Analyse des interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation in vitro de bain
23 août 2019
Décrit ici est un protocole pour étudier les interactions entre les endobiotiques et le microbiote intestinal humain utilisant des systèmes de fermentation in vitro de lot.
Notre protocole peut être largement utilisé pour le criblage élevé et rapide des interactions entre l’endobiotics et le microbiote humain d’intestin. Faible coût et éviter les effets d’interférence du métabolisme de l’hôte. Cette procédure a le potentiel d’être employée dans le diagnostic.
Tout d’abord, dissoudre BIF EPS et amidon individuellement dans l’eau chaude sur un agitateur magnétique pour faire à la fois la concentration de huit grammes par litre. Dans le milieu de culture de base préparé, VI, ajouter 100 millilitres de la solution BIF EPS pour faire de la culture VI solution BIF. Ajouter 100 millilitres de la solution amidon pour faire de la culture VI solution d’amidon.
Autoclave les deux médias avec source de carbone, et le milieu sans source de carbone comme un contrôle, à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Laissez-les refroidir à température ambiante et ajoutez des foins et de la cystéine. Transférer un sous-échantillon de cinq millilitres de chaque milieu vers les tubes de culture.
Et conserver dans un incubateur anaérobie. Stockez les autres médias à quatre degrés Celsius. Pour préparer l’échantillon fécal humain, transférez un gramme d’échantillon fécal frais en 10 millilitres de 0,1 PBS anaérobie molaire au pH sept dans un bécher en verre.
Ensuite, utilisez une tige de verre pour le remuer pour obtenir une boue. Dans une chambre anaérobie, ajouter 500 microlitres de boue fécale filtrée dans les trois supports de fermentation préparés, individuellement. Puis, incuber à 37 degrés Celsius.
Après 24 heures et 48 heures, recueillir deux millilitres d’échantillons fermentés dans la chambre anaérobie. Et puis centrifugeuse à l’extérieur de la chambre à 6000 fois G, pendant trois minutes. Transférez soigneusement les supernatants dans de nouveaux tubes de centrifugeuse qui seront utilisés pour l’analyse de la dégradation du polysaccharide et les mesures des acides gras à chaîne courte.
Conserver les granulés de centrifugation à 80 degrés Celsius. Chargez 0,2 microlitres des supernatants fermentés sur chaque gel de silice pré-enduit 60 TLC plaque d’aluminium et tourbillonner pour se propager. Ensuite, utilisez un sèche-cheveux à l’air chaud pour sécher.
Immerger une extrémité des plaques échantillonnées dans 20 millilitres d’acide formic: n-butanol:solution d’eau pendant plusieurs minutes, jusqu’à ce que l’électrophoresis s’étend presque à l’autre extrémité. Puis sortez les assiettes avec des forceps, et séchez avec un sèche-cheveux. Puis tremper les assiettes dans le reagent orcinol pendant deux minutes pour teindre.
Et sécher à nouveau. Transférer les assiettes dans un four à cuisson à 120 degrés Celsius pour chauffer pendant trois minutes. Prenez ensuite des photos de la plaque pour évaluer la dégradation de l’EPS en mesurant les bandes TLC.
Pour étudier les effets de l’EPS sur la production de SCFA, ajoutez un millilitre des supernatants fermentés aux tubes de centrifugeuse de deux millilitres et ajoutez 0,2 millilitres de 25 poids/volume pour cent d’acide métaphosphorique à chaque échantillon. Vortex pour bien mélanger les solutions. Centrifuger les mélanges à 13 000 fois G pendant 20 minutes.
En attendant, préparez des solutions d’acides acétiques, propioniques, butyriques, isobutyriques, valérianes et isovaleriques de 120 millimolaires dans des tubes. Ajouter ensuite un millilitre de chaque acide préparé à un tube contenant 1,2 millilitres d’acide métaphosphorique de 25 poids/volume pour cent. Et chargez-les dans la bouteille d’échantillon de l’instrument de chromatographie gazeuse comme cocktails standard.
Sortez les tubes de la centrifugeuse et transférez les supernatants dans des tubes frais. Utilisez une seringue équipée d’un filtre de 0,22 micron pour filtrer les supernatants dans de nouveaux tubes pour l’analyse gaz-chromatographie. Dans cette étude, la production d’EPS mucoïde a été observée dans les cultures de longum de bifidobacterium sur des plaques de PYG, après incubation anaérobie pendant 72 heures.
La centrifugation des éraflures de culture, suivie des précipitations d’éthanol et du séchage, a entraîné la collecte d’EPS de cellulose. L’analyse de TLC a indiqué que le taux de dégradation de l’amidon par microbiote fécal humain était plus rapide que celui du BIF EPS. L’analyse principale des coordonnées montre que la culture VI BIF et les groupes d’amidon de culture VI, regroupés séparément les uns des autres, indiquent que la disponibilité de l’EPS et de l’amidon façonne différemment les communautés bactériennes fécales humaines.
L’analyse discriminante linéaire sur la taille d’effet montre que les genres collinsella, coprococcus, parabactérides, et rhodopseudomonas étaient sensiblement plus abondants dans les échantillons de BIF de culture VI que dans les échantillons d’amidon de culture VI. En outre, les mesures gc montrent SCFAs qui ont été mesurés à partir des cultures de fermentation inclus acétique, propionique, isobutyrique, butyrique, isovaleric, et les acides valeric. Après fermentation pendant 24 heures et 48 heures, cinq des six concentrations de SCFA étaient semblables et non statistiquement différentes entre la culture VI BIF, l’amidon de culture VI, et les groupes de culture VI.
Cependant, les concentrations d’acide proprionique étaient significativement plus élevées dans le groupe de la culture VI BIF que dans le groupe d’amidon de culture VI, après 48 heures de fermentation. Faites cette expérience dans des conditions anaérobies, puis transférez les échantillons fixes dans un incubateur anaérobie dès que possible. Certains des reagents TLC sont dangereux.
Vous devriez faire attention à les utiliser.
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Aperçu
Ce protocole étudie les interactions entre les endobiotes et le microbiote intestinal humain à l'aide de systèmes de fermentation en lot in vitro. Il est conçu pour un criblage rapide et à haut débit, tout en minimisant les interférences dues au métabolisme de l'hôte.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Microbiologie
- Santé intestinale
- Métabolomique
Contexte
- Les endobiotiques jouent un rôle crucial dans la santé humaine.
- La microflore intestinale influence considérablement les processus métaboliques.
- La compréhension de ces interactions peut faciliter le diagnostic.
- Les méthodes actuelles peuvent être limitées par les interférences du métabolisme de l'hôte.
Objectif de l'étude
- Développer un protocole pour l'étude des interactions entre endobiotes et microbiote.
- Permettre le criblage à haut débit de ces interactions.
- Proposer une alternative peu coûteuse pour la recherche.
Méthodes utilisées
- Dissoudre les EPS BIF et l'amidon dans l'eau chaude.
- Préparer les milieux de culture pour la fermentation.
- Utiliser des systèmes de fermentation en lot pour les études d'interaction.
- Surveiller les effets des endobiotiques sur la microflore intestinale.
Résultats principaux
- Préparation réussie des solutions de polysaccharides extracellulaires BIF et d'amidon.
- Mise en place d'un protocole de fermentation fiable.
- Démonstration du potentiel du protocole pour les diagnostics.
- Acquisition de connaissances sur les interactions entre les endobiotiques et la microflore.
Conclusions
- Le protocole offre un outil précieux pour la recherche sur le microbiote.
- Il peut faciliter la compréhension des interactions métaboliques.
- Des applications futures pourraient améliorer les capacités diagnostiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole permet un criblage in vitro à haut débit et à faible coût des interactions entre endobiotes et microbiote intestinal, réduisant ainsi la dépendance aux modèles animaux et minimisant les interférences du métabolisme de l'hôte. Il facilite la validation précoce de cibles en fournissant des données quantitatives sur les modifications de la communauté microbienne et la production de métabolites, éléments essentiels pour réduire les risques liés aux thérapeutiques modulant le microbiome. Cette approche s'applique directement aux flux de travail de découverte préclinique, où la compréhension mécanistique des effets des composés sur le microbiote guide le choix des candidats-médicaments et les décisions stratégiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger la manière dont des endobiotes comme les prébiotiques ou les médicaments modulent les communautés bactériennes intestinales humaines, en soutenant le test d'hypothèses ciblées.
- Valeur opérationnelle : Utilise des méthodes accessibles telles que le séquençage de l'ARNr 16S et la quantification des AGCC pour générer des données reproductibles et riches en informations mécanistiques.
- Valeur prédictive : Distingue les réponses microbiennes à des glucides structurellement distincts (par exemple, EPS contre amidon), facilitant l'évaluation des relations structure-activité.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Fournit des conditions standardisées de fermentation anaérobie pour une évaluation cohérente de la dégradation des composés médiée par le microbiote.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec des formats à haut débit grâce à une préparation d'échantillons simple et à des lectures évolutives comme la CCM et la CG.
- Préparation du test : Génère des résultats quantifiables (profils d'acides gras à chaîne courte, modifications communautaires) pouvant être utilisés pour comparer les effets des composés entre différentes campagnes de criblage.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Utilise un inoculum fécal humain, ce qui augmente la pertinence par rapport à la physiologie humaine comparé aux modèles animaux.
- Dérisquage mécanistique : Identifie des micro-organismes spécifiques réagissant aux endobiotes (par exemple, Collinsella, Coprococcus), soutenant ainsi un mécanisme d'action lié à des biomarqueurs.
- Continuité préclinique : Permet une analyse en fonction de la dose et du temps (24 h/48 h) afin de déterminer les fenêtres de sécurité et d'efficacité dans des modèles ultérieurs.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'à l'optimisation des candidats médicaments, en particulier pour les composés actifs sur le microbiome, où la compréhension du métabolisme médié par la microflore est essentielle pour prédire le comportement in vivo.
- Biologie de la découverte : Soutient le criblage fondé sur des hypothèses des endobiotes en associant l'exposition aux composés à des modifications mesurables de la composition et de la fonction microbiennes.
- Criblage : Permet une évaluation rapide des interactions avec la microflore grâce à la chromatographie sur couche mince (CCM) pour la dégradation des polysaccharides et à la chromatographie en phase gazeuse (CPG) pour la quantification des acides gras à chaîne courte, en tant que lectures indépendantes.
- Analytique : Génère des données multivariées (séquençage 16S, concentrations en acides gras à chaîne courte) permettant des comparaisons statistiques des effets des traitements et l'identification de changements significatifs.
- Recherche translationnelle : Utilise une microflore d'origine humaine, améliorant ainsi la fiabilité prédictive pour la translation clinique par rapport aux modèles murins.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole peut être adapté à divers endobiotes (médicaments, prébiotiques, polysaccharides), ce qui en fait une plateforme réutilisable dans différents domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans les interactions microbiote-endobiotique grâce à l'observation directe des profils de dégradation et des microorganismes intervenants.
- Valeur opérationnelle : Un faible coût, un protocole anaérobie et un échantillonnage standardisé améliorent la reproductibilité et la comparabilité entre laboratoires.
- Valeur stratégique : Permet de prendre plus tôt des décisions « go/no-go » en identifiant les métabolismes médiés par le microbiote susceptibles de modifier l'efficacité ou la toxicité d'un médicament.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation des composés selon leur impact sur le microbiote bénéfique et les profils d'acides gras à chaîne courte (SCFA).
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microbiologie anaérobie et en technique stérile pour préserver l'intégrité des échantillons.
- Suppose un accès à des plaques de chromatographie sur couche mince (CCM), à la chromatographie en phase gazeuse et à une infrastructure de séquençage de l'ARNr 16S pour un profilage complet.
- La standardisation entre laboratoires exige un traitement cohérent des donneurs fécaux et des conditions d'incubation anaérobies constantes.
- L'adaptation à d'autres endobiotiques nécessite des tests de solubilité et de stabilité en conditions de fermentation.
- Les limites pratiques incluent la variabilité du microbiote des donneurs et la manipulation soigneuse de réactifs CCM dangereux (par exemple, l'orcinol, l'acide formique).
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Preparation of Fermentation Medium and Human Fecal Sample
1:48
In Vitro Batch Fermentation
2:33
EPS Degradation by Human Fecal Microbiota
3:29
Effects of EPS on SCFA (Short-chain Fatty Acids) Production by Human Intestinal Microbiota
4:41
Results: Degradation by Fermentation
6:24
Conclusion
