Reconnaissance de séquence d'ADN par primase d'ADN utilisant le profilage primase à haut débit

Ce protocole décrit la collecte de données massives provenant du microréseaux liant protéines-ADN pour la primase, une enzyme qui se lie transitoirement à des séquences d’ADN spécifiques et catalyse à son tour la formation d’amorces d’ARN. Cette vidéo couvrira comment la technologie microarray peut aider à redéfinir les sites de reconnaissance de séquences primase et comment une approche à haut débit peut compléter la biochimie classique. Cette technique combine deux approches : le microrése liant l’ADN primase et l’analyse d’activité primase.

Le microarray fournit des données massives de liaison primase aux séquences d’ADN, où comme l’analyse biochimique fournit des informations sur la formation d’amorce d’ARN par primase d’ADN. L’activité enzymatique testée dépend de la perspicacité de l’expérience de microrésorité et de son débit inférieur dans sa nature. Le lien entre l’efficacité de la liaison, la sélection des séquences d’ADN et l’activité de l’enzyme est sondé.

L’identification du déterminance des séquences à l’aide de microrésage, nous permet de tirer des conclusions précises basées sur des données massives du microarray. Cette approche a été utilisée jusqu’à présent pour décrire les séquences de liaison de l’ADN des facteurs de transcription. Les facteurs de transcription sont des protéines statiques qui se lient étroitement à l’ADN.

La démonstration de la procédure sera Stefan Ilic. Pour commencer cette procédure, pré-mouiller la diapositive microarray en le plaçant dans un pot de coplin contenant 0,01%Triton-X 100. Et en tournant sur un rotateur de laboratoire, ajouter 125 rpm pendant cinq minutes.

Pipette la solution de blocage dans une boîte en plastique. Retirez ensuite la diapositive microarray du pot de coplin. Utilisez un lingette fine pour conduire le côté non-ADN et les bords de la glissière.

Placez lentement le microarray dans la boîte en plastique. Incuber à température ambiante pendant une heure avec des secousses lentes. Après cela, laver la diapositive une fois avec 0,01%Tween-20 en PBS.

Sur un rotateur de laboratoire à 125 rpm pendant cinq minutes. Retirer le Tween-20 et rincer la lame une fois avec 0,01% Triton-X 100 en PBS sur un rotateur de laboratoire à 125 tr/min pendant deux minutes. Ensuite, transférez rapidement la diapositive dans un bocal de coplin contenant du PBS.

Tout d’abord, assembler la chambre PMB tel qu’il est décrit dans le protocole de texte. Placez la glissière dans l’espace désigné. Utilisez une pince à épiler pour la pousser vers le bas et à gauche.

Placez le joint de silicium sur le dessus, en s’assurant qu’il est bien aligné avec la partie inférieure de la chambre PBM. Fermez ensuite la chambre et serrez les vis en diagonale. Pipette le mélange de liaison protéique dans chaque puits du joint.

Ensuite, incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Pour commencer, pipette 0,05%Tween-20 en PBS dans la chambre PBM pour laver brièvement la diapositive. À l’aide d’un aspirateur, retirez la solution des puits de la chambre en prenant soin de ne pas toucher les taches d’ADN.

Répétez ceci, lavez brièvement la lame avec PBS. Et utilisez le vide pour enlever la solution des puits de la chambre tout en prenant soin de ne pas toucher les taches d’ADN. Ensuite, ajoutez Alexa 488 anti-Son Anticorps conjugué à chaque puits de la chambre PBM.

Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Après cela, lavez brièvement la glissière à l’intérieur de la chambre PBM en ajoutant quelques gouttes de 0,05%Tween-20 dans chaque puits. Et utilisez l’aspirateur pour enlever la solution des puits de la chambre, en prenant soin de ne pas toucher les taches d’ADN.

Démonter la chambre PBM et retirer la lame. Rincer les diapositives deux fois en 0,05%Tween-20 en PBS, chaque rinçage d’une durée de trois minutes. Ensuite, rincez les diapositives deux fois dans PBS, chaque rinçage d’une durée de trois minutes chacun.

Et une fois dans l’eau distillée double pendant trois minutes. Séchez les glissières avec de l’air comprimé. Et rangez-les dans une boîte à diapositives sombre jusqu’à ce qu’ils soient prêts à numériser.

Lorsqu’il est prêt, utilisez un scanner de microrése pour scanner la puce avec une excitation de 495 nanomètres et une émission de 19 nanomètres. Et recueillir l’intensité médiane de fluorescence. Dans cette étude pi débit primase profilage est utilisé pour cartographier les sites de liaison primase, y compris ceux qui sont difficiles, voire impossibles à observer à l’aide d’outils classiques.

Fait important, le profilage primase pi débit permet de revisiter la compréhension traditionnelle des sites de liaison primase. En particulier pi débit primase profilage révèle des spécificités contraignantes en plus de 5'GTC3'recognition séquences connues, ce qui conduit à des changements dans les activités fonctionnelles de t7 DNA primase. À savoir, deux groupes de séquences sont identifiés.

Fortes séquences d’ADN contraignantes qui contenaient du TG sur les flancs et de faibles séquences d’ADN liant qui contenaient ag dans les flancs. Aucune liaison primase aux modèles d’ADN manquants 5'GTC3'dans leurs séquences n’a été détectée. Les sites de reconnaissance de l’ADN primase qui contiennent des caractéristiques spécifiques telles que les flancs riches en TG, augmentent la liaison de l’ADN primase jusqu’à 10 fois.

Étonnamment, ils augmentent également la longueur de l’ARN nouvellement formé. Fait important, le profilage primase à haut débit nous permet d’observer et de quantifier la variabilité de la longueur de l’amorce par rapport à la séquence du modèle d’ADN. Lors de l’exécution de cette procédure, les étapes de lavage doivent être subtiles.

Et les tampons doivent contenir des composants qui ont enregistré la primase sur l’ADN. Un seuil d’événements contraignants futiles est également déterminé biochimiquement. Par conséquent, l’analyse du microrése est insuffisante.

Des méthodes telles qu’une résonance plasmatique de surface et des analyses de changement de gel peuvent déterminer l’affinité contraignante de primase pour sélectionner les séquences d’ADN. Mon laboratoire met en œuvre des modèles de prédiction de l’apprentissage automatique pour détecter les déterminants de la séquence primase qui produisent des amorces productives qui peuvent être prolongées par la polymése d’ADN. À l’ère du Big Data, une mise en œuvre de méthodes statistiques pour analyser le Big Data, la technique aidera certainement à mieux caractériser des séquences d’ADN spécifiques et à lier la reconnaissance des séquences à l’activité de primase.

Toute personne travaillant avec la radiation devrait avoir une compréhension approfondie des règlements et des dangers associés à l’utilisation de rayonnement ionisant. Devrait suivre une formation et devrait travailler avec de l’équipement de sécurité.