Name: Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation dblastema de mammifères et lossification intramembrane (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez l'amputation P3 chez la souris adulte pour étudier la formation du blastème et l'ossification intramembraneuse. Cette méthode permet d'analyser les populations cellulaires critiques et la revascularisation lors de la régénération.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions les membres du Laboratoire Muneoka et du Texas Institute for Genomic Medicine (TIGM). Ce travail a été soutenu par l'Université texasA et M.

<ol><li>Douglas, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservative+management+of+guillotine+amputation+of+the+finger+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Paediatric+Journal%22%5BJournal%5D)">Conservative management of guillotine amputation of the finger in children.</a> Australian Paediatric Journal. 8, 86-89 (1972).</li>
<li>Illingworth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapped+fingers+and+amputated+finger+tips+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Trapped fingers and amputated finger tips in children.</a> Journal of Pediatric Surgery. 9, 853-858 (1974).</li>
<li>Borgens, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+regrow+the+tips+of+their+foretoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mice regrow the tips of their foretoes.</a> Science. 217, 747-750 (1982).</li>
<li>Neufeld, D. A., Zhao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phalangeal+regrowth+in+rodents%3A+postamputational+bone+regrowth+depends+upon+the+level+of+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Clinical+and+Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Phalangeal regrowth in rodents: postamputational bone regrowth depends upon the level of amputation.</a> Progress in Clinical and Biological Research. 383a, 243-252 (1993).</li>
<li>Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regeneration+of+the+neonatal+digit+tip+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice.</a> Developmental Biology. 315, 125-135 (2008).</li>
<li>Takeo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+activation+in+nail+epithelium+couples+nail+growth+to+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration.</a> Nature. 499, 228-232 (2013).</li>
<li>Chamberlain, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Level-specific+amputations+and+resulting+regenerative+outcomes+in+the+mouse+distal+phalanx%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Level-specific amputations and resulting regenerative outcomes in the mouse distal phalanx.</a> Wound repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 25, 443-453 (2017).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analogous+cellular+contribution+and+healing+mechanisms+following+digit+amputation+and+phalangeal+fracture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Analogous cellular contribution and healing mechanisms following digit amputation and phalangeal fracture in mice.</a> Regeneration. 3, 39-51 (2016).</li>
<li>Seifert, A. W., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blastema+and+epimorphic+regeneration+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The blastema and epimorphic regeneration in mammals.</a> Developmental Biology. 433, 190-199 (2018).</li>
<li>Carlson, B. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarlson%2C+BM+%22Principles+of+Regenerative+Biology%22">Principles of Regenerative Biology</a>. , Elsevier. Burlington, MA. (2007).</li>
<li>Fernando, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+and+blastema+formation+in+regenerating+digit+tips+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing and blastema formation in regenerating digit tips of adult mice.</a> Developmental Biology. 350, 301-310 (2011).</li>
<li>Simkin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+closure+regulates+histolysis+during+mammalian+%28Mus%29+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Epidermal closure regulates histolysis during mammalian (Mus) digit regeneration.</a> Regeneration. 2, 106-119 (2015).</li>
<li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+is+inhibitory+for+mammalian+digit+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis is inhibitory for mammalian digit regeneration.</a> Regeneration. 1, 33-46 (2014).</li>
<li>Dolan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regrowth+is+impaired+during+digit+tip+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Axonal regrowth is impaired during digit tip regeneration in mice.</a> Developmental Biology. 445, 237-244 (2018).</li>
<li>Dawson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastema+formation+and+periosteal+ossification+in+the+regenerating+adult+mouse+digit%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%3A+Official+Publication+of+the+Wound+Healing+Society+%5Band%5D+the+European+Tissue+Repair+Society%22%5BJournal%5D)">Blastema formation and periosteal ossification in the regenerating adult mouse digit.</a> Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 26, 263-273 (2018).</li>
<li>Sammarco, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+bone+regeneration+is+dependent+upon+a+dynamic+oxygen+event%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%3A+The+Official+Journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Endogenous bone regeneration is dependent upon a dynamic oxygen event.</a> Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 29, 2336-2345 (2014).</li>
<li>Einhorn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Trauma%22%5BJournal%5D)">The science of fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Trauma. 19, S4-S6 (2005).</li>
<li>Shapiro, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+development+and+its+relation+to+fracture+repair.+The+role+of+mesenchymal+osteoblasts+and+surface+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cells+%26+Materials%22%5BJournal%5D)">Bone development and its relation to fracture repair. The role of mesenchymal osteoblasts and surface osteoblasts.</a> European Cells & Materials. 15, 53-76 (2008).</li>
<li>Ilizarov, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension-stress+effect+on+the+genesis+and+growth+of+tissues.+Part+I.+The+influence+of+stability+of+fixation+and+soft-tissue+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Orthopaedics+And+Related+Research%22%5BJournal%5D)">The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues. Part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation.</a> Clinical Orthopaedics And Related Research. (238), 249-281 (1989).</li>
<li>Thompson, Z., Miclau, T., Hu, D., Helms, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+intramembranous+ossification+during+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">A model for intramembranous ossification during fracture healing.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 20, 1091-1098 (2002).</li>
<li>Dolan, C. P., Dawson, L. A., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digit+Tip+Regeneration%3A+Merging+Regeneration+Biology+with+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Digit Tip Regeneration: Merging Regeneration Biology with Regenerative Medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7, 262-270 (2018).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha%2FCXCR4+signaling+mediates+digit+tip+regeneration+promoted+by+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha/CXCR4 signaling mediates digit tip regeneration promoted by BMP-2.</a> Developmental Biology. 382, 98-109 (2013).</li>
<li>Doube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BoneJ%3A+Free+and+extensible+bone+image+analysis+in+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">BoneJ: Free and extensible bone image analysis in ImageJ.</a> Bone. 47, 1076-1079 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ce protocole décrit une procédure normalisée de l'amputation distale de P3 de souris adulte, de la coloration immunohistochemical fluorescente pour visualiser et étudier la formation de blastma et l'ossification intramembrane, et le balayage in-vivo séquentieux de CT à identifier les changements morphologiques, de volume et de longueur d'os après l'amputation. L'amputation de P3 est un modèle unique, procéduralement simple, et reproductible pour analyser un environnement pro-régénératif de blessure qui déclenche la forma...

Les mammifères, y compris les humains et les souris, ont la capacité de régénérer les pointes de leurs chiffres après l'amputation distale de la phalange terminale (P3)1,2,3. Chez la souris, la réponse de régénération est dépendante de l'amputation; les amputations de chiffre de plus en plus proximales affichent une réponse régénérative progressivement atténuée jusqu'à l'échec régénératif complet aux amputations transectant et proximal à la matrice d'ongle de P34,5,6 , 7 Annonces , 8. La régénération de P3 est médiée par la formation d'un blastma, défini comme une population de cellules proliférantes qui subissent la morphogénèse pour régénérer les structures amputées9. La formation d'un blastma pour régénérer les structures perdues par amputation, un processus appelé régénération épimorphe, distingue la réponse de régénération P3 multi-tissu-niveau de la réparation traditionnelle de tissu après blessure6, 10. La régénération de P3 est un modèle reproductible et procéduralement simple pour étudier les processus régénératifs complexes comprenant la guérison de blessure11,12, histolyse d'os11,12, revascularisation13, régénération nerveuse périphérique14, et conversion blastmalà l'os par ossification intramembrane1 .
Des études antérieures utilisant l'immunohistochimie ont démontré que le blastema est hétérogène, avascular, hypoxique, et fortement proliférant11,13,15,16. Après l'amputation distale de P3, le blastema tôt est au commencement associé au périosteum et à l'endosteum de P3 et est caractérisé par la prolifération robuste et l'ostéogenèse naissante adjacente à la surface d'os15. Après la dégradation d'os et la fermeture de blessure, le blastma hétérogène est formé par la fusion des cellules periosteal et endosteal-associées, suivie par la différenciation des composants blastmal comprenant l'os par l'ossification intramembrane 15.
La réparation osseuse en réponse à des blessures se produit généralement par ossification endochondrale, c'est-à-dire par l'intermédiaire d'un callus cartilagineux initial qui forme un modèle pour la formation osseuse ultérieure17,18. L'ossification intramembrane à long os, c.-à-d., formation d'os sans intermédiaire cartilagineux, est généralement induite utilisant des dispositifs complexes de distraction ou la fixation chirurgicale19,20. La réponse de régénération de chiffre est un modèle préclinique qui offre des avantages au-dessus des modèles conventionnels d'ossification intramembrane : 1) il n'exige pas la blessure externe ou interne de poteau de fixation pour stimuler l'ossification intramembrane, 2) il est réalisée à l'aide de 4 chiffres de chaque animal, maximisant ainsi les échantillons tout en minimisant l'utilisation des animaux, et 3) l'analyse de la tomographie microcomputée in vivo séquentielle peut être effectuée avec facilité et rapidité.
Dans la présente étude, nous montrons le plan standardisé d'amputation de P3 pour réaliser une réponse reproductible et robuste de régénération. En outre, nous démontrons un protocole optimisé d'immunohistochemistry de fluorescence utilisant des sections de paraffine pour visualiser la formation de blastma, la revascularisation dans le contexte de la régénération, et la conversion blastmal à l'os par l'intermédiaire intramembranous Ossification. Nous démontrons également l'utilisation de l'invivo séquentiel pour identifier des changements dans la morphologie, le volume, et la longueur d'os dans le même chiffre au cours de la régénération. L'objectif de ce protocole est d'étudier la formation de blastma mammifère après l'amputation et de démontrer 2 techniques, l'immunohistochemistry de fluorescence et le TCT in vivo séquentiel, pour l'étude de la régénération osseuse intramembrane.

<table><tbody><tr><td>Protein Block Serum Free</td><td>DAKO</td><td>X0909</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Souris anti-PCNA</td><td>anticorps Abcam</td><td>ab29</td><td>dilution 1:2000</td></tr><tr><td>Rat anti-CXCR4 anticorps</td><td>R& D Systems</td><td>MAB21651</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anticorps vWF XIII anti-humain</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>Dilution 1:800</td></tr><tr><td>Anti-osterix lapin, anticorps SP7</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td>dilution 1:400</td></tr><tr><td>Anticorps anti-Runx2</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>HPA022040</td><td>dilution 1:250</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 chèvre conjuguée anti-souris IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 chèvre conjuguée anti-rat IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Réactif</td> <td>anti-décoloration Prolong GoldInvitrogen</td><td>P36930</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Surgipath Décalicificateur 1</td><td>Leica Biosystems</td><td>3800400</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Z-Fix, fixateur aqueux de zinc et de formol tamponné aqueux</td><td>Anatech LTD</td><td>174</td><td>Prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>CD-1 Souris femelle</td><td>Envigo</td><td>ICR(CD-1)</td><td>8-12 semaines</td></tr><tr><td>vivaCT 40</td><td>SCANCO Medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Ici, nous présentons un protocole de la phalange terminale adulte de souris (P3) amputation, un modèle mammifère procéduralement simple et reproductible de régénération épimorphe, qui implique la formation de blastma et l'ossification intramembrane analysée par immunohistochemistry de fluorescence et tomographie microcomputée in vivo séquentielle (CT). La régénération des mammifères est limitée aux amputations transectant la région distale de la phalange terminale (P3); les chiffres amputés à des niveaux plus proximal s'échouent et subissent la guérison fibrotique et la formation de cicatrices. La réponse de régénération est médiée par la formation d'un blastème proliférant, suivi de la régénération d'os par l'ossification intramembrane pour reconstituer la longueur squelettique amputée. L'amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique chez les mammifères, et est un outil puissant pour la conception des stratégies thérapeutiques pour remplacer la guérison fibrotique par une réponse régénérative réussie. Notre protocole utilise l'immunohistochimie de fluorescence pour 1) identifier les populations tôt et tard de cellules de blastma, 2) la revascularisation d'étude dans le contexte de la régénération, et 3) étudier l'ossification intramembrane sans avoir besoin d'os complexe dispositifs de stabilisation. Nous démontrons également l'utilisation de l'in vivo séquentiel pour créer des images haute résolution pour examiner les changements morphologiques après l'amputation, ainsi que pour quantifier les changements de volume et de longueur dans le même chiffre au cours de la régénération. Nous croyons que ce protocole offre une utilité énorme pour étudier les réponses épimorphiques et régénératrices tissulaires chez les mammifères.

La souris adulte régénérant des chiffres P3 à 6/7 DPA (Figure 2A-D), 9 DPA (Figure 2E-H), et 10 DPA (Figure 2I-L) ont été immunostained avec des anticorps à Runx2, OSX, et PCNA pour visualiser l'os intramembrane la régénération, et immunostained avec des anticorps à CXCR4 et vWF pour visualiser la formation de blastma. Les rendus représentatifs de la CT des chiffres numérisés avant ...

Ici, nous présentons un protocole de l'amputation de phalange terminale de souris adulte pour étudier la formation de blastma de mammifères et l'ossification intramembrane, analysée par l'immunohistochemistry fluorescent et la tomographie microcomputed in-vivo séquentielle.

Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

L’amputation de P3 est un modèle préclinique pour étudier la régénération épimorphique des mammifères et un outil puissant pour identifier les populations cellulaires critiques et les mécanismes qui contrôlent la régénération endogène. Le modèle P3 permet l’identification des populations de cellules blastémales précoces et tardives, l’étude de la revascularisation pendant la régénération, et l’étude de l’ossification intramembranous sans besoins complexes de dispositif de stabilisation osseuse. Oussama Qureshi, Alyssa Falck et Katherine Zimmel, technicienne, et Regina Brunaeur, professeure adjointe de recherche de notre laboratoire, feront la démonstration de la procédure avec moi.Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris CD-1 de huit à 12 semaines, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal et placez la souris sous un microscope à dissection de 10 X. Utilisez de l’iode chirurgical de povidone et 70% d’éthanol pour stériliser les chiffres de chaque membre postérieur et utilisez des microscisseurs pour couper les cheveux loin du site chirurgical. Appliquer localement un microlitre de bupivacaine topique pour anesthésier le site chirurgical, et jouer doucement une patte arrière pour exposer la surface des chiffres médiaux.Puis en tenant le scalpel à un angle parallèle à la garniture de graisse, utilisez un scalpel stérile numéro 10 pour amputer la pointe distale de la phalange terminale des chiffres deux et quatre. Appliquez localement un microlitre supplémentaire de bupivacaine sur chaque chiffre amputé et retournez la souris dans une cage propre pour permettre aux plaies de guérir sans pansement et avec surveillance jusqu’à ce qu’elles soient complètement récumbency. Pour assurer un plan d’amputation P3 réussi, maintenez le scalpel parallèle à la graisse pendant l’amputation et effectuez le balayage de micro-CT pour confirmer la longueur correcte d’amputation.Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez un scalpel pour couper le chiffre à mi-chemin à travers l’os de phalange moyenne à peu près le deuxième tampon de graisse ventrale indent. Transférer le tissu dans un flacon de scintillation de 20 millilitres contenant 10 millilitres de formaline de zinc tamponné frais fixatif pendant 24 à 48 heures. Et utilisez un microtome pour acquérir quatre à cinq sections micromètres d’épaisseur de chaque chiffre, plaçant les tranches dans un bain d’eau de 38 à 41 degrés Celsius complété par une solution adhésive histologique au fur et à mesure qu’elles sont obtenues.Ensuite, capturez les tranches sur les glissières adhésives et placez les glissières sur un chauffe-glissière de 37 degrés Celsius pour sécher. Lorsque les glissières ont été déparaffinées, plonger les échantillons dans un bocal de coloration d’une solution appropriée de récupération d’antigène, et chauffer les glissières à 95 degrés Celsius pendant 25 minutes en s’assurant que l’ébullition ne se produit pas. À la fin de l’incubation, laissez le bocal arriver à température ambiante et menter les glissières à plat dans une boîte de diapositives en plastique recouverte d’un pouce de profondeur avec du papier de soie humidifié à la base.Ajouter 100 microlitres de proteinase K préchauré à chaque échantillon. Couvrir chaque toboggan d’une petite bande de parafilm pour s’assurer que les sections ne deviennent pas sèches. Après 12 minutes à 37 degrés Celsius, retirez soigneusement le film de paraffine et égouttez doucement les glissières sur du papier de soie pour éliminer l’excès de solution de blocage.Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres de la solution d’anticorps primaire d’intérêt à chaque diapositive. Retourner les sites dans la chambre humidifiante recouverte de film de paraffine pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, après avoir lavé les glissières en solution saline tamponnée tris plus TWEEN ou TBST, étiquetez les glissières avec une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation de 45 minutes à température ambiante protégée de la lumière.À la fin de l’incubation, lavez les glissières dans tbst et laissez-les sécher. Ensuite, utilisez 100 microlitres de support anti-fondu pour placer soigneusement les couvercles sur les glissières séchées et entreposer les glissières à plat à température ambiante pendant la nuit à l’abri de la lumière pour permettre au milieu de montage de sécher. Pour la tomographie micro-calculée séquentielle in vivo ou micro-CT équiper l’imageur micro-CT avec tube pour permettre l’écoulement de l’oxygène dans et hors de la chambre animale micro-CT, en s’assurant que l’oxygène sortant est équipé d’un filtre à charbon activé pour piéger l’isoflurane.Réglez le Voxelsize à 10,5 micromètres à 55 kilovoltages de pointe et 145 microampes avec 1000 projections par 180 degrés et rotation continue avec un temps d’intégration de 200 millisecondes, ce qui donne un maximum de 213 tranches par balayage. Lorsque le scanner est prêt, placez doucement la souris anesthésiée dans la chambre animale micro-CT avec les chiffres des membres postérieurs disposés en côté ventral d’association plat et étroit vers le haut avec la patte gauche sur le côté gauche et la droite sur le côté droit de la plate-forme de balayage. Appliquez ensuite du ruban chirurgical pour fixer délicatement les chiffres en place.Appliquez de l’onguent ophtalmique sur les yeux de l’animal avant d’amorcer l’analyse. Après la numérisation, retourner l’animal dans une cage propre avec surveillance jusqu’à la pleine récumbence, et laisser jusqu’à plusieurs heures pour la reconstruction de l’image micro-CT. Pour l’analyse de l’image osseuse 3D reconstruite, à l’aide du logiciel fourni avec le micro-CT, convertir les fichiers d’image en une série de fichiers DICOM.Lorsque tous les fichiers ont été convertis, téléchargez la série DICOM dans un seul dossier à l’aide d’un téléchargeur de fichiers par lots dans un navigateur Web. Chargez le plug-in BoneJ dans le dossier plug-in ImageJ. Faites glisser et déposer le dossier de la série de fichiers DICOM dans la barre ImageJ pour ouvrir les fichiers.Une pile d’images 16 bits affichant toutes les valeurs grises sera ouverte. Pour afficher l’os uniquement, cliquez sur Ajuster l’image et seuil. Faites glisser la barre supérieure du seuil vers l’extrême droite et ajustez la barre inférieure du seuil jusqu’à ce que seul l’os soit mis en évidence en rouge.La valeur seuil inférieure sera d’environ 10 000 à 13 000 à une intensité maximale du signal de 32 767. Cliquez sur Appliquer et dans la nouvelle boîte de dialogue, cliquez sur Fond noir. Ensuite, cliquez sur OK. Une image huit bits affichant des valeurs en noir et blanc sera générée.Avec le blanc correspondant à l’os. Dessinez un rectangle autour de l’os P3 pour le sélectionner et dupliquer la pile. Pour générer une image 3D, cliquez sur Plugins et 3D Viewer et utilisez l’outil de sélection à main levée pour encercler l’os à supprimer.Puis cliquez à droite et sélectionnez Sélection fill pour recadrer tout os inutile de l’image. Pour quantifier le volume osseux du rendu 3D, ouvrez le plug-in BoneJ et sélectionnez Fraction volume. Une fenêtre de résultats apparaîtra et le volume d’os affiché en millimètres coupé en cubes.Pour quantifier la longueur osseuse du rendu 3D, utilisez l’outil multipoint ImageJ. Pour capturer une image du rendu 3D, cliquez sur Afficher et prendre un instantané. Enregistrez ensuite l’image sous forme de fichier TIF ou JPEG.Dans ces sections d’images d’une souris adulte régénérant le chiffre de P3 ont été immunotachées avec des anticorps pour visualiser la régénération intramembranous d’os et la formation de blastema au jour six à sept, neuf et 10 post-amputation. Ici, des rendus micro-CT représentatifs des chiffres numérisés avant l’amputation et à divers moments au cours de la régénération avec des repères utilisés pour identifier les mesures de longueur sont montrés. Le modèle de chiffre de souris est un système puissant pour analyser un environnement pro-régénérateur de blessure qui déclenche la formation de blastema une fois amputé à un niveau distal.Inversement, l’amputation proximale des chiffres sert de système modèle pour étudier l’échec régénérateur ainsi qu’un site pour tester des stratégies pour améliorer la régénération.

adult-mouse-digit-amputation-regeneration-simple-model-to-investigate

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Les modèles animaux sont fréquemment utilisés pour imiter des lésions osseuses graves dans la recherche biomédicale. En raison de leur petite taille, l’établissement de lésions osseuses stabilisées chez la souris dépasse les capacités de la plupart des groupes de recherche. Nous décrivons ici une méthode simple pour établir et analyser les défauts fémoraux expérimentaux chez la souris.

Une simple critique de taille fémorale défauts modèle chez la souris

Nous présentons un protocole pour capturer la dynamique de la régénération de la nageoire caudale des larves de poisson-zèbre à l’échelle de l’ensemble du tissu à l’aide de la stéréomicroscopie basée sur le fond clair. Cette technique permet de capturer la dynamique de régénération avec une résolution de cellule unique. Cette méthodologie peut être adaptée à tout stéréomicroscope équipé d’une caméra CCD et d’un logiciel de time-lapse.

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

Un modèle de ténotomie d’Achille et de brûlure de l’ossification hétérotopique permet l’étude fiable de la formation osseuse ectopique induite par un traumatisme sans l’application de facteurs exogènes.

Souris Direct Trauma / Graver Modèle d&#39;ossification hétérotopique

Bien que les modèles murins soient des outils inestimables pour l’ingénierie des tissus osseux, les modèles de défauts osseux longs sont rares. Ce besoin a motivé le développement du protocole actuel qui utilise une plaque de verrouillage avec quatre vis et un gabarit dédié pour réaliser et stabiliser un défaut reproductible, fémoral, de taille critique avec une faible morbidité.

Mise en place d&#39;un segmentaire fémoral Critical-size Defect modèle chez la souris Stabilisé par Plate ostéosynthèse

Cet article décrit comment effectuer une méthode chirurgicale pour inhiber la formation de l’épiderme de la plaie pendant la régénération des membres axolotl en suturant immédiatement une peau de pleine épaisseur sur le plan d’amputation. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les rôles fonctionnels de l’épiderme de la plaie au cours des premiers stades de la régénération des membres.

Inhibition de la formation de l’épiderme de la plaie par chirurgie complète du lambeau de peau pendant la régénération des membres axolotl

Ce protocole décrit une intervention chirurgicale pour l’établissement d’une fracture diaphysaire dans le fémur de souris, qui est stabilisée avec un fil intramédullaire, pour les études de cicatrisation des fractures.

Établissement d’un modèle de fracture du fémur diaphysaire chez la souris

Ce protocole montre étape par étape les détails de la façon d’extraire la première molaire mandibulaire chez la souris. Il fournit une méthode alternative pour les chercheurs qui se concentrent sur la guérison et la régénération des os de la mâchoire.

L’établissement d’un modèle de guérison par voie d’extraction molaire mandibulaire murine

Un protocole pour la chirurgie de l’ostéotomie fémorale avec l’utilisation de la fixation de la plaque interne chez les axolotls matures est présenté. La procédure peut être utilisée pour effectuer des études comparatives sur la régénération des membres et la guérison des fractures chez les amphibiens aquatiques.

Stabilisation d’une ostéotomie fémurienne avec une fixation par plaque chez Ambystoma mexicanum

Dans ce protocole, nous montrons comment préparer le tissu axolotl pour la microscopie à force atomique (AFM) et effectuer des mesures d’indentation dans le cartilage des membres intact et en régénération.

Mesures par microscopie à force atomique du cartilage dans des membres axolotls intacts et en régénération

Le modèle de lésion de la moelle osseuse murine est un outil utile pour étudier l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse. Ce protocole chirurgical simplifié décrit la procédure d’ablation de la moelle osseuse pour l’évaluation en aval de la formation de nouveaux os et des réponses cellulaires après une blessure.

Méthodologie améliorée pour l’étude de l’ostéogenèse postnatale par ossification intramembraneuse dans un modèle de lésion de la moelle osseuse murine

L’objectif de cette étude était de standardiser une approche chirurgicale sûre et reproductible pour réaliser une amputation transversale complète de la mandibule chez Ambystoma mexicanum pour l’étude de la régénération des tissus cranio-faciaux.

Conception et standardisation d’un modèle de lésion mandibulaire pour l’étude de la régénération des tissus craniofaciaux dans le modèle Ambystoma mexicanum

Découvrez l'amputation P3 chez la souris adulte pour étudier la formation du blastème et l'ossification intramembraneuse. Cette méthode permet d'analyser les populations cellulaires critiques et la revascularisation lors de la régénération.

Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation dblastema de mammifères et lossification intramembrane (Vidéo) | JoVE Journal

Amputation et régénération des chiffres de souris adultes : un modèle simple pour étudier la formation d'blastema de mammifères et l'ossification intramembrane

Explorer plus de vidéos