison de l’absence de galactose, le clivage dépendant du DNAzyme se produit. En outre, aucune digestion d’ARN n’est observée dans les contrôles de type sauvage puisque l’expression de snoRNA est indépendante de galactose. L’activité du clivage dépendant du DNAzyme dans l’analyse de nos modifications rRNA a été montrée récemment dans le contexte de la maturation de snoRNA.L’essai dépendant de DNAzyme a été employé pour montrer que l’absence du traitement de cinq-premier et pré-snoRNA affecte des niveaux de méthylation de 25S et de rRNA de 18S dans Saccharomyces cerevisiae. Ce protocole nécessite l’utilisation de phénol et de chloroforme, qui sont toxiques, et doivent être manipulés sous un capot de fumée.

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Criblage de la structure de l’ARN avec le profilage mutationnel du sulfate de diméthyle avec séquençage in vitro et dans les cellules

Ce protocole fournit un flux de travail facile à suivre pour effectuer la purification de l’ARN poly(A), la conversion du bisulfite et la préparation de la bibliothèque à l’aide d’un équipement normalisé pour un échantillon biologique d’intérêt.

Enrichissement de la bibliothèque d’ARNm et de bisulfite-ARNm pour le séquençage de nouvelle génération

Ici, nous présentons un protocole pour évaluer semi-quantitativement les niveaux globaux de m⁶A en utilisant le blot de points. L’ARN total est extrait, dénaturé, taché sur une membrane en nylon, sondé avec un anticorps anti-m⁶A, et visualisé par chimiluminescence. L’intensité du signal, quantifiée par l’analyse en niveaux de gris ImageJ, reflète l’abondance relative de méthylation, offrant un flux de travail reproductible pour la recherche.

Essai par blot de points pour détecter les niveaux globaux de modification de l’ARNde la N 6-méthyladenosine

Découvrez une méthode rapide et économique pour analyser la méthylation 2'-O de l'ARN ribosomique de levure Saccharomyces cerevisiae en utilisant des DNAzymes. Ce protocole permet de détecter les événements de méthylation guidés par les snoRNA.

Analyse Dépendante de DNAzyme de rRNA 2'-O-Methylation

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