Name: Injection dœufs Gryllus bimaculatus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: Découvrez le protocole d'injection d'œufs de grillon Gryllus bimaculatus pour la biologie du développement et la manipulation génomique. Cette méthode fondamentale permet d'étudier l'embryogenèse et l'interférence ARN.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les recherches rapportées dans le cadre de ce projet ont été soutenues par un prix de développement institutionnel (IDeA) de l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM10342 à HH3, et par le numéro de prix de la NSF IOS-1257217 Cge.

1. Configuration et préparation de matériel
REMARQUE: Veuillez consulter le tableau 1 et le tableau des matériaux pour la préparation des solutions, du réactif et des détails de l'équipement.
<ol><li>Installez un microscope disséquant afin de voir les œufs et de guider l'aiguille d'injection. (La figure 1A montre un microscope disséquant équipé de fluorescence.) La capacité de fluorescence est avantageuse mais pas nécessaire.</li>
	<li>Placez un micromanipulateur à 3 axes pour manœuvrer l'aiguille d'injection en place (figure 1A).</li>
	<li>Mettre en place un micro-injecteur avec tube et un porte-aiguille pour injecter de petites quantités de matière (Figure 1A). Utiliser en option une pédale de pied qui n'est pas indiquée dans la figure.</li>
	<li>Concevez et créez un timbre pour créer des puits pour les œufs (Figure 1C) en imprimant l'inverse du motif désiré, soit avec une imprimante 3D ou un graveur laser. REMARQUE: Le timbre d'échantillon imprimé en 3D est de 4,5 cm x 5 cm avec 128, 3 cm x 1 cm x 1 mm de saillie pour la création de puits individuels. Détails sur la façon de faire une variété de moules personnalisables ont été publiés ailleurs16.</li>
	<li>Préparer 10x Tampon d'injection, saline tamponnée HEPES (HBS), et une solution de stock de tetramethylrhodamine Dextran colorant et stocker à 4 oC.</li>
	<li>Préparer des solutions expérimentales à injecter, telles que dsRNA, CRISPR/Cas912, éléments transposables, ARNm plafonné in vitro7,8, agents pharmacologiques17, ZFNs, ou TALENS9.</li>
	<li>Placez du ruban adhésif à double bâton sur plusieurs couches de ruban de laboratoire standard sur une lame de microscope en verre afin de créer une plate-forme d'environ 1 mm au-dessus de la glissière en verre, qui sera utilisée pour retenir les aiguilles pour l'évaluation.</li>
	<li>Préparer un contenant de grillage d'environ 40 cm x 60 cm de taille avec un couvercle possédant une ouverture recouverte de maille pour la circulation de l'air.</li>
	<li>Ajouter de la nourriture, de l'eau et des matériaux d'hébergement.</li>
	<li>Ajoutez plusieurs douzaines de grillons adultes mâles et femelles en bonne santé. Identifiez le cricket adulte par la présence d'ailes. REMARQUE: Une gamme d'âges post-imaginaires peut augmenter les rendements des œufs. La densité des grillons devrait être relativement élevée afin d'être en mesure de recueillir suffisamment d'œufs pour une expérience, mais pas si encombré que le cannibalisme se produit. Par exemple, environ deux douzaines de grillons sains, avec un rapport mâle/femelle à peu près égal, dans un contenant de la taille indiquée ci-dessus devraient être suffisants pour recueillir environ 200 œufs dans une période de un à deux h. Les grillons peuvent être maintenus à température ambiante, mais le développement et le comportement seront optimaux si les grillons sont maintenus dans un incubateur chaud (23,5 à 26 oC), humide (40 à 60 % d'humidité relative).</li>
</ol>2. Fabrication d'aiguilles pour l'injection
<ol><li>Utilisez des capillaires en verre Borosilicate avec filament (voir le tableau des matériaux pour plus de détails de taille). Préparer les aiguilles de traction le même jour, ou jusqu'à quelques jours avant que les injections soient terminées.</li>
	<li>Placez un verre capillaire dans le tire-laur, centrez le verre sur le filament, et serrez les boutons pour fixer le verre en place.</li>
	<li>Définir la température du tire-lasseur près de la température de la rampe de verre (-5 oC à 10 oC).</li>
	<li>Utilisez un protocole à une étape et à haute chaleur pour tirer un long cône avec une petite ouverture, mais éviter de faire fondre les extrémités fermées. REMARQUE: Par exemple, lorsque vous utilisez le tire-micropipette détaillé dans le tableau des matériaux équipé d'un filament de boîte, utilisez les paramètres suivants pour le verre avec une température de rampe de 478 : Chaleur 478; Tirez 45; Vel 75; Del 120. Les conditions optimales pour la production d'une aiguille avec la forme indiquée dans la figure 2B doivent être déterminées empiriquement par chaque utilisateur.</li>
	<li>Conseils d'aiguille de bevel en préparation pour les injections.</li>
	<li>Mouillez le plan de broyeur tournant du beveler (Figure 2A) avec de l'eau qui coule. Utilisez soit l'osmose inverse (RO) soit l'eau distillée traitée par diethylpyrocarbonate (DEPC).</li>
	<li>Placer l'aiguille tirée dans le beveler et tourner à un angle de 20 degrés.</li>
	<li>Baisser l'aiguille jusqu'à ce qu'elle touche juste le plan de meulage et le bevel pendant 2 à 3 min.</li>
	<li>Évaluez le bevel en plaçant l'aiguille bevée sur du ruban adhésif double qui a été collé à une lame de microscope en verre.</li>
	<li>Placez la glissière tenant l'aiguille sur la scène d'un microscope composé équipé d'une caméra et d'un logiciel d'acquisition d'images.</li>
	<li>Acquérir une image de la pointe de l'aiguille à l'aide d'un objectif 20x.</li>
	<li>Utilisez le logiciel d'imagerie pour mesurer le diamètre de lumen intérieur de l'aiguille juste proximale à l'ouverture beveled (Figure 2C). La taille optimale est de 10 m et 2 m.</li>
	<li>Jeter les aiguilles dont l'ouverture est inférieure à 8 m et au-dessus de 12 m.</li>
	<li>Conserver les aiguilles dans un contenant avec un couvercle pour éviter d'être poussiéreux. Utilisez une bande de cire ou un matériau similaire pour élever les aiguilles du fond du récipient afin d'éviter de briser les pointes (Figure 2D).</li>
</ol>3. Collecte et préparation d'oeufs
<ol><li>Maximisez le nombre d'œufs pondus en privant les grillons de tout matériau de ponte humide (flacons d'eau, plats d'œufs) pendant la nuit ou pendant au moins 8 à 10 h avant de tenter de ramasser les œufs. REMARQUE: Puisque les femelles ont la capacité de stocker le sperme intérieurement, une procédure chronométrée différemment peut être nécessaire si la fertilisation soigneusement chronométrée est expérimentalement essentielle18.</li>
	<li>Faire 40 ml d'agarose de 1 % dans l'eau et verser dans un plat de pétri de 10 cm.</li>
	<li>Placer un timbre d'œuf sur la surface de l'agarose avant qu'il ne se solidifie.</li>
	<li>Retirez le timbre, une fois l'agarose solidifié, pour révéler les puits (figure 1C).</li>
	<li>Remplissez la plaque de puits d'agarose avec HBS contenant 1% de pénicilline/Streptomycine.</li>
	<li>Placer le couvercle sur le plat, l'envelopper dans le parafilm et le conserver à 4 oC. REMARQUE: Les plats peuvent être conservés pendant quelques jours à 4 oC, mais doivent être réchauffés à température ambiante avant d'être utilisés pour éviter la condensation.</li>
	<li>Faire un plat de collecte d'œufs pour les grillons pour pondre les œufs en remplissant un plat de 35 mm de pétri avec du sable blanc de terrain de jeu (Figure 1B). REMARQUE: Le sable spécifié dans le Tableau des matériaux est de la taille appropriée du grain. Si les grains de sable sont trop gros, le sable endommagera les œufs.</li>
	<li>Couvrir le plat d'œufs d'un carré de papier essuie-tout coupé d'environ 18 cm x 18 cm, et placer sur le dessus du plat avec du sable. Grâce à cette serviette en papier couvrir le plat rempli avec de l'eau du robinet.</li>
	<li>Inclinez le plat de pétri et pressez doucement le dessus pour enlever l'excès d'eau.</li>
	<li>Placez les coins du carré de serviette en papier sous le plat et placez le plat d'oeufs dans le couvercle inversé, qui aidera à maintenir le couvercle de serviette en papier en place.</li>
	<li>Placer le plat d'œufs dans le bac de cricket et permettre aux femelles adultes d'oviposit oeufs pendant un à deux h. REMARQUE: Le temps relativement court ici assure que tous les œufs seront similaires au stade de développement au moment de l'injection. Si l'injection avant la cellularisation est importante, les injections devraient se produire dans les 14 h de la ponte19.</li>
	<li>Pendant ce temps, laisser le plat d'agarose (à partir de l'étape 3.6) réchauffer à la température ambiante en préparation pour la tenue des œufs pour l'injection.</li>
	<li>Retirer le plat de collecte des œufs, qui contient maintenant des œufs fraîchement pondus, du bac de cricket et retirer le couvercle de papier essuie-tout. Placer une passoire d'une taille de pores de 0,5 à 1 mm sur un bécher d'une capacité d'au moins 500 ml (figure 1B).</li>
	<li>Rincer le contenu du plat de pont (sable et œufs) dans la passoire sous l'eau du robinet en cours d'exécution doucement laisser les grains de sable tomber à travers le maillage de passoire dans l'eau dans le bécher ci-dessous, mais en laissant les œufs de cricket dans le panier de passoire.</li>
	<li>Remplissez un récipient d'eau RO et placez-le dans un plateau. Inverser la passoire sur le récipient et la taper contre le plat pour déloger les œufs dans l'eau. Les œufs s'enfonceront au fond du récipient.</li>
	<li>Couper la pointe d'une pointe de pipette P1000 avec des ciseaux pour faire une ouverture d'environ 3 mm de diamètre. Placez cette pointe sur un pipettor P1000 et utilisez-la pour transférer les œufs du récipient au plat de moule d'oeuf d'agarose, transférant le moins d'eau possible.</li>
	<li>Utilisez une pince à épiler en plastique pour aligner les œufs dans les puits d'agarose remplis de HBS plus 1% de pénicilline/streptomycine. Chaque œuf coulera au fond d'un puits individuel. Couvrir du couvercle du couvercle de la boîte à pétrijusqu'à ce qu'il soit prêt à l'injecter.</li>
</ol>4. Préparer le micro-injecteur
<ol><li>Fixez le micro-injecteur à une source d'air comprimé ou de gaz (ce protocole a été optimisé à l'aide d'air comprimé ou de N2). REMARQUE: Si vous utilisez un réservoir d'air portatif, remplissez à au moins 75 psi. Le réservoir perdra la pression d'air tout au long des injections et peut avoir besoin d'être rempli; les injections deviennent difficiles en dessous de 40psi.</li>
	<li>Allumez le micro-injecteur. Fixez le temps d'injection à 0,17 s et la pression à 10 à 15 psi. REMARQUE: La pression exacte nécessaire dépendra de l'ouverture de l'aiguille et doit être déterminée empiriquement pour chaque cycle d'injection et/ou nouvelle aiguille utilisée.</li>
	<li>Assurez-vous que le bouton BALANCE du micro-injecteur est tourné vers 0 (généralement entièrement dans le sens inverse des aiguilles d'une montre) et que le micro-injecteur est pressurisé et en mode injection.</li>
</ol>5. Injections
<ol><li>Filtrer environ 500 l de tampon d'injection 10x à l'aide d'une seringue de 1 ml et d'un filtre à seringues de 0,45 m.</li>
	<li>Mélanger les réactifs par injection (les détails qui suivent sont pour l'injection de dsRNA préparé comme décrit dans12). REMARQUE: Il peut être conseillé de concevoir et d'effectuer plusieurs contrôles, surtout quand on apprend d'abord cette technique. Poking oeufs sans injection, l'injection tampon - colorant seul, ou l'injection tampon - colorant - un réactif de contrôle (comme eGFP dsRNA) sont tous de bons tests de la façon dont perturbateur divers éléments du protocole d'injection pourrait être. Voir La figure 3 pour la survie d'un certain nombre de contrôles différents.</li>
	<li>Commencez par un dsRNA aliquot de 4 ml.</li>
	<li>Ajouter 0,5 ml du tampon d'injection 10x filtré à l'aliquot dsRNA.</li>
	<li>Ajouter 0,5 mL de 50 mg/mL de rhodathyle tétramé Thyréthyle solution de stock de colorant Dextran. Si vous travaillez sur une portée de dissection sans fluorescence, utilisez Phenol Red à la place.</li>
	<li>Gardez tous les matériaux sur la glace pendant toute la durée de la période d'injection.</li>
	<li>Chargez la solution d'injection dans une aiguille d'injection à l'aide de pointes de chargement de 20 ml et d'un tuyauterie p10.</li>
	<li>Élaborez une solution d'injection de 1,5 ml et insérez la pointe de chargement dans l'extrémité large de l'aiguille d'injection.</li>
	<li>Éjectez la solution aussi loin que possible dans l'aiguille et éliminez les bulles d'air en clignotant doucement; veillez à ne pas casser l'aiguille.</li>
	<li>Placez le plat d'œufs sous le microscope disséquant et sélectionnez un grossissement faible d'environ 10x (1x grossissement vu à travers les objectifs 10x oeil).</li>
	<li>Insérez l'aiguille dans le boîtier d'injection et serrez-la. REMARQUE: Veillez à ce que l'aiguille soit correctement et fermement insérée dans le boîtier. Pour ce faire, tirez l'extrémité large de l'aiguille de retour de la habitation en métal, apportant le tube de silicium dans le boîtier avec elle. Ajustez le tube de silicium de sorte que l'extrémité en verre de l'aiguille dépasse juste au-delà du silicium. Si ce n'est pas fait, le tube de silicium peut être pincé entre le verre et le boîtier en métal, bloquant l'extrémité de l'aiguille.</li>
	<li>Insérez soigneusement le boîtier d'injection avec une aiguille attachée dans le micromanipulateur. Soyez conscient de l'extrémité pointue de l'aiguille et faites attention qu'elle n'est pas heurtée dans les surfaces et cassée.</li>
	<li>Tout en regardant à la fois les œufs et l'aiguille à travers le microscope, déplacer l'aiguille près des œufs dans le coin supérieur gauche de la grille de plat.</li>
	<li>Abaissez l'aiguille jusqu'à ce que la pointe pénètre dans le HBS plus 1% Pénicilline / Streptomycine solution tamponnée dans le plat.</li>
	<li>Centrez l'aiguille dans le champ de vision et déplacez le plat d'œufs de sorte que l'aiguille soit quelques mm plus près du bord du plat que les œufs.</li>
	<li>Ne pas obstruer la vue de la grille d'œufs avec l'aiguille.</li>
	<li>Mettre le microscope au filtre approprié pour la rhodamine afin qu'il soit possible d'observer la fluorescence dans l'aiguille et de se concentrer sur la pointe de l'aiguille.</li>
	<li>Sur le micro-injecteur, tournez lentement le bouton BALANCE dans le sens des aiguilles d'une montre jusqu'à ce que la solution d'injection commence à s'échapper de l'aiguille dans la solution de suspension. Le nombre de solde sur l'écran du micro-injecteur va commencer à augmenter, bien que la valeur numérique n'est pas important. Ensuite, retournez le bouton dans le sens inverse des aiguilles d'une montre légèrement juste jusqu'à ce que le colorant cesse de fuir hors de l'aiguille. REMARQUE: Il est essentiel de définir cet équilibre chaque fois qu'une nouvelle aiguille est utilisée. Sans l'équilibre réglé de manière appropriée, le micro-injecteur continuera à s'injecter pendant un certain temps après le déclenchement de l'injection. Il est même possible qu'une seule pression du bouton d'injection avec une aiguille déséquilibrée entraîne l'expulsion de tout le contenu de l'aiguille chargée.</li>
	<li>Avec l'aiguille centrée dans le champ de vision, déplacer le plat d'oeufs de sorte que l'aiguille est dirigée vers l'œuf à injecter en premier. Il est recommandé que les injections commencent dans un coin de la grille d'œufs disposés, par exemple, le coin supérieur gauche.</li>
	<li>Ajuster le grossissement à environ 50x; à ce grossissement, un seul oeuf remplira la majeure partie du champ de vision.</li>
	<li>Utilisez à la fois le micromanipulateur et la main sur le plat d'œufs pour déplacer l'aiguille en position pour l'injection.</li>
	<li>Avancez l'aiguille à l'aide du micromanipulateur et insérez la pointe de l'aiguille dans le premier œuf à injecter.</li>
	<li>Insérer l'aiguille à une longueur d'œuf de 20 à 30 % à partir de l'extrémité postérieure (blunter) de l'œuf (Figure 1E), perpendiculaire à l'axe long de l'œuf.</li>
	<li>Injecter la solution soit avec la pédale d'injection ou le bouton d'injection sur le micro-injecteur. Un petit bolus de matière fluorescente à l'intérieur de l'œuf indiquera une injection réussie (Figure 1D). REMARQUE: Il n'est pas rare qu'un jaune soit éjecté de l'œuf pendant l'injection (Figure 1F), ce qui n'indique pas nécessairement que l'œuf injecté sera inviable.</li>
	<li>Retirez l'aiguille de l'œuf. Si l'œuf est soulevé involontairement hors de son puits après la rétraction de l'aiguille, utilisez de petits forceps pour pousser l'œuf dans son puits tout en rétractant l'aiguille.</li>
	<li>Si l'aiguille obstrue pendant l'injection, retirer l'aiguille de l'œuf et, en gardant l'aiguille immergée dans le HBS plus 1% de pénicilline/streptomycine solution couvrant les œufs, effacer l'aiguille obstruée en utilisant soit la fonction Clear ou en poussant l'injection bouton.</li>
	<li>En continuant d'utiliser la même aiguille, répétez la procédure d'injection pour autant d'œufs que possible. Au début, ce n'est peut-être qu'environ 20 ou 30 œufs, mais il passera à plus de 100 avec la pratique.</li>
	<li>Si l'aiguille est obstruée et ne peut pas être nettoyée, jetez l'aiguille, remplissez une nouvelle aiguille et recommencez (c.-à-d., retour à l'étape 5.7).</li>
	<li>Conserver le plat d'œufs injectés dans un incubateur chaud (23,5 à 26 oC) légèrement humide (pour minimiser l'évaporation) jusqu'à ce que les embryons aient atteint le stade de développement souhaité pour l'analyse.</li>
	<li>Au moins tous les 24 h, retirer les œufs qui ne sont plus viables (Figure 3A, B), et remplacer la solution de suspension par du SHB frais plus 1 % de pénicilline/streptomycine.</li>
	<li>Deux à trois jours après l'injection, transférez les œufs par pipetilisation douce ou avec des forceps en plastique dans des essuie-tout humidifiés avec du HBS plus 1% de pénicilline/Streptomycine dans un plat de pétri à couvercle pour continuer le développement dans l'incubateur chaud et humide.</li>
	<li>Surveiller les œufs et enlever les œufs qui ne sont plus viables chaque jour (Figure 3A, B).</li>
</ol>

<ol><li>Abzhanov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+there+yet%3F+Tracking+the+development+of+new+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Are we there yet? Tracking the development of new model systems.</a> Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).</li>
<li>Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+August+Krogh+principle%3A+%E2%80%9CFor+many+problems+there+is+an+animal+on+which+it+can+be+most+conveniently+studied%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology+Part+B%3A+Molecular+and+Developmental+Evolution%22%5BJournal%5D)">The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied.</a> Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).</li>
<li>Krogh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Progress+of+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Progress of Physiology.</a> American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).</li>
<li>Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+F+%22Cricket+neurobiology+and+behavior%22">Cricket neurobiology and behavior</a>. , Cornell University Press. Ithaca. (1989).</li>
<li>Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHorch%2C+HW+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22">The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior</a>. , Springer. Tokyo. (2017).</li>
<li>Misof, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenomics+resolves+the+timing+and+pattern+of+insect+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution.</a> Science. 346 (6210), 763-767 (2014).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+transgenic+cricket+embryos+reveals+cell+movements+consistent+with+a+syncytial+patterning+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism.</a> Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).</li>
<li>Shinmyo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-mediated+somatic+transformation+of+the+two-spotted+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-transgenic+genome+modifications+in+a+hemimetabolous+insect+using+zinc-finger+and+TAL+effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases.</a> Nature communications. 3, 1017(2012).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).</li>
<li>Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+crickets+for+the+study+of+learning+and+memory%3A+Dopamine+receptor+Dop1+mediates+aversive+but+not+appetitive+reinforcement+in+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets.</a> Scientific Reports. 5, 15885(2015).</li>
<li>Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+in+the+Cricket%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cricket+as+a+Model+Organism%3A+Development%2C+Regeneration%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Protocols in the Cricket.</a> The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).</li>
<li>Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Editing+in+the+Cricket%2C+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Editing+in+Animals%22%5BJournal%5D)">Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus.</a> Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).</li>
<li>Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch%2FDelta+signalling+is+not+required+for+segment+generation+in+the+basally+branching+insect+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus.</a> Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).</li>
<li>Miyawaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Wingless%2FArmadillo+signaling+in+the+posterior+sequential+segmentation+in+the+cricket%2C+Gryllus+bimaculatus+%28Orthoptera%29%2C+as+revealed+by+RNAi+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis.</a> Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).</li>
<li>Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+live-imaging+of+embryos+in+microwell+arrays+using+a+modular+specimen+mounting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system.</a> Biology Open. 7 (7), bio031260(2018).</li>
<li>Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+is+required+for+the+generation+of+primordial+germ+cells+in+an+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect.</a> Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).</li>
<li>Larson, E., Andres, J., Harrison, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+male+ejaculate+on+post-mating+prezygotic+barriers+in+field+crickets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets.</a> PLOS ONE. 7 (10), e46202(2012).</li>
<li>Donoughe, S., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> Developmental Biology. , (2016).</li>
<li>Matsuoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+germ+insects+utilize+both+the+ancestral+and+derived+mode+of+Polycomb+group-mediated+epigenetic+silencing+of+Hox+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes.</a> Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).</li>
<li>Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+and+tails%3A+Evolution+of+antero-posterior+patterning+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects.</a> Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).</li>
<li>Bacon, J., Strausfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+resolution+of+neuron+arrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomical+Techniques%3A+Insect+Nervous+System%22%5BJournal%5D)">Nonrandom resolution of neuron arrangements.</a> Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Les deux principaux défis de cette technique sont les questions connexes de taille optimale des aiguilles et de la survie. Bien que les aiguilles plus petites améliorent la survie, les aiguilles avec des lumens plus étroits ont un plus grand degré de forces capillaires à l'œuvre, ce qui rend plus probable que le jaune se déplacera dans l'aiguille provoquant son obstruement. Dans le meilleur des cas, les blocages peuvent être éliminés simplement en injectant un autre œuf ou en dégageant l'aiguille comme décrit ci-dessus. ...

La capacité de modifier le génome ou d'influencer l'expression des gènes dans les organismes est à la base de la conception de nombreux types d'expériences testant la causalité fonctionnelle. Il est également essentiel pour les travaux comparatifs et évolutionnaires que les techniques de modification génomique et non génomique soient disponibles dans les organismes en dehors des systèmes traditionnels de modèle animal de laboratoire génétique (par exemple, Mus musculus, Danio rerio, Drosophila melanogaster, et Caenorhabditis elegans). Qu'il s'agisse du désir de comprendre la diversité organistique1 ou de l'adhésion au principe de Krogh, que pour chaque question biologique il existe un organisme le mieux adapté à sa solution2,3, la capacité de modifier les génomes ou l'influence de l'expression de gène est essentielle pour des conceptions expérimentales modernes.
Le cricket Gryllus bimaculatus est un système modèle émergent. Utilisé pour le siècle dernier dans les expériences de neuroéthologie4, les deux dernières décennies ont été témoins d'un intérêt expérimental accru pour le cricket, en particulier axé sur l'évolution et le développement de cet organisme5. Le cricket est un insecte hémimétabolous qui se ramifie basally à des insectes holometabolous bien étudiés, tels que D. melanogaster et Tribolium castaneum6. En raison de sa position utile sur l'arbre évolutif, les scientifiques sont intéressés à poser des questions expérimentales modernes et sophistiquées dans cet insecte, ce qui a conduit à un intérêt croissant dans l'adaptation des outils moléculaires pour l'utilisation dans G. bimaculatus.
Les injections de réactifs moléculaires dans les œufs de cricket peuvent être utilisées pour des expériences de modification génomique ainsi que des manipulations non génomiques de l'expression génique chez les embryons. Par exemple, transgénique G. bimaculatus portant des insertions eGFP ont été créés à l'aide de la transposase piggyBac7,8. Les chercheurs ont réussi à créer des nucléases knock-out G. bimaculatus à l'aide de nucléases de zinc-doigt (ZNN) et d'activateurs de transcription (TAL) nucléases effecteurs (TALENs) pour introduire des pauses à double brin dans des régions génomiques spécifiques9. Bien que les ZFN et les TALEN permettent un ciblage spécifique au site chez les animaux au-delà des quatre grands systèmes modèles, ces réactifs ont rapidement été dépassés par le système CRISPR/Cas9, qui est plus simple à utiliser, plus efficace et très flexible10. CRISPR a été utilisé dans G. bimaculatus pour produire knock-out11 ainsi que knock-in lignes12,13 En plus de la modification génomique, dsRNA peut être injecté dans les œufs pour renverser l'expression de l'ARNm en développement embryons, permettant aux chercheurs de comprendre le rôle de transcriptions spécifiques tout au long du développement14,15. Quelques détails limités sur la façon d'injecter des œufs de cricket ont été publiés précédemment12.
Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour injecter les oeufs tôt de G. bimaculatus. Ce protocole est efficace et facilement adaptable à divers milieux de laboratoire, matériaux d'injection, et peut-être à d'autres insectes. Bien que des détails supplémentaires pour la conception et la mise en œuvre de modifications génomiques et d'expériences de renversement ont été publiés ailleurs12,13, ces approches finiront par s'appuyer sur le protocole d'injection détaillé ici.

<table><tbody><tr><td>Microscope de dissection fluorescent</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Stéréomicroscope avec fluorescence</td></tr><tr><td>Source de lumière externe pour la fluorescence</td><td>Micro-injecteur Leica</td><td>EL 6000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narishige</td><td>IM-300</td> <td>Les accessoires peuvent inclure un porte-aiguilles d’injection, un tuyau d’entrée (avec un connecteur de tuyau), un cordon d’alimentation secteur, une pédale de commande, un joint en caoutchouc de silicone-mCube</td></tr> <tr><td></td><td>de filtre en cerisierLeica</td><td>M205FA/M165FC</td><td>Le cube de filtre pour mCherry ou un colorant rouge similaire fonctionnera</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td>Utilisé avec support magnétique (Narishige, type GJ-8)</td></tr><tr><td>Support magnétique</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Porte-pipette (porte-aiguille)</td><td>Tube Narishige</td><td>HD-21</td><td></td></tr><tr><td>pour connecter la source d’air au micro-injecteur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon de puits d’œuf</td><td>imprimé en 3D</td><td>imprimé en</td><td>3D personnalisé sur un Lulzbot Taz 5 à l’aide d’un thermoplastique</td></tr> <tr>d’acide polylactique<td>Micro-ondes</td><td>divers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubateur ou pièce à température contrôlée</td><td>diverses</td><td></td><td>Températures de 23,5-26 &deg ; C sont nécessaires.</td></tr><tr><td>Nourriture pour grillons</td>, <td>divers</td><td></td><td>aliments pour chats ou flocons de poisson sont des aliments appropriés.</td></tr><tr><td>L’eau de cricket</td><td>peut</td><td>être conservée dans des flacons et présentée aux grillons à travers des boules de coton</td>Abri de cricket arious Les matériaux de l’abri peuvent inclure des serviettes en papier froissées ou des cartons d’œufs Tubes capillaires en verre World Precision Instruments, Inc.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Réf. 1B100F-4</td><td>Kwik-Fil&trade ; Capillaires en verre borosilicaté, longueur 100 mm, diamètre intérieur 0,58 mm, diamètre extérieur 1,0 mm, avec</td></tr><tr><td>extracteur de micropipette</td> à filament <td>Flaming/Brown</td><td>Modèle P-97</td><td>Distribué par Sutter Instrument Co.</td></tr><tr><td>Biseauteur/Micro-broyeur</td><td>Narishige</td><td>Modèle EG-45/EG-400</td><td>EG-400 comprend une tête de microscope</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>CellTreat</td><td>Code produit 229693</td><td>90 mm de diamètre</td></tr><tr><td>Play Sand</td><td>Sandtastik Products Ltd.</td><td>B003U6QLVS</td><td>Sable blanc</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>AB000972 bioanalytique américaine</td><td></td><td>Agarose GPG/LE</td></tr><tr><td>passoire à œufs ultra-pure : Filtre conique en acier inoxydable à mailles sergées extra fines Filtres coniques en acier inoxydable</td><td>US Kitchen Supply</td><td>Modèle SS-C123</td> La <td>taille des pores doit être comprise entre 0,5 et 1,0 mm</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>Ref 15070-063</td> Pince à épiler en plastique pour <td>streptocoque</td></tr><tr><td></td><td>Sipel Electronic SA</td><td>P3C-STD</td><td>Noir Dissipateur d’électricité statique, filtres à seringue de 118 mm</td></tr><tr><td>, diamètre 25 mm, 0,45 & micro ; m</td><td>Nalgene</td><td>725-2545</td> À <td>utiliser avec une seringue de 1 mL</td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL, avec embout à glissement de tuberculine</td><td>Becton Dickinson</td><td>309602</td><td>À utiliser avec un filtre de seringue pour filtrer le tampon d’injection, les seringues à embout Luer-Lok fonctionneraient également</td></tr><tr><td>Réservoir d’air (facultatif)</td><td>Midwest Products</td><td>Air Works&reg ;</td><td>Réservoir d’air portable</td></tr><tr><td>Colorant à la rhodamine</td><td>Thermofisher</td><td>D-1817</td><td>dextran, tétraméthylrhodamine 10 000 MW,</td></tr> <tr><td>20 mL conseils de chargement</td><td>Eppendorf</td><td>N° d’article 5242 956.003</td><td>epT.I.P.S. 20 &mu ; L Microloader</td></tr><tr><td>Microscope composé</td><td>Zeiss</td><td>Axioskope 2 plus</td><td></td></tr><tr><td>objectif 20x</td><td>Ziess</td><td>Plan-Apochromat 20x/0.75 M27</td><td></td></tr><tr><td>Appareil photo</td><td>Leica</td><td>DMC 5400</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite</td> logiciel <td>Leica</td><td>LAS</td><td>Version 4.6.2 utilisé ici</td></tr></tbody></table>

injection d'œufs gryllus bimaculatus

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

La modification de la fonction génique dans un organisme en développement est au cœur de différents types d'expériences. Bien que des outils génétiques extrêmement puissants aient été développés dans les systèmes modèles traditionnels, il est difficile de manipuler des gènes ou de l'ARN messager (ARNM) dans la plupart des autres organismes. Dans le même temps, les approches évolutives et comparatives reposent sur une exploration de la fonction génique chez de nombreuses espèces différentes, nécessitant le développement et l'adaptation de techniques de manipulation de l'expression en dehors de la situation actuellement génétiquement traitable. espèce. Ce protocole décrit une méthode d'injection de réactifs dans les œufs de cricket pour évaluer les effets d'une manipulation donnée sur le développement embryonnaire ou larvaire. Des instructions sur la façon de recueillir et d'injecter des œufs avec des aiguilles bevées sont décrites. Cette technique relativement simple est flexible et potentiellement adaptable à d'autres insectes. On peut recueillir et injecter des dizaines d'œufs en une seule expérience, et les taux de survie pour les injections de tampon seulement s'améliorent avec la pratique et peuvent être aussi élevés que 80%. Cette technique soutiendra plusieurs types d'approches expérimentales, y compris l'injection d'agents pharmacologiques, l'ARNm plafonné in vitro pour exprimer des gènes d'intérêt, l'ARN à double brin (dsRNA) pour obtenir des interférences d'ARN, l'utilisation de grappes régulièrement répétitions palindromic courtes interspatiales (CRISPR) de concert avec des réactifs de protéines 9 (Cas9) associés au CRISPR (Cas9) pour la modification génomique, et des éléments transposables pour générer des lignes transgéniques transitoires ou stables.

Les grillons pondent facilement des œufs dans le matériau humide, et fournir des matériaux adéquats, comme le sable humide ou la saleté, les incite à pondre un grand nombre d'œufs. Ceci est particulièrement efficace si les grillons sont d'abord privés de matériel de ponte pendant 8 à 10 h. Les œufs pondus dans du sable propre peuvent être facilement séparés, recueillis (figure 1B) et placés dans des puits d'œufs conçus sur mesure pour être injectés (<strong c...

Ici, nous présentons un protocole pour injecter des œufs de cricket, une technique qui sert de méthode fondamentale dans de nombreuses expériences dans le cricket, y compris, mais sans s'y limiter, l'interférence de l'ARN et la manipulation génomique.

Injection d'œufs Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Cette technique sert de méthode de base pour les expériences conçues pour apaiser le développement embryonnaire ou larvaire du cricket. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est flexible et qu’elle soutiendra plusieurs types d’approches expérimentales, telles que celles utilisant l’interférence arn ou la manipulation génomique. Hadley Wilson Horch, chercheuse principale au laboratoire, démontrera la procédure.Pour commencer cette procédure humide le plan de broyeur de filature du biseau avec de l’eau qui coule. Placez l’aiguille tirée dans le biseau et tournez-la à un angle de 20 degrés. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche simplement la plaque de broyage et biseauté pendant deux à trois minutes.Évaluez le biseau en plaçant l’aiguille biseauté sur du ruban adhésif double qui a été adhéré à une lame de microscope en verre. Placez la diapositive sur la scène d’un microscope composé équipé d’un logiciel d’acquisition d’appareils photo et d’images. Acquérir une image de l’aiguille à l’aide d’un objectif 20x.Utilisez le logiciel d’imagerie pour mesurer le diamètre intérieur lumen de l’aiguille juste proximale à l’ouverture biseauté. Jetez les aiguilles dont l’ouverture est inférieure à huit micromètres ou supérieure à 12 micromètres. Tout d’abord, faire 40 millilitres de 1% agarose dans l’eau et le verser dans une boîte de 10 centimètres Petri.Placer un timbre de puits d’œuf à la surface de l’agarose avant qu’il ne se solidifie. Une fois l’agarose solidifiée, retirez le timbre pour révéler les puits. Ensuite, remplissez la plaque de puits agarose avec HBS contenant 1% de streptomycine de pénicilline.Placez le couvercle sur le plat, enveloppez-le dans parafilm et rangez-le à quatre degrés Celsius. Après cela, remplissez une boîte de Petri de 35 millimètres de sable blanc de terrain de jeux pour faire un plat de collecte d’oeufs pour les grillons à pondre des œufs po Couvrir le plat d’oeufs d’un carré de serviette en papier coupé à environ 18 par 18 centimètres.Remplir d’eau du robinet à travers la serviette en papier. Ensuite, inclinez la boîte de Pétri et pressez doucement le dessus pour enlever l’excès d’eau. Rentrez les coins du carré de serviette en papier sous le plat et placez le plat d’oeufs dans un couvercle inversé qui aidera à maintenir la serviette en papier en place.Placer le plat d’oeufs dans le bac de cricket et laisser les femelles adultes oviposit les œufs pendant une à deux heures. Pendant ce temps, laisser chauffer le plat d’agarose à température ambiante en vue de la tenue des œufs pour injection. Une fois prêt, retirer le plat de collecte des œufs, qui contient maintenant des œufs fraîchement pondus, du bac de cricket.Retirer l’essuie-tout et placer une passoire avec une taille de pore comprise entre 0,5 et un millimètre sur un bécher. Rincer le contenu du plat de ponte dans la passoire sous l’eau du robinet qui fonctionne doucement. Les grains de sable tomberont à travers la maille de la passoire dans le bécher ci-dessous tandis que les oeufs de cricket resteront dans le panier de passoire.Remplissez un récipient d’eau d’osmose inverse et placez-le dans un plateau. Inverser la passoire sur le récipient et la tapoter contre le plat pour déloger les œufs dans l’eau. Les œufs couleront au fond du récipient.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper la pointe d’une pointe de pipette P1000 pour faire une ouverture d’environ trois millimètres de diamètre. Placez cette pointe sur un pipetter P1000, et utilisez-le pour transférer les oeufs du récipient au plat de moules à oeufs agarose. À l’aide d’une pince à épiler en plastique, aligner les œufs dans les puits agarose.Chaque œuf coulera au fond d’un puits individuel. Couvrir la boîte de Pétri d’un couvercle jusqu’à ce qu’elle soit prête à s’injecter. Pour commencer, placez le plat d’œufs sous le microscope disséquant et sélectionnez un faible grossissement d’environ 10x.Dessinez 1,5 microlitres de solution d’injection à l’aide de 20 conseils de chargement de microlitres et d’une pipette P10 et insérez la pointe de chargement dans l’extrémité large de l’aiguille d’injection. Expulser la solution d’injection dans l’aiguille d’injection. Insérez l’aiguille dans le boîtier d’injection et serrez-la, en vous assurant que l’aiguille est correctement et fermement insérée dans le boîtier.Insérez ensuite soigneusement le boîtier d’injection dans le micromanipulateur, en prenant soin de ne pas casser ou d’être blessé par l’aiguille. Tout en regardant les oeufs et l’aiguille à travers le microscope, déplacez l’aiguille près du X dans le coin supérieur gauche de la grille de vaisselle. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce que la pointe entre dans le HBS plus la solution tamponnée de streptomycine de pénicilline dans le plat.Centrer l’aiguille dans le champ de vision et déplacer le plat d’oeufs de sorte que l’aiguille est de quelques millimètres plus près du bord du plat que les œufs. Après cela, réglez le microscope sur le filtre approprié pour rhodamine pour observer la fluorescence dans l’aiguille et se concentrer sur sa pointe. Sur le microinjecteur tourner lentement le bouton d’équilibre dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que la solution d’injection commence à s’échapper de l’aiguille dans la solution de suspension.Puis tournez le bouton en arrière dans le sens inverse des aiguilles d’une montre légèrement jusqu’à ce que le colorant cesse juste de fuir de l’aiguille. Avec l’aiguille toujours centrée dans le champ de vision, déplacer le plat d’oeufs de sorte que l’aiguille est dirigée vers l’œuf à injecter en premier. Ajustez le grossissement à environ 50x de sorte qu’un seul œuf remplit la majeure partie du champ de vision.Utilisez à la fois le micromanipulateur et la main sur le plat d’oeufs pour déplacer l’aiguille en position pour l’injection. Utilisez le micromanipulateur pour faire avancer l’aiguille et insérer la pointe dans le premier œuf à être injecté, en vous assurant d’insérer l’aiguille à 20 à 30% de la longueur de l’œuf de l’extrémité postérieure de l’œuf perpendiculairement au long axe de l’œuf. Injectez la solution avec la pédale d’injection ou le bouton d’injection sur le microinjecteur.Un petit bolus de matériel fluorescent à l’intérieur de l’œuf indiquera une injection réussie. Après cela, retirer l’aiguille de l’œuf. Si l’œuf est soulevé involontairement hors de son puits après la rétractation de l’aiguille, utilisez de petits forceps pour pousser l’œuf dans le puits tout en rétractant l’aiguille.Dans cette étude, les œufs de cricket sont injectés à l’aide d’une technique qui sert de méthode de base dans de nombreuses expériences, y compris, sans s’y limiter, l’interférence arn et la manipulation génomique. Le taux de survie est un paramètre important pour évaluer le succès de cette expérience. La plupart des œufs morts peuvent facilement être identifiés par la vue que le jaune et le tissu embryonnaire dans l’œuf commencent à s’agglutiner inégalement, et finalement la plupart du jaune migrera vers un côté de l’œuf.Lorsqu’ils ont été évalués après quatre à six jours, plus de 85 % des œufs non injectés ont survécu, tandis que les œufs injectés avec des réaignants expérimentaux avaient généralement un taux de survie inférieur. Le contrôle de tous les aspects de l’injection elle-même, y compris la ponction de l’aiguille, l’introduction de colorant et de tampon, ou la présence d’ARN de véhicule ou de double brin, est nécessaire afin de comprendre les véritables effets de la manipulation expérimentale tentée. La façon dont on évalue les résultats phénotypiques de l’injection dépend de ce qui a été injecté.Par exemple, les changements phénotypiques à la suite de renversements spécifiques de l’ARNm peuvent être évidents au niveau de l’anatomie brute. Si, d’autre part, un cDNA codant un gène EGFP marqué histone 2B sous le contrôle d’un promoteur d’actine G.bimaculatus est inséré dans le génome du cricket à l’aide de la transposase de ferroutage, il devient possible de visualiser chaque noyau de l’œuf à l’aide de fluorescence pour exciter la protéine hist 2B taguée EGFP. Ajuster l’équilibre de sorte que les aiguilles ne obstruent pas est une étape critique dans cette procédure.Vous devrez peut-être faire plusieurs ajustements après les injections subséquentes puisque le jaune obstrue parfois la pointe de l’aiguille. Le cricket est un insecte hémimétabolique qui se ramifie basiquement à des insectes holométaboliques bien étudiés tels que Drosophila. L’étude du développement du cricket nous aidera à mieux comprendre l’évolution et le développement à travers le règne animal.Cette technique demande un peu de pratique. Nous recommandons de pratiquer des injections de contrôle jusqu’à ce que le taux de survie quatre ou cinq jours après l’injection soit d’au moins 80%

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Schistosoma mansoni oeufs sont des stimulateurs efficaces du type T auxiliaire 2 (Th2) la réponse immunitaire, caractéristique d'une infection parasitaire, l'asthme et l'inflammation allergique. Ce protocole utilise S. mansoni œuf d'injection afin de générer un taux de CD4 Th2 induite par les cytokines réponse inflammatoire dans les poumons, caractérisée par la formation de granulomes pulmonaires autour de l'oeuf, l'éosinophilie et l'activation des macrophages alternative.

En utilisant des oeufs de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; En tant que<em&gt; In vivo</em&gt; Modèle de l&#39;inflammation pulmonaire induite par les helminthes

La méthode décrite ici utilise l'injection directe de bactéries entomopathogènes dans le hémocèle...

L&#39;élevage et de l&#39;injection de<em&gt; Manduca sexta</emLes larves&gt; pour évaluer la virulence bactérienne

La micro-injection est une technique couramment utilisée pour fournir des constructions d'ADN, ARNm, des oligonucléotides morpholino antisens ou d'autres traitements dans les œufs, les embryons et les cellules de diverses espèces.

À haut débit microinjections oursins zygotes

La mouche méditerranéenne des fruits (medfly) Ceratitis capitata (Diptera : Tephritidae) est un ravageur mondial de l’agriculture. Une meilleure compréhension de sa biologie est essentielle pour contrôler les populations de mouches et ainsi réduire l’impact économique. La micro-injection embryonnaire est un outil fondamental permettant à la fois la transformation de la lignée germinale et l’étude de la génétique inverse chez cette espèce.

Livraison de Nucleic Acids par Embryo microinjection dans le monde entier agricole contre les insectes ravageurs,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Microinjection d’embryons Nasonia vitripennis est un procédé essentiel pour générer des modifications héréditaires génome. Décrite ici est une procédure détaillée pour la microinjection et la transplantation d’embryons Nasonia vitripennis , ce qui facilitera grandement la manipulation du génome futur chez cet organisme.

Microinjection de l’embryon et de la Technique de Transplantation pour la Manipulation du génome Nasonia vitripennis

Nous présentons ici des protocoles pour la collecte et microinjecting maïs precellular embryons de la chrysomèle des racines du afin d’effectuer des analyses génomiques fonctionnelles telles que la transformation de la lignée germinale et CRISPR/Cas9-génome édition.

Microinjection de Western chrysomèle des racines du maïs, Diabrotica virgifera virgifera, embryons de Transformation de la lignée germinale, ou d’édition de génome CRISPR/Cas9

Les auteurs décrivent les approches pour la manipulation des gènes dans le système de modèle évolutionniste Astyanax mexicanus. Trois techniques différentes sont décrites : Tol2 médiée par transgénèse, manipulation ciblée du génome à l’aide de CRISPR/Cas9 et précipitation d’expression utilisant les morpholinos. Ces outils devraient faciliter l’enquête directe des gènes qui sous-tendent la variation entre les formes de surface - et cavernicoles.

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

Nous fournissons un protocole détaillé pour l’élevage, la microinjection des œufs et pour l’accouplement efficace du firebrat Thermobia domestica pour générer et maintenir des souches mutantes après l’édition du génome.

Microinjection d’oeufs et accouplement efficace pour l’édition du génome dans le Firebrat Thermobia domestica

Voici des protocoles pour la collecte et la microinjection d’embryons de cicadelles de maïs précellulaires dans le but de modifier leur génome via l’édition du génome basée sur CRISPR / Cas9 ou pour l’ajout d’éléments transposables marqués par transformation germinale.

Microinjection de cicadelle de maïs, Peregrinus maidis, embryons pour l’édition du génome CRISPR / Cas9

Cet article décrit les méthodes de base pour normaliser des facteurs importants tels que la densité, la disponibilité des aliments, la source d’hydratation et les contrôles environnementaux pour l’élevage à long terme de cultures de laboratoire du grillon comestible, Gryllus bimaculatus.

Maintenir les cultures de laboratoire de Gryllus bimaculatus, un modèle orthoptère polyvalent pour l’agriculture des insectes et la physiologie des invertébrés

Le présent protocole décrit une méthode d’injection d’embryons de tiques. L’injection d’embryons est la technique préférée de manipulation génétique pour générer des lignées transgéniques.

Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis

Découvrez le protocole d'injection d'œufs de grillon Gryllus bimaculatus pour la biologie du développement et la manipulation génomique. Cette méthode fondamentale permet d'étudier l'embryogenèse et l'interférence ARN.

Injection d'œufs Gryllus bimaculatus

Explorer plus de vidéos