Un porte-échantillon tout-en-un pour la cristallographie macromoléculaire de rayon X avec la diffusion minimale de fond

Ce support d’échantillon peut être utilisé pour la culture de cristaux et la collecte de données de diffraction des rayons X. Ce porte-échantillon a été utilisé sur des plaques de 24 puits qui sont largement utilisées dans la communauté MX. L’aspect très important est qu’il n’y a pas de manipulation nécessaire.

Un porte-échantillon comportant ces aspects décrits ici n’existait pas auparavant. Voir quelque chose est toujours beaucoup mieux que de simplement lire à ce sujet. En regardant la vidéo, un utilisateur potentiel peut saisir immédiatement les fonctionnalités et les subtilités du nouveau porte-échantillon.

Pour commencer, créez une surface propre et exempte de poussière à l’aide d’un chiffon humide et sans peluche. Prenez un porte-échantillon de sa boîte et placez-le doucement, feuille jaune face vers le haut, sur la surface propre pour éviter les dommages ou la ponction non désirée du papier d’aluminium COC arrière. Installez les gouttes de cristallisation sur le papier d’aluminium jaune comme cela se ferait sur les diapositives de couverture couramment utilisées.

Placez doucement les gouttes pour éviter toute rupture ou perçage de la feuille à l’aide d’une pipette. Sur les porte-échantillons de type 2 et 3, deux gouttes sont le maximum recommandé. Sur un porte-échantillon de type 1, jusqu’à trois gouttes peuvent être placées.

Retournez le porte-échantillon et placez-le sur une cavité pré graissée d’une plaque de style Linbro de 24 puits. Utilisez les aides au positionnement du porte-échantillon pour le guider vers sa position optimale. Assurez-vous de la position correcte du porte-échantillon afin d’éviter l’évaporation non désirée.

En plaçant la plaque de cristallisation sous un microscope à lumière de transmission, sans polariseurs ou sans polariseurs, surveillez la croissance du cristal sans aucune perturbation de l’expérience. Effectuez la cryoprotection au microscope à lumière de transmission. Percer délicatement le papier d’aluminium extérieur COC à l’aide d’une canule fine.

Assurez-vous que le papier d’aluminium jaune intérieur reste intact. La ponction doit être juste à côté de la chute qui doit être manipulée. Insérez une mèche de papier fin dans le trou piqué.

Poussez soigneusement la mèche vers l’avant jusqu’à ce qu’elle touche le papier d’aluminium polyimide jaune. Gardez la mèche en contact avec le papier d’aluminium perforé. La mèche va sucer toute solution excédentaire.

Le temps nécessaire pour l’enlèvement complet du liquide dépend de la viscosité des solutions et de la composition de l’alcool mère. Une fois que tout le liquide est aspiré, retirez doucement la mèche de papier. Rappelez-vous la position de la baisse, car il peut ne pas être visible après l’enlèvement de l’alcool mère.

Prenez une pipette standard pour appliquer un petit volume de solution cryo-protectant, à l’aide d’une pointe extrudée à travers le même trou. Pour réséaliser le papier d’aluminium COC auto-cicatrisation, placez doucement un doigt protégé sur le trou pendant environ une seconde et faites-le glisser à travers la perforation. La légère pression combinée à la température élevée favorisera le resealing des perforations qui ne sont pas trop grandes.

Dissoudre le ligand dans la liqueur mère dans la concentration désirée dans un tube de réaction. Faites tourner la solution pendant 10 minutes à 12 000 fois g afin d’éliminer les particules insolubles. Utilisez une centrifugeuse à température contrôlée si nécessaire.

Placez délicatement un maximum de trois microlitres de solution contenant du ligand dans l’espace entre le papier d’aluminium COC et le film polyimide à l’aide d’une longue pointe de pipette extrudée; rétractez la pointe. Pour réséaliser le papier d’aluminium COC auto-cicatrisation, placez doucement un doigt protégé sur le trou pendant environ une seconde et faites-le glisser à travers la perforation. Incuber l’expérience pendant un certain temps pour permettre la diffusion à travers la membrane.

Le temps de trempage dépend fortement de la viscosité de la solution de diffusion et de ses composants. Répétez les étapes de trempage ligand plusieurs fois pour tremper par la suite différents ligands. Pour réduire au minimum la dispersion des solvants, retirez l’excès de solution avant la collecte de données.

Assurer un environnement de faisceaux stable et contrôlé par l’humidité avec des conditions prééditées. Pour effectuer la collecte de données de diffraction in situ à température ambiante, soulevez doucement la feuille transparente du COC au point désigné à l’aide de forceps et pelez-la. Maintenant, soulevez doucement le porte-échantillon de sa cavité et insérez-le immédiatement dans une base de support d’échantillon magnétique pré-préparée.

Aucune colle n’est nécessaire pour cette étape. Appliquez une pression douce pour assurer le positionnement correct du porte-échantillon à l’intérieur de la base. Pour les porte-échantillons avec un anneau extérieur amovible, appliquez une pression douce en vous accronant à l’anneau extérieur et brisez-le aux points de rupture désignés.

L’échantillon est maintenant prêt pour la collecte de données de centrage et de diffraction. Montez le porte-échantillon sur un goniomètre beamline et assurez-vous d’un positionnement correct du support. Selon la géométrie du goniomètre, le support de l’échantillon peut être tourné jusqu’à 160 degrés sans causer d’ombre pendant l’expérience de diffraction.

Utilisez une mèche de papier et touchez doucement le papier d’aluminium polyimide jaune de l’arrière pour enlever l’excès de liqueur mère. L’échantillon est maintenant prêt pour la collecte de données de centrage et de diffraction. Préparez-vous à la collecte in situ de données de diffraction à température cryogénique comme cela a été fait pour la température ambiante, puis plongez l’échantillon dans de l’azote liquide et transférez-le dans un flacon compatible AVEC LA COLONNE VERTÉBRALE.

La géométrie des types 2 et 3 du porte-échantillon permet leur transfert dans des flacons d’échantillons SPINE standard, qui peuvent être utilisés pour le montage d’échantillons assistés par robot. Le porte-échantillon de type 1 et de type 2 a été conçu pour s’insérer sur un puits d’une plaque de style Linbro de 24 puits. Chaque porte-échantillon contient des aides au positionnement de chaque côté de la jante extérieure afin d’assurer un positionnement optimal sur le bord du puits.

Une plaque de style Linbro de 24 puits a été utilisée avec le porte-échantillon de type 1 pour équilibrer une goutte à 293 Kelvin contre 500 microlitres d’alcool mère. Des cristaux de 40 à 50 microns ont été observés après cinq heures à l’aide d’un microscope à lumière de transmission avec ou sans polariseur. Un porte-échantillon avec des cristaux de lysozyme blanc d’œuf de poule a été placé dans un flux d’air contrôlé par l’humidité sur la ligne de faisceau HZB-MX 14,3.

Une image typique de diffraction est montrée ici. Aucune diffusion arrière-plan élevée sur l’image de diffraction ne peut être détectée. Il est essentiel d’éviter les contaminations du papier d’aluminium polyimide.

De plus, il est important que le porte-échantillon soit positionné avec précision et que la manipulation du cristal soit effectuée avec soin. Le porte-échantillons permet la manipulation de cristaux très délicats, l’une des étapes les plus importantes de la cristallographie micromoléculaire. Son utilisation diminue considérablement les chances de détruire l’échantillon.