Name: Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Apprenez à analyser l'engloutissement des thymocytes apoptotiques par les macrophages péritonéaux chez la souris C57BL/6. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité de l'efferocytose et l'impact des inhibiteurs spécifiques.

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La recherche dans le laboratoire de Shao est soutenue par le prix novateur de recherche du Collège de médecine et le prix de pilote de la faculté junior du département de médecine interne, Université de Cincinnati et Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Des souris expérimentales ont été élevées et maintenues dans notre colonie de souris. Tous les travaux sur les animaux ont été menés conformément aux directives du Comité institutionnel de l’Université de Cincinnati sur les soins et l’utilisation des animaux (IACUC).
1. préparation des thymocytes apoptotiques étiquetés CFSE
<ol><li>Euthanasier deux souris C57/B6 naïves par CO2 inhalation pendant 10 min et disséquer pour ouvrir la cavité thoracique, enlever (retirer) le thymus avec des pinces fines incurvées dans la boîte de Petri de culture tissulaire contenant 10 ml de milieu RPMI1640.</li>
	<li>Obtenir une suspension à une seule cellule en broyant le thymus entier contre deux extrémités givrées des lames du microscope, puis filtrer la suspension à l’aide de la passoire à cellules 100 μM.</li>
	<li>Prélever la suspension de thymus de 10 mL dans un tube de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant, resuspendre dans 40 mL de 1x PBS, et compter les nombres de cellules avec un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifugez à 300 x g pendant 5 min et enlevez le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre dans 20 mL de 1x PBS dans un tube de 50 mL comme suspension à une seule cellule avec jusqu’à 2 x 108 cellules (si plus de 2 x 108 cellules, resuspendre le reste des cellules dans un autre 20 ml de 1 x PBS dans un tube de 50 ml différent).</li>
	<li>Faire 5 μM de CFSE en volume égal (20 mL) de 1x PBS dans un tube séparé de 50 mL en pipetant 40 μL de solution d’action de CFSE (2,5 mM) dans 20 mL de 1x PBS et bien mélanger en invertant le tube 2-3 fois.</li>
	<li>Ajouter les 20 mL de CFSE de l’étape 1,7 dans les 20 mL de suspension cellulaire de l’étape 1,6 (la concentration finale de CFSE est maintenant de 2,5 μM). Remarque: pour chaque suspension de cellule de 20 mL, un tube de 20 mL de CFSE est nécessaire.</li>
	<li>Inversez la cellule et le tube de mélange de CFSE 2-3 fois et Incubez le mélange dans l’obscurité à température ambiante pendant un maximum de 2 min, puis arrêtez la réaction en ajoutant 10 mL de sérum de cheval inactivé à la chaleur.</li>
	<li>Centrifuger le mélange de tube de 50 mL à 300 x g pendant 5 min à température ambiante. Remarque: si l’étiquetage CFSE réussit, le culot de la cellule deviendra de couleur jaune clair.</li>
	<li>Retirer le surnageant et Resuspendre le culot cellulaire dans 40 mL de 1x PBS et compter les nombres de cellules avec un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min et jetez le surnageant.</li>
	<li>Laver à nouveau le culot de la cellule avec 40 mL de milieu RPMI1640.</li>
	<li>Enlevez le surnageant et resuspendez les cellules avec le milieu de culture tissulaire RPMI1640 (RPMI1640, 20 mm HEPES, 10% FBS (chaleur inactivée), 20 mM de glutamine et 1x PEN/STREP) à une concentration de 7 x 106 cellules/ml dans un plat de culture tissulaire de 100 mm. Remarque: si plus de cellules sont obtenues, un plat de culture de tissu de 100 mm séparé sera nécessaire.</li>
	<li>Ajouter la la staurosporine dans la culture de suspension cellulaire à une concentration finale de 1 μM et la culture pendant 4 h à 37 ° c dans un incubateur de culture tissulaire fourni avec 5% de CO2.</li>
</ol>2. préparation des macrophages péritonéaux
<ol><li>Injecter deux souris C57B6 (ou toute souris manipulée par un gène dans le laboratoire) par voie intrapéritonéale avec 1 ml de thioglycolate vieilli à 3% au jour 0.</li>
	<li>Euthanasier les souris au jour 5 comme à l’étape 1,1, couper et peler ouvrir la peau abdominale, mais laisser le péritoneum intact. Rincer la cavité péritonéale en poussant rapidement 10 mL de tampon de lavage (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) dans la cavité péritonéale à l’aide d’une seringue de 10 mL attachée avec une aiguille de 18 G.</li>
	<li>Récupérez lentement le tampon de lavage avec la même aiguille/seringue et collectez le tampon de lavage dans un tube de 50 mL (les détails se rapportent à l’article15du laboratoire Janssen).</li>
	<li>Lavez le gavage péritonéal deux fois avec 1x PBS, Resuspendez les macrophages péritonéaux dans le milieu de culture tissulaire RPMI1640 à une densité de 2 x 106 cellules/ml et aliquote 500 μl dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Laisser la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant 2 h.</li>
	<li>Retirer les cellules flottantes en aspirant et en remplaçant avec 500 μL de milieu de culture fraîche, deux fois.</li>
	<li>Eventuellement, ajouter l’inhibiteur de tyrosine de récepteur de TAM, RXDX-106, aux concentrations indiquées dans les légendes de figure dans chaque puits de la culture de macrophages et incuber pendant 2 h.</li>
</ol>3. co-culture des macrophages péritonéaux avec des thymocytes apoptotiques
<ol><li>Collectez les thymocytes apoptotiques de l’étape 1 et lavez trois fois avec le milieu RPMI1640. L’efficacité de l’induction apoptotique peut être mesurée à ce stade avec le kit Annexin V/7-AAD.</li>
	<li>Distribuer 0-12 x 106 cellules (en 500 μl de milieu) dans chaque puits des cultures de macrophages du protocole #2, selon l’arrangement expérimental (p. ex., voir la figure 1). Cela rend le volume de culture entier de 1 mL dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Ajouter l’anticorps bloquant dans la culture immédiatement avant l’addition de thymocytes apoptotiques.</li>
	<li>Culture du mélange cellulaire à 37 ° c pendant 4 h dans un incubateur de culture tissulaire fourni avec 5% de CO2.</li>
	<li>Lavez chaque puits de la culture avec 1x PBS (contenant 500 μM d’EDTA) deux fois pour enlever les cellules apoptotiques flottantes.</li>
	<li>Tache les macrophages liés à la plaque avec CD11b-PE à ce stade.<ol>
<li>Lavez les macrophages liés à la plaque avec un tampon de coloration (1x PBS, 1% BSA) une fois.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE dans chaque puits.</li>
		<li>Incuber la plaque à 4 ° c pendant 20 min.</li>
		<li>Lavez chaque puits de la plaque trois fois avec le tampon de coloration.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de tampon de coloration et continuer la plaque pour l’analyse d’image sous le microscope fluorescent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativement, détachez les macrophages liés à la plaque en ajoutant 1 mL de lidocaïne à 1% dans le PBS et en incubant pendant 10 min à 37 ° c.</li>
	<li>Détachez les macrophages liés à la plaque avec le pipetage répété.</li>
	<li>Transférer la suspension de macrophages dans un tube FACS à fond rond de 5 mL de chaque puits de la plaque de 24 puits.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et ajouter 200 μL de tampon de coloration contenant 2 μL de CD11b-PE (1:200 dilution dans le tampon de coloration).</li>
	<li>Incuber la suspension cellulaire dans le tampon de coloration à 4 ° c pendant 20 min.</li>
	<li>Lavez la suspension cellulaire deux fois avec un tampon de coloration.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de tampon de coloration et procéder à l’analyse FACS avec un cytomètre de flux et analyser le pourcentage de macrophages de positivité CFSE.</li>
</ol>

<ol><li>Shao, W. H., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbances+of+apoptotic+cell+clearance+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus.</a> Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).</li>
<li>Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+death+and+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Springer+Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell death and lupus.</a> Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).</li>
<li>Wong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+cancer%3A+from+pathogenesis+to+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+and+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment.</a> Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).</li>
<li>Baig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+apoptotic+pathway-targeted+cancer+therapeutic+research%3A+Where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand.</a> Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).</li>
<li>Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+clearance%3A+basic+biology+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).</li>
<li>Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+clearance+of+apoptotic+cells+induces+the+activation+of+autoreactive+anti-Sm+marginal+zone+and+B-1+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells.</a> Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).</li>
<li>Hawkins, L. A., Devitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+the+mechanisms+for+clearance+of+apoptotic+cells-a+fine+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Death%22%5BJournal%5D)">Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance.</a> Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).</li>
<li>Lemke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+TAM+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology of the TAM receptors.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).</li>
<li>Stitt, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anticoagulation+factor+protein+S+and+its+relative%2C+Gas6%2C+are+ligands+for+the+Tyro+3%2FAxl+family+of+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 80 (4), 661-670 (1995).</li>
<li>Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptor+tyrosine+kinases%3A+biologic+functions%2C+signaling%2C+and+potential+therapeutic+targeting+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer.</a> Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).</li>
<li>van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors%2C+Gas6%2C+and+protein+S%3A+roles+in+inflammation+and+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis.</a> Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).</li>
<li>Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAM+receptors+and+the+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">TAM receptors and the clearance of apoptotic cells.</a> Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).</li>
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<li>Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+expression+of+tyro3%2C+axl%2C+and+mer+receptors+in+macrophage+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Macrophage+%28Houst%29%22%5BJournal%5D)">Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny.</a> Macrophage (Houst). 3, (2016).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+a+review+of+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: a review of programmed cell death.</a> Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Find-me+and+eat-me+signals+in+apoptotic+cell+clearance%3A+progress+and+conundrums%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).</li>
<li>Rock, K. L., Kono, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+response+to+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+in+Pathology%22%5BJournal%5D)">The inflammatory response to cell death.</a> Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).</li>
<li>Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+inducing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Methods for inducing apoptosis.</a> Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Stijlemans, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pHrodo-based+assay+for+the+assessment+of+in+vitro+and+in+vivo+erythrophagocytosis+during+experimental+trypanosomosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).</li>
<li>Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearing+the+dead%3A+apoptotic+cell+sensing%2C+recognition%2C+engulfment%2C+and+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion.</a> Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+recovery+of+macrophages+and+cell+lines+from+tissue+culture-treated+and+-untreated+plastic+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes.</a> Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).</li>
<li>Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Human+and+Mouse+Neutrophil+Phagocytosis+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry.</a> Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).</li>
<li>Summers, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+kinetics+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil kinetics in health and disease.</a> Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocytes%3A+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The phagocytes: neutrophils and monocytes.</a> Blood. 112 (4), 935-945 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’apoptose est un processus de mort cellulaire hautement conservé qui implique de nombreuses cascades de signaux et induit l’expression des protéines, la sécrétion et le transport. L’apoptose est souvent associée à des changements de morphologie cellulaire17. Les cellules apoptotiques libèrent activement des cytokines et des chimiokines qui attirent les phagocytes pour migrer vers le site et initier le processus d’engloutement, une voie extrêmement complexe sous contrôle serré18<...

Notre corps génère 1-10 milliards de cellules apoptotiques sur une base quotidienne. Un tel grand nombre de cellules apoptotiques doit être effacé de manière à ce que les réponses immunitaires demeurent quiescentes. Pour assurer le dégagement des cellules apoptotiques en temps opportun, de nombreux types de cellules résidentes de tissu et de cellules circulantes développent des mécanismes pour engloutir les cellules apoptotiques1. La régulation dysfonctionnelle de l’apoptose a été impliquée dans l’apparition et la progression de diverses maladies inflammatoires et de l’auto-immunité2. L’apoptose joue également un rôle crucial dans la pathogenèse du développement du cancer et sa résistance subséquente aux traitements conventionnels3,4. L’élimination des cellules apoptotiques favorise généralement une réponse anti-inflammatoire, qui peut être liée à la tolérance immunologique5. La perturbation de la clairance des cellules apoptotiques entraîne l’auto-immunisation et contribue au développement de maladies auto-immunes systémiques chez l’homme et la souris6.
Lorsque les cellules subissent l’apoptose, elles exposent la phosphatidylsérine (PtdSer) de la foliole interne à la foliole externe de la membrane. Le PtdSer sera alors reconnu par les phagocytes par les récepteurs de surface. Plus d’une douzaine de récepteurs ont été identifiés pour reconnaître et/ou faciliter l’engloutement des cellules apoptotiques. En général, il existe au moins trois types de récepteurs de surface impliqués dans le dégagement des cellules apoptotiques: récepteurs d’attachement, reconnaître les cellules apoptotiques; les récepteurs de chatouillement, initier l’engulfment; les récepteurs de chaperonner, facilitent l’ensemble du processus7. Les tyrosine kinases du récepteur TAM (TAM RTKs) consistent en Tyro-3, AXL et Mer et sont principalement exprimées par les cellules myéloïdes du système immunitaire8. La fonction principale de TAM RTKs est de servir de récepteurs d’attachement, facilitant l’élimination phagocytaire des cellules apoptotiques et des débris. Notre groupe a étudié la clairance cellulaire apoptotique médiée par TAM dans le cadre de l’auto-immunité pendant de nombreuses années. La protéine dépendante de la vitamine K-dépendant de l’arrestation de protéine 6 (Gas6) et de protéine S (ProS) se lie à et active les récepteurs de Tam9,10. Gas6 est produit dans le coeur, les reins et les poumons. Les ProS sont principalement produits dans le foie11. TAM reconnaît des cellules apoptotiques de telle sorte que le N-terminal de Gas6/ProS se lie au PtdSer sur une cellule apoptotique et le C-terminal de Gas6/ProS se lie aux récepteurs TAM qui ancrés sur la surface des phagocytes. Avec les autres récepteurs, l’flammes des cellules apoptotiques se produit12. Bien que mer puisse se lier à la fois pour les ligands ProS et Gas6, nous avons constaté que Gas6 semble être le seul ligand pour la phagocytose de macrophages de cellules apoptotiques médiées par mer, qui peut être bloquée par l’anticorps anti-mer13. Les macrophages sont des phagocytes professionnels. L’élimination rapide des cellules apoptotiques par les macrophages est importante pour l’inhibition de l’inflammation et des réponses auto-immunes contre les antigènes intracellulaires. Le récepteur de la mer tyrosine kinase est essentiel pour l’engloutement des macrophages et une clairance efficace des cellules apoptotiques14. Dans la rate de souris, mer exprime principalement sur la zone marginale et les macrophages corporels13.
Le protocole présenté ici décrit une méthode de base pour induire l’apoptose cellulaire et de démontrer des moyens de mesurer le processus et l’efficacité de l’effocytose. Ces protocoles peuvent être facilement adaptés pour étudier l’effocytose par d’autres types de cellules dans l’flammes de cellules apoptotiques d’origines différentes.

<table><tbody><tr><td>Tampon d’abrasion</td><td>GIBCO</td><td>A10492</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/7-AAD</td><td>BD Pharmingen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mer antibody</td><td>R& D Systems</td><td>BAF591</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-PE (clone M1/70)</td><td>BD Pharmingen</td><td>553311</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 mM)</td><td>GIBCO</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352017</td><td></td></tr><tr><td>Lames givrées</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-343</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval (inactivé par la chaleur)</td><td>Invitrogen</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-5647</td><td>Préparez un tampon à 1 % dans 1x PBS</td></tr><tr><td>PBS, 1x</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10040CV</td><td></td></tr><tr><td>RXDX-106</td><td>Selleck Chemicals</td><td>CEP-40783</td><td></td></tr><tr><td>Staurosprine (100mg)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2541-100</td><td>Ajouter 214,3 ml de DMSO dans 100mg pour faire 1mM de solution de stockage</td></tr><tr><td>Thioglycolate Medium Brewer Modified</td><td>BD Biosciences</td><td>243010</td><td>Préparer un tampon de thioglycolate à 3 % dans 1&acute ; PBS, autoclavé et conservé à l’obscurité pendant 3 mois.</td></tr></tbody></table>

analyse expérimentale de l’engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

L’apoptose cellulaire est un processus naturel et joue un rôle crucial dans le développement embryonnaire, la régulation homéostatique, l’induction de la tolérance immunitaire et la résolution de l’inflammation. L’accumulation de débris apoptotiques dans le corps peut déclencher des réactions inflammatoires chroniques qui conduisent à des maladies auto-immunes systémiques au fil du temps. Une altération de la clairance des cellules apoptotiques a été impliquée dans une variété de maladies auto-immunes. La clairance apoptotique est un processus complexe rarement détecté dans des conditions physiologiques. Il implique des récepteurs de surface abondants et des molécules de signalisation. L’étude du processus de clairance des cellules apoptotiques fournit des mécanismes moléculaires perspicaces et des réponses biologiques ultérieures, ce qui peut conduire au développement de nouvelles thérapies. Ici, nous décrivons les protocoles pour l’induction des thymocytes apoptotiques, la préparation des macrophages péritonéaux, et l’analyse de la clairance des cellules apoptotiques par cytométrie en flux et microscopie. Toutes les cellules seront soumises à une apoptose à un certain stade, et de nombreuses cellules résidentielles et circulantes peuvent absorber les débris apoptotiques. Par conséquent, le protocole décrit ici peut être utilisé dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison de cellules apoptotiques et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules.

Analyse de l’engloutement de thymocytes apoptotiques par le macrophage péritonéal. Les macrophages péritonéaux et les cellules apoptotiques ont été préparés et co-cultivés comme décrit dans le protocole. Les macrophages ont été détachés et colorés avec l’anticorps anti-CD11b conjugué au PE pendant 20 min sur la glace. Les macrophages ont ensuite été lavés et transformés dans un cytomètre à flux. Comme on le voit, il n’y a pas de macrophages positif CFSE dans le quadrant inférieur droit quand aucune cellu...

Ici, nous présentons un protocole pour préparer les thymocytes apoptotiques et les macrophages péritonéaux et analyser l’efficacité de l’effocytose et le blocage spécifique par inhibiteur de l’engloutement des thymocytes apoptotiques. Ce protocole a une application large dans le dégagement de cellules-médiation d’autres particules y compris les billes artificielles et les bactéries.

Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

Notre corps génère de 1 à 10 milliards de cellules apoptotiques chaque jour. Le dégagement efficace de ces cellules aide à enlever les débris cellulaires et à maintenir les stocks. Cette méthode peut être utilisée dans de nombreuses applications pour caractériser la liaison cellulaire apoptotique et l’ingestion par de nombreux autres types de cellules phagocytiques.Yuxuan Zhen, technicien senior dans mon laboratoire, démontrera cette procédure. Pour récolter les thymocytes, après avoir ouvert la cavité thoracique d’une souris C57 noire naïve de 6, utilisez des forceps incurvés pour retirer le thymus. Placer l’organe dans un plat de culture tissulaire contenant 10 millilitres de RPMI 1640 Medium.Moudre le thymus entier contre les extrémités givrées de deux lames de microscope et filtrer la suspension tissulaire résultante à travers une passoire cellulaire de 70 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Recueillir les thymocytes par centrifugation et réutiliser la pastille en 40 millilitres. Après comptage, centrifuger les cellules à nouveau et resuspendre jusqu’à deux fois 10 à huit cellules dans 20 millilitres de PBS frais par tube de 50 millilitres.Étiquetez les cellules avec cinq micromolaires CFSE en 20 millilitres de PBS par tube. Inverser les tubes deux à trois fois pour les mélanger avant d’incuber les thymocytes pendant au plus deux minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction avec 10 millilitres de sérum de cheval inactivé par la chaleur et recueillir les cellules par centrifugation.Resuspendez les cellules étiquetées en 40 millilitres de PBS frais pour le comptage et la centrifugation suivies d’un lavage supplémentaire avec 40 millilitres de milieu. Après le lavage moyen, résuspendez les thymocytes à sept fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration moyenne de culture tissulaire et ensemencez les cellules dans un plat de culture tissulaire de 100 millimètres. Ajouter ensuite la staurosporine à la culture cellulaire à une concentration finale d’un micromolaire et placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant quatre heures.Pour l’isolement péritonéal de macrophage, injectez deux souris noires de C57 6 intraperitoneally avec un millilitre de thioglycollate 3%aged au jour zéro avant d’ouvrir la peau abdominale sans déranger le péritoine le cinquième jour. Pour rincer la cavité péritonéale, utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 18 pour pousser rapidement 10 millilitres de tampon de lavage dans la cavité avant d’aspirer lentement le tampon de lavage pour la collecte dans un tube de 50 millilitres. Laver le lavage péritonéal deux fois avec PBS.Resuspendez les macrophages péritonéaux à deux fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration moyenne de culture tissulaire. Graines suivantes 500 microlitres de macrophages dans chaque puits d’une plaque de puits 24 et placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant deux heures. À la fin de l’incubation, aspirer le supernatant pour enlever les cellules flottantes et ajouter 500 microlitres de milieu de culture tissulaire à chaque puits.Ajouter immédiatement zéro à 12 fois 10 aux six thymocytes dans 500 microlitres de milieu à chaque puits de la culture et placer la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant quatre heures. À la fin de l’incubation, laver chaque puits deux fois avec du PBS frais pour enlever les cellules apoptotiques flottantes libres suivies d’un seul lavage avec tampon de coloration. Étiquette suivante les macrophages liés à la plaque avec 200 microlitres de tampon de coloration complétés par un anticorps anti-CD11b approprié par puits et placent la plaque à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Dans cette expérience représentative, jusqu’à 30% des macrophages péritonéaux stimulés de thioglycollate ont démontré un signal positif dans le canal de CFSE indiquant que ces phagocytes avaient ingéré des cellules apoptotiques CFSE-étiquetées. L’observation microscopique de l’engloutissement de macrophage des cellules apoptotiques est essentielle pour étudier la capacité des macrophages à ingérer des cellules apoptotiques pendant que les macrophages positifs de CFSE se répandent dans le quadrant inférieur droit dû aux intensités différentes indiquant que le nombre de cellules apoptotiques dans les macrophages individuels est différent. Un rapport plus élevé des cellules apoptotiques aux macrophages augmente non seulement le nombre de macrophages ingérant des cellules apoptotiques, mais améliore également la capacité des macrophages à ingérer des cellules plus apoptotiques.Dans une autre série d’expériences, environ 15% des macrophages sont devenus positifs cfse quand CFSE étiqueté thymocytes apoptotiques ont été ajoutés à la culture de macrophage pendant quatre heures indiquant que ces macrophages étaient les macrophages phagocytiques. L’anticorps mer bloque l’efférocytose macrophage d’une manière dépendante de la dose et le blocage global peut représenter environ 30% de l’efficacité de l’efférocytose dans le contexte actuel. En outre, un inhibiteur des récepteurs TAM nouvellement approuvé atténue l’efférocytose macrophage d’une manière dépendante de la dose jusqu’à une concentration d’environ 100 nanomolaires.N’oubliez pas de vérifier le pourcentage de cellules apoptotiques car ce nombre affecte directement l’efficacité de l’efférocytose. Les macrophages phagocytiques peuvent être analysés par tache occidentale pour étudier les molécules de signalisation régulées par le processus d’engloutissement et par microscopie pour étudier la dynamique de l’engloutissement.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Dans cette vidéo, nous démontrons le test d’efférocytose pour étudier la clairance des cellules apoptotiques à l’aide de la microscopie confocale. L’efférocytose est un processus en plusieurs étapes où les cellules apoptotiques sont englouties par des phagocytes et dégradées dans des vésicules appelées efférosomes. Ce protocole fournit une méthode pour visualiser les parties internalisées et non internalisées des cellules apoptotiques individuelles et quantifier l’efférocytose.

Dosage de l’efférocytose à cellules fixes : méthode d’étude de l’absorption efférocytaire des cellules apoptotiques par les macrophages à l’aide de la microscopie à fluorescence

Cette vidéo présente une procédure d’analyse de l’efférocytose médiée par les macrophages péritonéaux des thymocytes de souris apoptotiques par microscopie à fluorescence.

Analyse de l’efférocytose des thymocytes apoptotiques par les macrophages péritonéaux

Cette vidéo présente un test d’apoptose dans des cellules cancéreuses induit par des cellules T effectrices pré-activées. En co-cultivant ces cellules avec des cellules cancéreuses marquées par des noyaux fluorescents, un substrat fluorogénique clivable par caspase est ajouté. Les cellules cancéreuses apoptotiques afficheront une couleur différente dans leur noyau, conduisant à une double fluorescence. Cette double fluorescence est révélatrice de cellules cancéreuses en apoptose.

Un test in vitro pour l’étude de la cytotoxicité des lymphocytes T CD8+ préactivés contre les cellules cancéreuses

Ici, nous présentons un protocole pour la détermination des événements de signalisation intracellulaire induits dans les cellules viables par l’interaction physique avec des cellules mortes ou mourantes adjacentes. Le protocole se concentre sur les événements de signalisation induits par la reconnaissance des cellules mortes par le biais du récepteur, par opposition à leur absorption phagocytaire ou à la libération de médiateurs solubles.

Identification des événements intracellulaires de signalisation induite dans les cellules viables par interaction avec les cellules voisines Subissant la mort cellulaire apoptotique

Nous décrivons ici un test de phagocytose utilisant les cellules embryonnaires dispersées de Drosophila . Il nous permet de quantifier facilement et précisément les niveaux de phagocytose in vivo et d'identifier de nouvelles molécules requises pour la phagocytose des cellules apoptotiques.

Essai de phagocytose pour les cellules apoptotiques dans Drosophila Embryons

Nous décrivons ici des méthodes à l’aide de microscopie confocale de rotation disque aux événements phagocytaires unique image de macrophages péritonéaux résident de souris. Les protocoles peuvent être étendues à d’autres cellules phagocytaires.

Time-lapse imagerie 3D de phagocytose par les Macrophages de souris

Efferocytosis, la suppression phagocytaire des cellules apoptotiques, est nécessaire pour maintenir l’homéostasie et est facilitée par les récepteurs et les voies de signalisation qui permettent la reconnaissance, d’une durée et l’internalisation des cellules apoptotiques. Ici, nous présentons un protocole de microscopie de fluorescence pour la quantification de l’efferocytosis et l’activité des voies de signalisation d’efferocytic.

Quantification des Efferocytosis en microscopie par Fluorescence des cellules individuelles

Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la cytotoxicité des CD8 pré-activé+ T les cellules contre les cellules cancéreuses en détectant l’apoptose cancer cellules via en temps réel la microscopie. Ce protocole peut enquêter sur les mécanismes à l’origine myéloïde cellulaire induite par des lymphocytes T suppression et évaluer composés visant à reconstituer T cellules via blocus des cellules myéloïdes suppresseurs immunitaires.

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Les maladies neurodégénératives sont associées à des fonctions microgliales dérégulées. Cet article décrit un test in vitro de phagocytose des cellules de neuroblastome par les macrophages iPSC. Les lectures de microscopie quantitative sont décrites à la fois pour l’imagerie time-lapse sur cellules vivantes et l’imagerie à haut contenu à cellules fixes.

Essai d’imagerie quantitative in vitro pour la phagocytose des cellules mortes du neuroblastome par iPSC-Macrophages

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

Apprenez à analyser l'engloutissement des thymocytes apoptotiques par les macrophages péritonéaux chez la souris C57BL/6. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité de l'efferocytose et l'impact des inhibiteurs spécifiques.

Analyse expérimentale de l’Engloutement des thymocytes apoptotiques par les macrophages

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