Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain

Notre protocole peut être largement utilisé pour le criblage élevé et rapide des interactions entre l’endobiotics et le microbiote humain d’intestin. Faible coût et éviter les effets d’interférence du métabolisme de l’hôte. Cette procédure a le potentiel d’être employée dans le diagnostic.

Tout d’abord, dissoudre BIF EPS et amidon individuellement dans l’eau chaude sur un agitateur magnétique pour faire à la fois la concentration de huit grammes par litre. Dans le milieu de culture de base préparé, VI, ajouter 100 millilitres de la solution BIF EPS pour faire de la culture VI solution BIF. Ajouter 100 millilitres de la solution amidon pour faire de la culture VI solution d’amidon.

Autoclave les deux médias avec source de carbone, et le milieu sans source de carbone comme un contrôle, à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Laissez-les refroidir à température ambiante et ajoutez des foins et de la cystéine. Transférer un sous-échantillon de cinq millilitres de chaque milieu vers les tubes de culture.

Et conserver dans un incubateur anaérobie. Stockez les autres médias à quatre degrés Celsius. Pour préparer l’échantillon fécal humain, transférez un gramme d’échantillon fécal frais en 10 millilitres de 0,1 PBS anaérobie molaire au pH sept dans un bécher en verre.

Ensuite, utilisez une tige de verre pour le remuer pour obtenir une boue. Dans une chambre anaérobie, ajouter 500 microlitres de boue fécale filtrée dans les trois supports de fermentation préparés, individuellement. Puis, incuber à 37 degrés Celsius.

Après 24 heures et 48 heures, recueillir deux millilitres d’échantillons fermentés dans la chambre anaérobie. Et puis centrifugeuse à l’extérieur de la chambre à 6000 fois G, pendant trois minutes. Transférez soigneusement les supernatants dans de nouveaux tubes de centrifugeuse qui seront utilisés pour l’analyse de la dégradation du polysaccharide et les mesures des acides gras à chaîne courte.

Conserver les granulés de centrifugation à 80 degrés Celsius. Chargez 0,2 microlitres des supernatants fermentés sur chaque gel de silice pré-enduit 60 TLC plaque d’aluminium et tourbillonner pour se propager. Ensuite, utilisez un sèche-cheveux à l’air chaud pour sécher.

Immerger une extrémité des plaques échantillonnées dans 20 millilitres d’acide formic: n-butanol:solution d’eau pendant plusieurs minutes, jusqu’à ce que l’électrophoresis s’étend presque à l’autre extrémité. Puis sortez les assiettes avec des forceps, et séchez avec un sèche-cheveux. Puis tremper les assiettes dans le reagent orcinol pendant deux minutes pour teindre.

Et sécher à nouveau. Transférer les assiettes dans un four à cuisson à 120 degrés Celsius pour chauffer pendant trois minutes. Prenez ensuite des photos de la plaque pour évaluer la dégradation de l’EPS en mesurant les bandes TLC.

Pour étudier les effets de l’EPS sur la production de SCFA, ajoutez un millilitre des supernatants fermentés aux tubes de centrifugeuse de deux millilitres et ajoutez 0,2 millilitres de 25 poids/volume pour cent d’acide métaphosphorique à chaque échantillon. Vortex pour bien mélanger les solutions. Centrifuger les mélanges à 13 000 fois G pendant 20 minutes.

En attendant, préparez des solutions d’acides acétiques, propioniques, butyriques, isobutyriques, valérianes et isovaleriques de 120 millimolaires dans des tubes. Ajouter ensuite un millilitre de chaque acide préparé à un tube contenant 1,2 millilitres d’acide métaphosphorique de 25 poids/volume pour cent. Et chargez-les dans la bouteille d’échantillon de l’instrument de chromatographie gazeuse comme cocktails standard.

Sortez les tubes de la centrifugeuse et transférez les supernatants dans des tubes frais. Utilisez une seringue équipée d’un filtre de 0,22 micron pour filtrer les supernatants dans de nouveaux tubes pour l’analyse gaz-chromatographie. Dans cette étude, la production d’EPS mucoïde a été observée dans les cultures de longum de bifidobacterium sur des plaques de PYG, après incubation anaérobie pendant 72 heures.

La centrifugation des éraflures de culture, suivie des précipitations d’éthanol et du séchage, a entraîné la collecte d’EPS de cellulose. L’analyse de TLC a indiqué que le taux de dégradation de l’amidon par microbiote fécal humain était plus rapide que celui du BIF EPS. L’analyse principale des coordonnées montre que la culture VI BIF et les groupes d’amidon de culture VI, regroupés séparément les uns des autres, indiquent que la disponibilité de l’EPS et de l’amidon façonne différemment les communautés bactériennes fécales humaines.

L’analyse discriminante linéaire sur la taille d’effet montre que les genres collinsella, coprococcus, parabactérides, et rhodopseudomonas étaient sensiblement plus abondants dans les échantillons de BIF de culture VI que dans les échantillons d’amidon de culture VI. En outre, les mesures gc montrent SCFAs qui ont été mesurés à partir des cultures de fermentation inclus acétique, propionique, isobutyrique, butyrique, isovaleric, et les acides valeric. Après fermentation pendant 24 heures et 48 heures, cinq des six concentrations de SCFA étaient semblables et non statistiquement différentes entre la culture VI BIF, l’amidon de culture VI, et les groupes de culture VI.

Cependant, les concentrations d’acide proprionique étaient significativement plus élevées dans le groupe de la culture VI BIF que dans le groupe d’amidon de culture VI, après 48 heures de fermentation. Faites cette expérience dans des conditions anaérobies, puis transférez les échantillons fixes dans un incubateur anaérobie dès que possible. Certains des reagents TLC sont dangereux.

Vous devriez faire attention à les utiliser.