Génération d'organoïdes tumoraux à partir de modèles de souris génétiquement modifiés du cancer de la prostate

Les cultures organoïdes de souris ressemblent plus étroitement à l’organisation cellulaire in vivo qu’aux cultures cellulaires traditionnelles. Dans la recherche sur le cancer, les organoïdes modélisent la tumeur originale mieux que les lignées cellulaires 2D et peuvent être utilisés pour tester des thérapies potentielles contre le cancer in vitro pour développer de nouveaux traitements médicamenteux. Pour l’extraction en bloc du système urogène de souris mâle saisir la garniture de graisse de chaque côté de la vessie et tirer vers le haut pour exposer le testicule.

Disséquer soigneusement chaque testicule loin du reste de la région urogène. Soulevez doucement la vessie de sorte que la région urogène est élevée ensemble, exposant l’urètre en dessous. Tout en tenant la vessie, orientez les ciseaux contre le dessous de la prostate dorsale pour inciser l’urètre.

Toute la région ovrogénétique sera libérée de la cavité abdominale. Après avoir enlevé le système urogène, les ganglions lymphatiques pelviens placés immédiatement derrière le système urogène et de chaque côté de la colonne vertébrale seront exposés. Pour enlever les ganglions lymphatiques orienter les forceps droits sous le tissu lymphatique et tirer vers le haut.

Ensuite, saisissez le rectum avec les forceps droits et coupez, tirant vers le haut sur le rectum pour démêler le côlon entier et l’intestin grêle pour rechercher des lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques mésentériques. Lorsque l’ilium entier a été enlevé continuer à tirer sur le dudénon pour exposer l’estomac. Couper l’œsophage pour enlever complètement l’estomac.

Si des lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques sont observées, disséquez soigneusement ces ganglions loin de l’intestin pour le stockage dans PBS. Lorsque l’estomac a été enlevé, la rate peut être récoltée du côté dorsale de l’abdomen pour le stockage dans 4% paraformaldéhyde. Retirer le foie pour le stockage dans PBS.

Retirez les reins de chaque côté de la colonne vertébrale avec tous les ganglions lymphatiques rénaux contenant des lésions métastatiques. Pour exposer la cavité thoracique soigneusement couper le diaphragme le long de la cage thoracique. La pression négative libérée dans la cavité thoracique exposera le cœur et les poumons.

Tirez vers le haut sur le sternum pour ouvrir la cavité thoracique plus loin. Scannez le visage ventral de la cavité thoracique le long de la cage thoracique pour les lésions métastatiques dans les ganglions lymphatiques thoraciques pour la dissection s’il est présent. Tout en tenant le sternum, couper la cage thoracique ventrale pour accéder au cœur et aux poumons et tirer vers le haut sur le cœur pour couper sous les poumons.

Pour enlever complètement le cœur et les poumons en bloc couper tous les vaisseaux sanguins antérieurs dans la trachée. Transférez soigneusement le cœur sans endommager le tissu pulmonaire ou les lésions métastatiques pulmonaires dans un récipient de PBS. Pour la dissection de la tumeur de prostate placer la région urogène sous un microscope de dissection.

Utilisez une paire de forceps droits et une paire de forceps incurvés pour retourner la région urogène sur sa surface dorsale. Localiser la région proximale de la prostate qui peut être identifiée par la couleur rose-rouge de l’urètre. Saisissez fermement l’urètre pour permettre la manipulation du tissu urogène avec les forceps incurvés.

Localiser la base des vésicules séminal pour permettre leur enlèvement soignent. Ensuite, utilisez le côté incurvé des forceps pour enlever les déférents de vas et autant de tissu gras et conjonctif que possible. Tout en maintenant fermement l’urètre et la région proximale de la prostate, utilisez une paire de ciseaux pointus fins pour enlever la vessie de l’urètre.

Tenant fermement la région proximale de prostate et l’urètre avec les forceps droits saisissent la région antérieure de prostate avec le côté courbé des forceps pour tirer fermement le tissu loin de la vessie et du reste de la prostate. Placez le tissu antérieur de prostate dans PBS et localisez la région ventrale de prostate. Retirez la région ventrale de la prostate de la même manière.

Si la région latérale peut être distinguée de la région dorsale enlever la région latérale de la prostate des deux côtés. Retirez ensuite la région dorsale de la prostate et placez la région proximale de la prostate dans 4% de paraformaldéhyde. Après le hachage, placez les morceaux de tumeur dans un tube de 15 millilitres de tampon de digestion pour une digestion d’une heure et demie à deux heures à 37 degrés Celsius.

À la fin de la digestion, sédimenter le tissu digéré par centrifugation et jeter le supernatant. Feuilletez le tube pour desserrer la pastille cellulaire. Resuspendez les cellules en un millilitre de trypsine préchauffée complétée par 10 inhibiteurs micromolaires Y-27632 ROCK pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

À la fin de l’incubation triturer le lisier tissulaire cinq fois avec une pointe standard P1000 pipette. Remettre le tube au bain d’eau pour une incubation et une trituration supplémentaires de cinq minutes. Pour le placage matricielle dôme laver les cellules digérées en neuf millilitres de milieu froid, puis recueillir les cellules par centrifugation.

Resuspendez les cellules en un millilitre de milieu frais pour compter. Et après le comptage, recueillir les cellules par centrifugation une fois de plus. Diluer les cellules tumorales dans le volume approprié de la matrice.

Déposez soigneusement 200 microlitres de solution cellulaire matricielle dans chaque puits d’une plaque de six puits réchauffée de 55 degrés Celsius. Laissez les dômes se solidifier à température ambiante pendant deux minutes avant de placer la plaque à l’envers dans un incubateur de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Lorsque les dômes ont entièrement solidifié ajouter deux millilitres de milieu organoïde de la prostate complétée par androgène R1881 et inhibiteur rock à chaque puits.

Retournez la plaque à l’incubateur de culture cellulaire. Les images fluorescentes de dissection révèlent la protéine fluorescente verte, ou expression de GFP, par les tumeurs solides de prostate, indiquant que les cellules de tumeur expriment cre. Le foie et les poumons du même animal présentent des tumeurs métastatiques exprimant GFP démontrant que ces tumeurs provenaient de la tumeur primaire de prostate.

Le ganglion lymphatique pelvien de cette souris exprime GFP et non Tomate, indiquant que cette tumeur métastatique a dépassé le ganglion lymphatique et aucun tissu normal ne reste. Au premier jour de la culture de petits organoïdes générés à partir d’une tumeur solide de prostate commencent à se former avec la tomate et les cellules GFP-exprimant présentes dans la culture organoïde de tumeur. Au septième jour et au-delà quand les organoïdes de tumeur de prostate se sont complètement formés cependant, les organoïdes expriment GFP, mais pas tomate, suggérant que les organoïdes aient provenu des cellules tumorales cre-expressing et non des cellules épithéliales normales.

Le premier jour de la culture des petits organoïdes produits à partir de la tumeur de prostate fluide-remplie à la fois tomate et GFP-exprimant des cellules sont présentes dans la culture organoïde. Les organoïdes des tumeurs de prostate remplies de liquide expriment gfp ou tomate au septième jour et au-delà cependant, indiquant que les organoïdes formés à partir de cellules qui n’expriment pas Cre. Pour rester orienté lors de la récolte du tissu prostatique, soyez conscient des positions de la vessie et de l’urètre en tout temps.

Après leur génération, les organoïdes peuvent être utilisés dans les applications d’imagerie, l’analyse de la biologie moléculaire et les écrans de médicaments.