Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

Notre protocole décrit les méthodes d’expression et de purification efficaces du domaine FAH contenant des protéines mais aussi des protéines en général. FHD protein-1 joue un rôle de régulation dans le cycle TCA et le métabolisme énergétique des mitochondries. Nous avons pu associer la downregulation FHD-1 à la sénescence cellulaire et des informations sur l’activité enzymatique et la structure protéique sont généralement nécessaires afin de comprendre les mécanismes moléculaires derrière les phénotypes observés.

Le principal avantage de l’expression des protéines par l’intermédiaire de systèmes vectoriels inductibles IPTG est que toutes les méthodes sont relativement bon marché et faciles à établir dans n’importe quel laboratoire. En utilisant des protéines de type poly-histidine en combinaison avec des résines d’agarose NTA nickel, l’immense sélectivité de la chromatographie d’affinité peut être utilisée à faible coût. Pour la plupart des fins, les protéines obtenues à cette qualité peuvent déjà suffire.

FPLC sur les autres mains, est une méthode bien établie et générale avec plusieurs avantages par rapport à d’autres méthodes. Tout d’abord, insérez de cinq à 10 nanogrammes de plasmide dans 100 microlitres de bactéries BL21-DE3 pLysS E.coli compétentes sur la glace. Appuyez légèrement sur le tube pour mélanger le contenu.

Gardez les bactéries sur la glace pendant 30 minutes, en tapant doucement sur le tube toutes les quelques minutes. Chauffer un thermo-shaker à 42 degrés Celsius. Placez le tube contenant les bactéries dans l’appareil et chauffez pendant 90 secondes.

Ensuite, placez le tube sur la glace immédiatement. Après cinq à dix minutes sur la glace, ajouter 600 microlitres de NZCYM moyen et placer le tube dans un incubateur de bactéries. Secouez le tube à vitesse moyenne orienté le long de la direction secouant à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après incubation, plaque 200 microlitres de la culture bactérienne sur une plaque d’agar de 10 centimètres LB contenant les antibiotiques de sélection de choix. Culture des bactéries sur la plaque d’agar LB dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après la formation réussie de la colonie, choisissez une seule colonie et dispersez-la en cinq millilitres de NZCYM avec les antibiotiques sélectionnés.

Culture dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après une croissance bactérienne réussie, amplifier les bactéries en lots de 250 millilitres, 500 millilitres ou un litre de milieu selon la demande de protéines. Ensuite, la culture de la bactérie, dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius pendant deux à trois heures.

Après l’incubation, dessiner un échantillon pour l’analyse photométrique. Si la densité optique à 600 nanomètres a atteint 0,4, appliquer 200 micromolaires jusqu’à un millimolaire d’isopropyl-bêta-D-thiogalactopyranosid. Après trois à cinq heures de plus dans l’incubateur de bactéries à 37 degrés Celsius expression des protéines est épuisé.

Récoltez la pastille bactérienne par centrifugation à 5000 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, jetez le supernatant et congelez la pastille à moins 20 degrés Celsius pour un bref stockage. Pour chaque 250 millilitres de suspension bactérienne originale, appliquez cinq millilitres du tampon sélectionné sur la pastille bactérienne.

Ajouter 10 microlitres de bêta-mercaptoéthanol par cinq millilitres de tampon appliqué. Utilisez un tuyau Pasteur de 10 millilitres pour forcer mécaniquement la pastille en suspension en grattant et en pipetting. Transférer toute la suspension dans un tube de 50 millilitres.

Puis sonicate la suspension. Ensuite, centrifugeuse pendant 30 minutes à grande vitesse à quatre degrés Celsius. Filtrer le supernatant consécutivement avec des unités filtrantes sur la glace.

Préparez une colonne en plastique ou en verre vide en l’attachant à un retenue stable et en lavant avec un tampon de fonctionnement NTA nickel. Pour chaque 10 millilitres de suspension protéique appliquer 500 microlitres de boue d’agarose NTA nickel à la colonne. Remplissez complètement la colonne avec du tampon de fonctionnement nickel NTA assurant de ne pas perturber la résine agarose et de permettre au tampon de passer par gravité.

Ensuite, appliquez la suspension protéique sur la colonne et laissez l’échantillon passer par gravité. Une fois l’échantillon passé, remplissez la colonne d’un tampon de fonctionnement nickel NTA. Placez une cuvette transparente UV sous la colonne et recueillez un millilitre de tampon d’élitution NTA nickel.

Vérifiez la densité optique de l’échantillon à 280 nanomètres par rapport à un échantillon vierge. De façon optimale, l’échantillon affiche une densité optique supérieure à 2,5. Étant donné que les protéines FAHD et le tampon d’élitution du nickel NTA se précipiteront lors de la congélation et de la décongélation, dialysez la protéine contre un tampon différent pendant la nuit sur la glace à l’aide d’un microlitre de TNT par 100 millilitres de tampon de dialyse.

Mettre en place un système FPLC et laver la colonne avec cinq volumes de colonne de 20% d’éthanol suivie de cinq volumes de colonne d’eau. Après avoir équilibré la colonne, appliquez l’échantillon dialysé sur la colonne et recueillez le flux à travers. Configurer une elution de gradient.

Une fois le gradient terminé, courez avec un tampon de sel élevé jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de pics détectés sur la plage d’un volume de colonne. Démarrez un lecteur de micro-plaques et équilibrez pendant 30 minutes à 25 degrés Celsius. Préparez un millilitre d’une solution de 20 millimlaires d’un substrat à tester dans le tampon d’analyse enzymatique.

Selon le schéma de pipetage dans le protocole de texte, préparer l’enzyme vierge et échantillonner les puits en pipetant 90 microlitres de tampon d’analyse enzymatique dans les puits avec cinq microlitres de solution enzymatique. Ensuite, préparez le substrat vierge et échantillonner les puits en pipetant 95 microlitres de tampon d’analyse enzymatique dans les puits. Juste avant de mesurer, appliquez cinq microlitres de tampon d’analyse enzymatique sur les six puits vierges.

Appliquer cinq microlitres de la solution de substrat de 20 millimlaires sur les puits de l’échantillon. Utilisez un pipet multicanal à réglage de 50 microlitres pour mélanger délicatement les puits. Ensuite, insérez la plaque dans le lecteur de micro-plaque et mesurez chaque puits à 255 nanomètres.

Enfin, effectuez l’analyse dans une feuille de calcul. Deux exemples de plaques d’agar LB après transformation optimale et non optimale sont représentés ici. Trop de colonies bactériennes indiquent soit que deux nombreuses bactéries ont été plaquées, soit que les antibiotiques peuvent être expirés.

Trop peu de colonies bactériennes peuvent indiquer que ni assez de plasmide n’a été utilisé pour la transformation, soit que trop d’antibiotiques ont été utilisés pour sélectionner les bactéries. La pastille bactérienne contenant la protéine exprimée en quantités milligrammes est récoltée et l’expression est vérifiée via la page SDS. Certains problèmes peuvent survenir au cours de ce processus autrement simple, y compris les protéines formant des organismes d’inclusion ou la protéine n’étant pas exprimée.

Si un his-tag est utilisé pour étiqueter la protéine, la chromatographie d’affinité avec le nickel NTA agarose est une méthode de capture facile et bon marché éliminant la majorité des contaminations. Si aucune étiquette n’est utilisée, une combinaison de précipitations de sulfate d’ammonium et d’une chromatographie d’échange hydrophobe consécutive peut également séparer la protéine de la majorité des autres protéines. La protéine est encore séparée des restes de contaminations par chromatographie d’échange d’ion suivie de la chromatographie d’exclusion de taille pour obtenir une protéine suffisamment pure.

Aucune des méthodes décrites n’est difficile en particulier. Mais toutes les méthodes nécessitent une formation. Les premières tentatives peuvent échouer, mais les expériences réussiront après quelques adaptations supplémentaires.

Toutes les méthodes présentées ici sont des méthodes générales de purification des protéines. Bien que spécialisé pour les protéines FAHD, le protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine que l’on voudrait purifier. Fahd-1 humain recombinant a été obtenu par les méthodes décrites et les structures de rayon X à haute résolution ont contribué massivement à notre compréhension de FAHD-1 par la fonctionnalité agissant comme les deux, la décarie et l’hydrolase.

Les bactéries utilisées dans ce travail sont des souches de sécurité et non dangereuses. Les guides généraux de sécurité s’appliquent à tous les produits chimiques et les colonnes FPLC doivent être manipulées avec soin.