Séparation de l’épiderme et du derme du rat avec la thermolysine pour détecter l’ARNm et la protéine inflammatoires spécifiques au site

Notre protocole est une technique de séparation épidermique-cutanée facile à utiliser et peu coûteuse pour déterminer la production spécifique au site de médiateurs inflammatoires et de neurotrophines lors de l’inflammation de la peau. Le principal avantage de cette technique est que la séparation enzymatique de l’épiderme du derme est effectuée à quatre degrés Celsius, maintenant l’intégrité de l’ARNm et des protéines. Cette méthode donne un aperçu des types de médiateurs qui sensibilisent les terminaux afférents primaires au cours de l’inflammation aiguë et chronique pour le développement de nouvelles interventions thérapeutiques.

La cicatrisation des plaies, les maladies de la peau, les plaies chroniques et les brûlures pourraient bénéficier de cette recherche. Et cette méthode pourrait être appliquée à d’autres surfaces épithéliales, telles que le tractus gastro-intestinal et la cornée. Le temps de séparation optimal peut différer légèrement d’un laboratoire à l’autre.

Une expérience préliminaire comparant différents points temporels combinée à une évaluation morphologique 2D est recommandée pour déterminer la qualité de la séparation. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale chez un rat Sprague Dawley anesthésié âgé de huit à neuf semaines, injecter par voie sous-cutanée la patte postérieure glabre droite avec 100 microlitres de carraghénane 1X Lambda dilué dans du PBS. Utilisez des étriers pour mesurer l’épaisseur du métatarse de la patte postérieure immédiatement avant et 6 et 12 heures après l’injection afin de déterminer le volume de l’œdème en réponse au stimulus.

À l’extrémité expérimentale appropriée, utilisez un scalpel pointu pour prélever un morceau de peau glabre de la patte postérieure glabre d’un millimètre sur la patte injectée et utilisez des pinces à microdissection pour transférer la peau dans un millilitre de DMEM froid dans un tube de microcentrifugation sur glace pendant 15 à 60 minutes. Pendant que le tissu est en incubation, ajoutez un millilitre de thermolysine activée fraîchement préparée à 10 puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits sur de la glace. À la fin de l’incubation, utilisez les pinces à microdissection pour transférer un échantillon de peau dans chaque puits de thermolysine activée, côté couche cornée vers le haut sans immerger les échantillons dans la solution.

Il est essentiel que la peau ne soit pas immergée dans la thermolysine et que la couche cornée soit orientée vers le haut pour obtenir une séparation efficace. Après deux à trois heures, utilisez la pince à microdissection pour immerger un échantillon de peau dans sept à huit millilitres de quatre degrés Celsius DMEM dans une boîte de Pétri afin de laisser plus d’espace à l’épiderme pour se séparer du derme. Utilisez une pince pour brosser doucement l’épiderme autour du périmètre de la peau jusqu’à ce que l’épiderme presque translucide soit observé aux bords de l’échantillon.

Lorsque l’épiderme se sépare sensiblement du derme, saisissez soigneusement chaque couche de peau avec une seule paire de pinces et tirez lentement l’épiderme du derme, puis évaluez la translucidité de l’épiderme isolé par microscopie optique pour vous assurer qu’il est optiquement cohérent. Si les couches ont été correctement séparées, placez les tissus épidermiques et dermiques dans des récipients individuels de cinq millimolaires EDTA dans du DMEM à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Après la désactivation de la thermolysine, fixez une partie de l’épiderme dans un fixateur approprié pendant une heure à température ambiante avec agitation.

À la fin de l’incubation, placer le tissu fixe dans du saccharose à 10% dans du PBS pendant une heure à température ambiante avec agitation, avant de congeler l’échantillon dans une matrice d’incorporation tissulaire appropriée pour le sectionnement. Utilisez un cryostat pour obtenir des sections transversales de 14 micromètres d’épaisseur et les décongeler, montez les sections sur des lames de microscope en verre recouvertes de gélatine. Après séchage sur un chauffe-lames, tacher les échantillons avec une solution de travail de bleu de toluidine pendant 90 secondes.

Ensuite, lavez doucement le bleu de toluidine des lames avec du PBS et opposez les couvercles avec un milieu de montage aqueux, puis observez l’épiderme avec la microscopie Brightfield à un grossissement de 50 à 250X. L’injection de carraghénane dans la patte postérieure du rat provoque des symptômes classiques d’inflammation, tels que des rougeurs et un œdème à la fois 6 et 12 heures après l’injection. La microscopie à fond clair peut être utilisée pour évaluer l’efficacité de la séparation thermolysine de l’épiderme et du derme de la peau glabre de la patte postérieure glabre du rat.

En effet, la coloration bleu toluidine des coupes transversales épidermiques montre que l’épiderme est séparé du derme au niveau de la membrane de base, mais que les crêtes de Rete épidermiques et les indentations de la papille dermique restent intactes. De plus, toutes les couches de cellules kératinocytes sont observées. Le transfert western de l’épiderme séparé par la thermolysine produit des résultats cohérents, indiquant des niveaux de protéines stables au cours de la technique à quatre degrés Celsius.

Très peu de protéine NGF est détectée dans l’épiderme naïf du rat, mais les niveaux de protéine NGF sont significativement régulés à la hausse après six heures d’inflammation induite par le carraghénane. 12 heures après l’injection, les taux de NGF sont réduits par rapport à ceux observés à six heures, mais restent élevés par rapport aux témoins. Comme on peut s’y attendre de l’analyse par transfert western, l’immunoréactivité du NGF n’est pas détectée dans les échantillons de tissu d’épiderme témoin naïf, mais six heures après l’inflammation induite par le carraghénane, l’immunoréactivité du NGF est observée dans la plupart des kératinocytes de la couche granulosum et de la strate lucidum.

Quelques cellules de la couche spinosum sont également immunoréactives au NGF. Lors de l’utilisation de la thermolysine pour isoler l’épiderme intact, il est important de se rappeler que le temps de séparation optimal doit être déterminé empiriquement par l’utilisateur final. Diverses techniques protéomiques et moléculaires peuvent être utilisées pour valider l’expression de protéines spécifiques et/ou de transcriptions de gènes primaires afin de confirmer que cette procédure ne modifie pas l’expression basale.

Cette technique de séparation épidermique-cutanée permettra aux chercheurs de répondre à des questions supplémentaires concernant l’expression spécifique au site des neurotrophines et des médiateurs inflammatoires dans différents modèles inflammatoires cutanés. L’acide picrique et le paraformaldéhyde sont dangereux. Travaillez avec les deux produits chimiques dans une hotte aspirante, utilisez des vêtements et des gants de protection individuelle et lavez-vous le visage et les mains après la manipulation.