Coincubation Assay pour quantifier les interactions concurrentielles entre Vibrio fischeri Isolates

Notre protocole fournit une approche simple mais robuste pour identifier et caractériser les mécanismes concurrentiels entre les différentes souches de bactéries Vibrio fischeri. Cette méthode utilise des plasmides stables qui codent différents gènes de résistance aux antibiotiques et protéines fluorescentes qui permettent une sélection différentielle et une discrimination visuelle de chaque souche bactérienne dans une culture mixte. Pour commencer, utilisez un cure-dent stérile pour gratter les cellules de la plaque d’agar de la taille d’un grain de riz.

Resuspendez les cellules dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant un millilitre de bouillon LBS. Pour briser les touffes cellulaires, appuyez-les sur le côté du tube, puis pipette de haut en bas vigoureusement. Fermez le tube et le vortex pendant une à deux secondes et répétez si les touffes de cellules sont encore visibles jusqu’à ce que l’échantillon soit visuellement uniforme.

Répétez ces étapes de préparation, du grattage cellulaire au vortex pour tous les échantillons. Mesurez et enregistrez la densité optique à 600 nanomètres pour tous les échantillons. Pour obtenir une mesure précise de la DO, diluer les échantillons jusqu’à 10 fois à l’aide du bouillon LBS.

Ensuite, normalisez chaque échantillon à l’OD 600 désiré. Pour mélanger la souche de référence et la souche concurrente dans un rapport un à un, ajouter 100 microlitres de chaque souche normalisée à OD 1.0 à un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté et vortex pendant une à deux secondes. Comme un contrôle, mélanger la souche de référence avec une version marquée différentielle de lui-même et vortex ainsi.

Il est essentiel d’atteindre le bon rapport de départ car il peut considérablement changer le résultat de l’expérience. Pour assurer le succès, cette étape peut nécessiter une optimisation pour une espèce bactérienne donnée. Après avoir répété cette étape pour chaque réplique biologique, il devrait y avoir quatre répliques biologiques avec des souches de référence marquées différemment comme témoins et quatre répliques biologiques avec des souches de référence et de concurrents marquées différemment.

Pour créer des taches de culture qui seront utilisées pour la microscopie par fluorescence après l’incubation, ajoutez 10 microlitres de chaque mélange de contrôle et expérimentaux sur une plaque de Petri contenant de l’agar LBS. Après que les taches ont complètement séché sur le banc, couver les plaques à 24 degrés Celsius pendant 24 heures. Pour créer des taches de culture qui seront utilisées pour quantifier les unités de formation de la colonie pour chaque souche à la fin de l’expérience, ajoutez 10 microlitres de chaque mélange de contrôle et expérimentaux en 24 plaques de puits contenant un millilitre d’agar LBS par puits.

Une fois les taches complètement séchées, incuber les plaques à 24 degrés Celsius pendant cinq heures. Pour effectuer une dilution en série des mélanges de cocubation de départ, faites pivoter une plaque de puits de 96 degrés de sorte qu’il y ait huit colonnes et 12 rangées. Étiquetez chaque ligne avec l’ID de contrainte, le numéro de répétition, et le temps commençant par t zéro.

Étiquetez les plaques d’agar LBS complétées par l’antibiotique approprié sur lequel repérer la série de dilution tout en s’assurant d’identifier la souche pour laquelle chaque plaque antibiotique sélectionne. À l’aide d’une pipette multicanal, ajouter 180 microlitres de bouillon LBS à chaque puits, laissant la première colonne vide pour le mélange de cocubation non dilué. À l’aide d’une pipette à canal unique de 200 microlitres, transférer 100 microlitres du mélange de co-incubation du tube vers le premier puits de la première colonne, puis jeter la pointe et répéter pour tous les mélanges de cocubation.

Avec une pipette multicanal, transférer 20 microlitres de la colonne un à la colonne deux et pipette de haut en bas pour mélanger. Jetez les pointes et répétez pour chaque colonne tout en étant compatible avec le nombre de pipetting de haut en bas pour chaque dilution. À la fin, chaque rangée contiendra une dilution en série 10 fois du mélange initial.

Utilisez une pipette multicanal munie de huit pointes pour aspirer cinq microlitres de chaque puits dans une série de dilution et repérer sur la plaque d’agar LBS complétée par Kanamycin qui sélectionne pour la souche de référence. Répétez cette étape pour sélectionner pour la souche concurrente spotting sur la plaque complétée chloramphénicol. Une fois les taches complètement séchées, placez les plaques dans l’incubateur à 24 degrés Celsius.

Après que les taches de cocubation et les 24 plaques de puits ont été incubées pendant cinq heures à 24 degrés Celsius, ajoutez un millilitre de bouillon LBS à chaque puits. Resuspendez en pipetage de haut en bas jusqu’à ce que toutes les cellules ont été résuspendus étant compatible avec la vigueur dans laquelle les cellules sont résuspendées à travers toutes les répliques. Une fois que chaque point de co-incubation est réutilisé, préparer une plaque de puits 96 pour une dilution en série et des plaques d’agar LBS avec les antibiotiques appropriés sur lesquels repérer la dilution de la même manière que précédemment fait.

Pour compléter la dilution en série pour les mesures finales t dans les 24 plaques de puits, effectuer des étapes utilisées pour la dilution en série de l’inoculum de départ et repérer chaque dilution sur les plaques d’agar LBS comme cela a été fait précédemment. Procédez à l’imagerie des taches de cocubation sur les plaques Petri et à l’analyse des données décrites dans le manuscrit. Dans le traitement expérimental, la souche de référence et la souche concurrente une souche sont présentes à une proportion de 0,5 au début et à la fin de l’expérience compatible avec le traitement de contrôle.

Les valeurs RCI du journal n’étaient pas statistiquement différentes de zéro pour le traitement de contrôle ou lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente 1. Ces données suggèrent qu’il n’y avait pas de concurrence entre la souche de référence et la souche concurrente. En revanche, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente deux, la souche de référence est passé d’une proportion de 0,5 au début à une proportion inférieure à 0,01 à la fin de l’expérience.

De plus, les valeurs rci des grumes étaient significativement supérieures à zéro lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente deux. Ensemble, ces données indiquent que la proportion de la souche de référence a diminué en présence de la souche concurrente deux suggérant la concurrence entre les souches. Lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente 1, les FC des deux souches ont augmenté au cours de cinq heures et n’étaient pas significativement différentes, ce qui donne à penser qu’aucune concurrence ne s’est produite.

De plus, on a observé une récupération d’environ 3 200 %, ce qui n’était pas statistiquement différent du contrôle. Toutefois, lorsque la souche de référence a été incubée avec la souche concurrente deux, les CFC de souche de référence étaient significativement inférieurs à la souche deux FC dans le contrôle à cinq heures. En outre, environ 4% de récupération a été observé sensiblement inférieur au contrôle.

Au total, ces données indiquent que la souche deux sur concurrencé la souche de référence en tuant ses cellules. L’étape la plus importante dans cette procédure est d’atteindre le bon rapport de départ car il peut avoir un impact significatif sur les résultats.