Name: Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Apprenez à générer des ARN circulaires via un système d'expression génomique utilisant des éléments Alu et l'épissage alternatif. Cette méthode permet d'étudier leur fonction et leur association aux maladies.

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Ce travail a été soutenu par le ministère de la Défense DoD subvention AZ180075. Stefan Stamm remercie Jacqueline Noonan Endowment. Anna Pawluchin a été soutenue par le DAAD, programme allemand d’échange académique, Justin R. Welden a été récipiendaire de l’Université du Kentucky Max Steckler Award.

1. Conception des constructions
<ol><li>Utilisez le navigateur24 du génome de l’UCSC pour identifier les éléments répétitifs nécessaires à la formation circulaire d’ARN et les incorporer dans les constructions. Fait important, les amorces pour l’amplification doivent être en dehors des éléments répétitifs.</li>
	<li>Coller la séquence circulaire d’ARN(figure supplémentaire 1 est une séquence d’essai) en <a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start" target="_blank">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start</a> et sélectionnez le bon organisme. Soumettez la séquence et rendez-vous sur la vue du navigateur, zoomez sur 1.5x ou le cas(figure 2A). REMARQUE : La séquence de recherche apparaît dans la ligne supérieure(figure 2A, 1). Selon l’ordre des exons dans l’ARN circulaire, BLAT ne reliera pas tous les exons. Dans cet exemple, exon 12(figure 2A, 4) n’est pas relié à 11(figure 2A, 2, 3), parce que l’exon 12 est en amont de l’exon 11 dans la séquence circulaire d’ARN(figure supplémentaire 1). Les éléments répétitifs se trouvent sur la piste du « masque à répétition », indiquée par les boîtes, où la couleur noir à gris indique la conservation évolutive(figure 2A, 5).</li>
	<li>Souris sur les éléments répétitifs pour identifier leur sous-type dans une fenêtre flottante. Les éléments Alu sont dans la ligne SINE (élément nucléaire entrecoupé court). Utilisez le bouton « pistes par défaut » sous la fenêtre pour réinitialiser le navigateur si une image différente de la figure 2 est obtenue. REMARQUE : Le moussage sur les exons dans l’affichage de gène génère une fenêtre avec des nombres d’exon qui sont générés par ordinateur. Ces chiffres ne correspondent pas à la numérotation exon établie dans la littérature et changent également entre les isoformes.</li>
</ol>2. Sélectionnez la séquence à cloner dans un vecteur d’expression
<ol><li>Téléchargez la séquence d’ADN montrée dans la fenêtre en allant voir l’ADN sur la ligne supérieure du navigateur du génome de l’UCSC. Dans l’option de mise en forme de séquençage, sélectionnez des options de cas/couleur étendues.</li>
	<li>Sélectionnez le cas par défaut comme inférieur et sélectionnez le cas de basculement pour NCBI refseq. Sélectionnez souligner, et audacieux, et italique pour Repeat Masker. Cliquez sur Soumettre. Il y aura des exons comme majuscules et introns comme de petites lettres. Vérifiez les frontières exon/intron.</li>
	<li>Dans cet exemple, il existe une séquence 'ccctttacCTTTTT', indiquant que le navigateur affiche le complément inverse. Si c’est le cas, revenez en arrière et sélectionnez la boîte de complément inversée jusqu’à ce que vous voyez les frontières intrones exon correctes (agEXONgt), dans cet exemple AAAAAGgtaaaggg.</li>
	<li>Copiez le fichier avec la bonne orientation (les exons internes sont entourés d’ag introniques... gt) dans un document de traitement de texte et mettre en évidence les exons(figure supplémentaire 2). REMARQUE : Dans cet exemple, le fragment génomique qui englobe les exons 9-12 est d’environ 24 kb et donc trop grand pour être amplifié à partir de l’ADN génomique. Par conséquent, chaque exon entouré d’environ 1 kb région intronique est individuellement amplifié et ces quatre fragments sont assemblés dans un vecteur de clonage.</li>
	<li>Sélectionnez des fragments à amplifier (exon 500 nt intron). Assurez-vous que l’intron ne commence pas ou ne se termine pas dans une région répétitive, car les amorces dans ces régions n’amplifieront pas des séquences spécifiques. Les régions sélectionnées sont indiquées dans la figure 2B, et leurs séquences sont affichées dans la figure supplémentaire 3. REMARQUE : En général, plus les constructions sont grandes, plus le clonage sera difficile. Les fragments peuvent être assemblés soit étape sage (c.-à-d., exon 9 est combiné avec le vecteur et dans l’étape suivante exon 10 est introduit dans cette construction via le clonage jusqu’à ce que tous les exons sont en place), ou alternativement, tous les fragments sont assemblés simultanément. Une approche progressive fonctionne toujours mais demande plus de temps. Un assemblage simultané ne fonctionne pas toujours et dépend de la façon dont les fragments individuels peuvent être amplifiés à partir de l’ADN génomique et de la taille globale de la construction. Nous commençons donc généralement par les deux approches simultanément.</li>
</ol>3. Amorce de conception pour le clonage
<ol><li>Utilisez un outil web (<a href="https://nebuilder.neb.com/#!/" target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a>) pour concevoir les amorces pour le clonage. Par exemple, entrez les fragments 9, 10, 11 et 12 et la séquence vectorielle(figure supplémentaire 3) à cet outil.</li>
	<li>Pour la séquence vectorielle, ajoutez le site d’insertion comme dernier nucléotide et ajoutez ensuite les fragments. Comme la numérotation vectorielle ne commence pas par un site d’insertion donné, le site d’insertion dans le vecteur est situé et la partie en aval est mise en face de la séquence en amont. Dans cet exemple, les encarts commencent directement après le site HindIII [AAGCTT] et se terminent directement après le site PmeI [GTTTAAAC] de pcDNA3.1. La séquence de cccgctgatcag ... ccgtaaaaaggccgc est collé devant la position 1 dans la séquence pcDNA3.1 (gttgctggcgtttttcc...).</li>
	<li>Ajuster les amorces si leurs points de fusion sont à plus de 4 oC d’intervalle, car ils ne fonctionneront pas dans l’amplification. L’assemblage des fragments et des séquences d’amorce conçus sont indiqués dans la figure supplémentaire 4. Les amorces pour le clonage peuvent également être conçues manuellement25.</li>
</ol>4. Détection PCR et amplicon
<ol><li>Réaction PCR standard : Faites un mélange de réaction pour un volume total de 50 l par réaction. Voici la recette d’une réaction à l’aide de polymérase 1: 10 l de 5x Reaction Buffer 1 L de 10 mM dNTPs 2.5 L de 10 'M Forward Primer 2.5 L de 10 'M Reverse Primer 0.5 L de Polymérase 1 32.5 L de Nuclease libre H2O<ol>
<li>Optionnellement, ajoutez 10 L de 5x GC Enhancer si le produit a une teneur élevée en GC; faire un mélange séparé contenant GC Enhancer pour tester la réaction PCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aliquot 49 L du mélange dans des tubes PCR par échantillon de réaction.</li>
	<li>Ajoutez 1 L d’ADN au PCR, la quantité varie de 10 pg à 1 ng.</li>
	<li>Faites tourner les échantillons pour enlever les résidus sur les côtés et les placer dans une machine PCR. Utilisez la même machine ainsi que les mêmes taches dans la machine lors de l’optimisation des conditions PCR.</li>
</ol>5. Optimisation pour des fragments d’ADN plus longs pour l’utilisation de différentes polymérases
<ol><li>Température<ol>
<li>Optimisez la polymérase 2 à longue portée.<ol>
<li>Utilisez une température de dénaturation plus basse (Polymérase 1 : 98 oC, Polymérase 2 : 94 oC).</li>
			<li>Utilisez un temps de dénaturation plus long (Polymérase 1: 10 s, Polymérase 2: 30 s).</li>
			<li>Utilisez un temps d’annealing plus long (Polymérase 1: 30 s, Polymérase 2: 60 s).</li>
			<li>Utilisez un temps de prolongation plus long (Polymérase 1: 30 s/kb, Polymerase 2: 50 s/kb).</li>
			<li>Utilisez une température d’extension plus basse (Polymérase 1 : 72 oC, Polymérase 2 : 65 oC).</li>
			<li>Utilisez une température d’annealing de 5 oC sous le Tm des amorces.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Optimisez les concentrations d’amorce (5x de moins à 5x de plus que la concentration d’apprêt d’origine). Optimiser les concentrations d’ADN de 10 pg à 50 pg, 100 pg, 1 ng, 5 ng, 10 ng.</li>
		<li>À titre d’exemple d’un programme DE PCR visant à amplifier une taille de produit de 15 kb à l’aide de polymérase 2, effectuer une dénaturation initiale à 94 oC pour 30 s, la dénaturation de l’ADN à 94 k.-O pour 30 s, suivie de l’annealing à 58 oC pour 30 s, et une extension de l’ADN à 65 oC pour 12 min 30 s. Effectuer une extension finale à 65 oC pendant 10 min avec une dernière cale de 4 oC. REMARQUE : La température d’annealing (Ta) spécifique pour les amorces déterminées par des calculs de température web qui sont spécifiques pour chaque polymérase. Les délais d’extension peuvent varier et doivent être optimisés si les fragments sont plus grands que 10 kb.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Temps d’extension et concentrations d’ADN<ol>
<li>Utiliser des délais d’extension plus longs pour les fragments d’ADN de plus de 6 kb : 1 min par 1 kb. Les fragments plus longs devraient utiliser moins d’ADN.</li>
		<li>Effectuez des dilutions de l’ADN pour trouver la concentration optimale d’ADN pour l’amplification, habituellement 1 pg à 1 ng pour les plasmides ou 1 ng à 1 g pour l’ADN génomique. REMARQUE : Pour la plupart des clonage emploient la polymérase 1, conçu en fusionnant le domaine de liaison d’ADN Sso7d à une polymérase thermostable propriétaire de polymérase26. La polymérase a un faible taux d’erreur et en raison du domaine Sso7d une haute processivité, nécessaire pour amplifier de grands fragments génomiques (10-15 kb). En raison de cette grande taille de fragment, l’assemblage enzymatique des molécules d’ADN27 est utilisé pour l’insertion dans les vecteurs, car cette méthode ne nécessite pas d’enzymes de restriction. L’amplification des fragments de plus de 15 kb devient de plus en plus difficile avec la polymérase 1. Pour une grande amplification des fragments, utilisez la polymérase 2 à partir de pyrocoque-commela polymérase relectrée fusionnée à Sso7d ou le kit PCR à longue portée qui donne, cependant, des taux d’erreur plus élevés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Purification des produits PCR pour le clonage
<ol><li>Exécuter la moitié des produits PCR sur 1% gels d’agarose contenant une tache d’acide nucléique intercalante (par exemple, 1x GelGreen). Visualisez les gels tachés sur un transilluminateur de lecteur foncé. Cet ADN taché ne fonctionne pas fidèle à la taille. REMARQUE : GelGreen s’intercale dans l’ADN, semblable au bromure d’éthédé, mais il est excité par la lumière autour de 500 nm (cyan), une longueur d’onde qui n’endommage pas l’ADN, ce qui améliore fortement le clonage.</li>
	<li>En parallèle, exécuter la moitié des produits PCR sur un gel de 1% qui est taché après l’exécution avec du bromure d’éthidium (figure 3A,B).</li>
	<li>Accisez les bandes de la bonne taille du gel taché (étape 6.1) et isolez l’ADN à l’aide d’un gel et d’un kit de nettoyage PCR. En écartant son protocole standard, elute l’ADN dans seulement 20 L d’eau distillée double, comme habituellement les concentrations d’ADN sont faibles.</li>
	<li>Avant le clonage, vérifiez l’ADN isolé sur un gel d’agarose pour la concentration et l’intégrité(figure 3B). Visez un rapport d’insertion de 2:1 molaire/vecteur. Lors de l’utilisation de plusieurs inserts, le rapport est de 2:2:2:1.</li>
</ol>7. Détection d’assemblage d’ADN et de clone
REMARQUE : Le clonage se fait à l’aide d’une trousse d’assemblage d’ADN enzymatique, avec des modifications mineures. L’assemblage est effectué pendant 60 min à 50 oC et généralement la gamme inférieure d’ADN est utilisée pour l’assemblage (20-100 fmol/20 'L réaction). Le mélange de réaction entier est ajouté aux cellules chimiques compétentes et les cellules entières plaquées sur une plaque d’agar de 6 cm.
<ol><li>Mélanger le vecteur et insérer dans un rapport de 1:2 molaire (20-500 fmol chacun) dans 10 L d’eau.</li>
	<li>Ajouter 10 L de mélange maître d’assemblage d’ADN.</li>
	<li>Incuber des échantillons pendant 60 minutes à 50 oC.</li>
	<li>Ensuite, transformer les cellules compétentes avec la réaction totale d’assemblage. Ici, utilisez la souche E. coli 1 cellules pour des constructions plus courtes ou la souche E. coli 2 cellules pour des constructions plus longues ou instables. Les cellules doivent être dans un volume de 50 L.</li>
	<li>Décongeler les cellules sur la glace et ajouter 2 l de produit assemblé réfrigéré aux cellules compétentes. Mélanger en clignotant doucement le tube 4-5 fois. Ne pas vortex.</li>
	<li>Laisser reposer le mélange sur la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Choc thermique à 42 oC pour 30 s. Ne mélangez pas.</li>
	<li>Transférer le tube dans la glace pendant 2 min.</li>
	<li>Ajouter 950 L de SOC Media à température ambiante dans le tube.</li>
	<li>Incuber le tube de réaction à 37 oC pendant 60 min. Shake vigoureusement (300 tr/min).</li>
	<li>Plaques de sélection chaudes avec l’antibiotique approprié pendant l’incubation à 37 oC.</li>
	<li>Pelletez les cellules par centrifugation (10 000 x g,30 s) et plaquez 1/4 et 3/4 des cellules sur deux plaques de sélection et incuber à 37 oC pendant la nuit.</li>
</ol>8. Validation des clones
<ol><li>Utilisez la colonie PCR, en utilisant des amorces PCR couvrant les sites d’assemblage (figure 1C) pour la détection.</li>
	<li>Prenez un cure-dent stérile et touchez une seule colonie bactérienne.</li>
	<li>Touchez le fond d’un tube PCR avec le cure-dent qui a la colonie, puis strez le cure-dent sur une plaque d’agar antibiotique, incuber la plaque strié à 37 oC ou température ambiante pour les constructions sensibles pendant la nuit.</li>
	<li>Superposer le tube PCR touché par la colonie avec un mélange PCR contenant les amorces de détection. Ceux-ci sont conçus à l’aide de l’amorce 3 (<a href="http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/" target="_blank">http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</a>). Le programme a la possibilité de forcer la conception d’apprêt à travers une séquence définie en utilisant les panneaux « [ccc] » pour sélectionner les amorces à travers la jonction d’assemblage. L’ADN des souches positives est isolé et vérifié par séquençage.</li>
</ol>9. Analyse de l’ARN circulaire exprimant les gènes des journalistes
<ol><li>Pour l’analyse, transfect gènes de reporter dans les cellules eucaryotes. Ici, utilisez les cellules HEK293 (ATTC #CRL-1573) car elles donnent une efficacité transfection élevée. Pour économiser des coûts, utilisez des solutions PEI (polyéthylèneimine).</li>
	<li>Pour la solution de l’Ile-du-Prince-Édouard, dissoudre l’hydrochlorure linéaire de polyéthylèneimine (PEI) à 1 mg/mL dans l’eau à faible pH, pH 2. Apportez le pH à 7 avec NaOH. Filtre stérile avec filtres de 0,22 m et stockez à 4 oC.</li>
	<li>Diviser les cellules en six puits (environ 150 000 cellules par puits) et les laisser se développer du jour au lendemain en 10 % de FBS dans les médias DMEM.</li>
	<li>Aliquot 1 g du gène reporter dans un tube stérile et ajouter 200 lil de 150 mM filtré stérile NaCl. Mélanger avec l’ADN par vortexing.</li>
	<li>Ajoutez la solution de l’Ile-du-Prince-Édouard à ce mélange et au vortex, brièvement centrifugeuse pour prélever des échantillons au fond du tube. Utilisez un rapport de 1 g d’ADN par 3 lil de l’Ile-du-Prince-Édouard.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 10 min, puis ajouter directement aux cellules HEK 293.</li>
	<li>Incuber les cellules HEK293 à 37 oC, 5% de CO2, du jour au lendemain.</li>
	<li>Isolez l’ARN pour RT-PCR via un kit d’isolation d’ARN.</li>
</ol>10. Traitement RNase R pour enlever les ARN linéaires
<ol><li>Utilisez 10 g d’ARN total dans un tube sans RNase.</li>
	<li>Ajouter 10 L de tampon RNase R (0,2 M Tris-HCl (pH 8.0), 1 M KCl, 1 mM MgCl2) à l’ARN.</li>
	<li>Ajouter RNase R à l’ARN (1 l à 20U).</li>
	<li>Ajouter 1 l de bleu glycol à l’ARN et porter le volume jusqu’à 100 ll avec de l’eau stérile.</li>
	<li>Incuber les échantillons à 37 oC pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 100 L de phénol/chloroforme et le vortex pendant 1 min.</li>
	<li>Centrifugeuse à 21 000 x g pendant 1 min pour séparer les phases.</li>
	<li>Prenez le supernatant (phase aqueuse) et ajoutez 1 volume (environ 80 l de chloroforme).</li>
	<li>Vortex pendant 1 min, puis centrifugeuse pendant 1 min pour séparer les phases.</li>
	<li>Prenez supernatant, ajoutez 1:10 vol KAc et 2.5 vol d’éthanol, et précipitez à -20 'C pour 1-4 h. Centrifugeuse à 4 'C pour 30 minutes à pleine vitesse (21.000 x g). Il y aura une petite boulette bleue au fond.</li>
	<li>Retirer le supernatant et laver avec 80% d’éthanol. Laisser sécher l’air pendant 5 min à température ambiante et dissoudre dans l’eau de 10 l.</li>
</ol>11. Analyse RT-PCR
<ol><li>Utilisez 1 g d’ARN par réaction RT.</li>
	<li>Faites un mélange de réaction pour un volume total final de 20 l par réaction. Pour une réaction, utilisez 1 l de 10 dNTP de 10 mM, 1 L de 0,1 M Dithiothreitol (DTT), 4 L de 5x First-Strand Buffer, et 0,5 l de Reverse Transcriptase.</li>
	<li>Aliquot 6.5 'L de mélange de réaction dans de nouveaux tubes PCR.</li>
	<li>Mélanger jusqu’à 5 amorces dans un mélange. Cependant, certaines amorces peuvent mal jumeler avec d’autres amorces dans le PCR(figure 5). Les séquences d’apprêt sont dans le tableau 2. Nous utilisons régulièrement des amorces exon-jonction spécifiques aux gènes, mais l’amorçage avec des hexamers aléatoires est également possible.</li>
	<li>Ajouter 1 L de l’amorce inverse de 10 M au tube de réaction RT désiré.</li>
	<li>Ajouter 1 g d’ARN au tube de réaction PCR.</li>
	<li>Ajouter le H2O sans RNase jusqu’à un volume total de 20 L.</li>
	<li>Tourner les tubes vers le bas pour enlever les résidus sur le côté des tubes et placer dans le thermocycler.</li>
	<li>Exécuter la réaction RT en thermocycler à 50 oC pendant 50 minutes.</li>
	<li>Stockez l’ADNC de RT à -20 oC ou procédez à la réaction du PCR.</li>
</ol>

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<li>Fejes-Toth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+processing+generates+a+diversity+of+5%27-modified+long+and+short+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional processing generates a diversity of 5'-modified long and short RNAs.</a> Nature. 457 (7232), 1028-1032 (2009).</li>
<li>Gao, Q. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+regulation+of+tau+exon+10%2C+whose+missplicing+causes+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Complex regulation of tau exon 10, whose missplicing causes frontotemporal dementia.</a> Journal of Neurochemistry. 74 (2), 490-500 (2000).</li>
<li>Hartmann, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+of+human+tau+exon+10+by+phosphorylation+of+splicing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing of human tau exon 10 by phosphorylation of splicing factors.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 18 (1), 80-90 (2001).</li>
<li>Wang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+backsplicing+produces+translatable+circular+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Efficient backsplicing produces translatable circular mRNAs.</a> RNA. 21 (2), 172-179 (2015).</li>
<li>Yang, Y., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+GFP-Based+Reporter+to+Study+Back+Splicing+and+Translation+of+Circular+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Constructing GFP-Based Reporter to Study Back Splicing and Translation of Circular RNA.</a> Methods in Molecular Biology. 1724, 107-118 (2018).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+profiling+reveals+an+abundant+circHIPK3+that+regulates+cell+growth+by+sponging+multiple+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.</a> Nature Communications. 7, 11215(2016).</li>
<li>Jia, W., Xu, B., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+RNA+expression+profiles+of+mouse+ovaries+during+postnatal+development+and+the+function+of+circular+RNA+epidermal+growth+factor+receptor+in+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Circular RNA expression profiles of mouse ovaries during postnatal development and the function of circular RNA epidermal growth factor receptor in granulosa cells.</a> Metabolism. 85, 192-204 (2018).</li>
<li>Liang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Output+of+Protein-Coding+Genes+Shifts+to+Circular+RNAs+When+the+Pre-mRNA+Processing+Machinery+Is+Limiting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting.</a> Molecular Cell. 68 (5), 940-954 (2017).</li>
<li>Legnini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circ-ZNF609+Is+a+Circular+RNA+that+Can+Be+Translated+and+Functions+in+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis.</a> Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+circRNA+Biogenesis+and+Function+with+NF90%2FNF110+in+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection.</a> Molecular Cell. 67 (2), 214-227 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biogenesis+of+Nascent+Circular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Biogenesis of Nascent Circular RNAs.</a> Cell Reports. 15 (3), 611-624 (2016).</li>
</ol>

Rien à divulguer.

En général, les ARN circulaires sont faibles abondants1, ce qui complique l’étude de leur fonction et de leur formation. Semblable aux ARN linéaires13, l’utilisation de minigènes reporter permet l’identification des cis et des facteurs trans-acteurs qui régulent la formation d’ARN circulaires. Ainsi, cette approche génère des hypothèses qui peuvent être testées plus en utilisant les gènes endogènes.
L’étape la plus critique est la conception du g...

Arn circulaires Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN échoués isolés fermés covalentement qui sont exprimés dans la plupart des organismes. Ils sont générés en rejoignant un site d’épissage en aval 5' à un site d’épissage en amont 3', un processus appelé back-splicing (Figure 1A)1. Les séquences de l’ARNM pré-mRNA qui présentent une base complémentaire aussi courte que 30-40 nt apportent des sites d’attelle arrière dans un alignement approprié pour la formation d’ARN2. Chez l’homme, les éléments Alu 1, représentant environ 11% du génome3, forment de vastes structures d’ARN double brin dans l’ARN pré-mRNA en raison de leur auto-complémentarité4,5 et favorisent ainsi la formation de circRNAs1.
À l’heure actuelle, trois fonctions principales des circARN ont été décrites. Certains circRNAs lient microARN (miRNAs) et par la séquestration agissent comme des éponges miRNA6. Les CircRNAs ont été impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle, par la concurrence avec l’épissage linéaire7 ou la modulation de l’activité du facteur de transcription8. Enfin, les circARN contiennent de courts cadres de lecture ouverts et des études de preuve de principe montrent qu’ils peuvent être traduits9,10. Cependant, la fonction de la plupart des circRNAs reste énigmatique. La majorité des ARN circulaires ont été détectés à l’aide de méthodes de séquençage de nouvelle génération11. Des analyses détaillées des gènes individuels à l’aide d’approches ciblées RT-PCR révèlent qu’un grand nombre d’ARN circulaires reste à découvrir12.
Utilisation de gènes reporter pour analyser le traitement pré-mRNA L’analyse de l’ARNm dérivée des constructions de reporter d’ADN transfected dans des cellules est une méthode bien établie pour étudier l’épissage alternatif d’ARNm, qui peut être appliqué aux ARN circulaires. En général, l’exon alternatif, ses introns environnants, et les exons constitutifs sont amplifiés et clonés dans un vecteur d’expression eucaryote. Fréquemment, les introns sont raccourcis. Les constructions sont transfected dans des cellules eucaryotes et généralement analysés par RT-PCR13,14. Cette approche a été largement utilisée pour cartographier les sites d’épissage réglementaire et les facteurs trans-acteurs dans les expériences de co-transfection13,15,16,17,18. En outre, la génération de minigènes exprimant des protéines a permis le dépistage des substances qui changent l’épissage alternatif19,20.
La méthode a été appliquée aux ARN circulaires. À l’heure actuelle, au moins 12 épines dorsales minigène ont été décrites dans la littérature et sont résumées dans le tableau 1. À l’exception du système d’expression basé sur l’ARN TRNA21,22, ils sont tous dépendants des promoteurs de polymérase II. Ici, nous décrivons une méthode pour générer des minigènes de reporter humain pour déterminer les cis et les facteurs trans-agissant impliqués dans la génération des ARN circulaires. Un aperçu de la méthode à l’aide de séquences d’un gène reporter publié23 est montré dans la figure 1.

<table><tbody><tr><td>(PEI) Chlorhydrate</td><td>Polysciences</td><td>24765-1</td><td></td></tr><tr><td>Outil de construction</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/ » target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Dark Reader Transilluminator.</td><td>Clare Chemical Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit d’assemblage d’ADN enzymatique</td><td>NEB</td><td>E2621S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage sur gel et PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Glyco Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 site de clonage</td><td>Site de polyclonage</td><td></td><td><a href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf » target="_blank">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_1_man.pdf</a></td></tr><tr><td>Polymérase 1</td><td>NEB</td><td>M0491L</td><td>Q5 ADN polymérase</td></tr><tr><td>Polymérase 2</td><td>Biorad</td><td>1725310</td><td>Polymérase à longue portée (NEB), iproof (BioRad)</td></tr><tr><td>Polymérase 2</td><td>Qiagen</td><td>206402</td><td>Qiagen kit polymérase longue portée</td></tr><tr><td>Transcriptase inverse</td><td>Thermo Fisher</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>kit d’isolement d’ARN</td><td>Life Technologies</td><td>12183025</td><td>Ambion by Life Technologies</td></tr><tr><td>RNAse R</td><td>Lucigen</td><td>RNR07250</td><td>Epicenter/Lucigen</td></tr><tr><td>Cellules compétentes stables</td><td>NEB</td><td>C3040H</td><td>Cellules stables NEB</td></tr><tr><td>Bactéries clonantes standard</td><td>NEB</td><td>C2988J</td><td>NEB5-alpha outil</td></tr><tr><td>Web compétent pour la conception d’amorces</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://nebuilder.neb.com/#!/ » target="_blank">https://nebuilder.neb.com/#!/</a></td></tr><tr><td>Calculs de température basés sur le Web</td><td>NEB</td><td></td><td><a href="https://tmcalculator.neb.com/#!/main » target="_blank">https://tmcalculator.neb.com/#!/main</a></td></tr></tbody></table>

utilisation d’un élément alu contenant des minigènes pour analyser les arn circulaires

Use of Alu Element Containing Minigenes to Analyze Circular RNAs

En plus des ARM linéaires, de nombreux gènes eucaryotes génèrent des ARN circulaires. La plupart des ARN circulaires sont générés en rejoignant un site d’épissage 5' avec un site d’épissage en amont 3' dans un pré-mRNA, un processus appelé back-splicing. Cette circularisation est probablement facilitée par des structures secondaires dans le pré-mRNA qui amènent les sites d’épissage à proximité. Dans les gènes humains, les éléments Alu sont pensés pour promouvoir ces structures secondaires d’ARN, car les éléments d’Alu sont abondants et présentent des complémentarités de base les unes avec les autres lorsqu’ils sont présents dans des directions opposées dans l’ARN pré-m. Ici, nous décrivons la génération et l’analyse de grand élément Alu contenant des gènes de reporter qui forment des ARN circulaires. Grâce à l’optimisation des protocoles de clonage, des gènes reporter avec jusqu’à 20 kb de longueur d’insertion peuvent être générés. Leur analyse dans les expériences de co-transfection permet d’identifier les facteurs réglementaires. Ainsi, cette méthode peut identifier les séquences d’ARN et les composants cellulaires impliqués dans la formation circulaire d’ARN.

Les gènes de reporter permettent la détermination des facteurs réglementaires qui influencent la formation circulaire d’ARN. Cependant, ces gènes de reporter sont grands et contiennent des éléments répétitifs qui rendent souvent les constructions d’ADN instables. En raison de leur grande taille, il est souvent nécessaire de supprimer des parties des introns, qui est atteint en amplifiant les pièces génomiques contenant les exons et les parties introniques flanquantes plus petites. Ces morceaux d’ADN sont assemblés enzyma...

Nous cloner et analyser les gènes des reporters générant des ARN circulaires. Ces gènes reporter sont plus grands que les constructions pour analyser l’épissage linéaire et contenir des éléments Alu. Pour étudier les ARN circulaires, les constructions sont transfected dans les cellules et l’ARN résultant est analysé à l’aide de RT-PCR après l’élimination de l’ARN linéaire.

Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

In addition to linear mRNAs, many eukaryotic genes generate circular RNAs. Most circular RNAs are generated by joining a 5&#39; splice site with an ...

Ce protocole est significatif parce qu’il permet à l’utilisateur de générer un système d’expression génomique qui peut subir d’autres épissages et dans ce cas former des ARN circulaires qui peuvent être testés pour leur fonction et l’association de la maladie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle ouvrira la voie à d’autres pour utiliser ce protocole en biologie moléculaire et clonage lors de l’étude de l’épissage alternatif dans la formation et la fonction circulaires de l’ARN. Mon conseil à quelqu’un qui essaie cette technique pour la première fois serait d’optimiser les conditions PCR.Exécutez des gradients ou exécutez pcr touchdown avec différentes températures d’annealing et temps d’extension. Habituellement, des fragments plus longs de plus de six KB prolongeront un KB par cycle et différentes températures d’annealage devraient être testées pour la meilleure amplification. La démonstration de cette méthode est essentielle car elle donnera aux utilisateurs une meilleure représentation visuelle des aspects les plus difficiles de la procédure, en particulier la génération d’amorce.Pour commencer cette procédure, chargez le navigateur ucsc génome et l’utiliser pour

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Linéaire amplification médiée (LAM)-PCR est une méthode mise au point pour identifier la position exacte de l'intégration des vecteurs viraux dans le génome. La technique a évolué pour devenir la meilleure méthode pour étudier la dynamique clonale chez les patients de thérapie génique, de la biosécurité de nouvelles technologies de vecteur, la diversité des lymphocytes T, des modèles de cellules souches du cancer, etc...

Amplification linéaire d&#39;une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant

Cette vidéo montre les étapes de base pour effectuer une analyse du transcriptome entier sur des échantillons de moelle épinière embryonnaire de poussin disséqués après transfection avec électroporation in ovo.

ARN-Seq analyse de l&#39;expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière

Cet article présente une méthode sensible appelée Circle-Seq pour purifier l’ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA). La méthode comprend la purification en colonne, l’élimination de l’ADN chromosomique linéaire restant, l’amplification en cercle roulant et le séquençage à haut débit. Circle-Seq est applicable au criblage à l’échelle du génome de l’ADNcc eucaryote et à l’étude de l’instabilité du génome et de la variation du nombre de copies.

Purification de l&#39;ensemble du génome de l&#39;ADN extrachromosomique circulaire à partir de cellules eucaryotes

Deux différentes 3' amplification rapide des extrémités d’ADNc (3' course) protocoles décrit ici faire usage de deux différents ADN polymérases pour mapper les séquences qui incluent une partie de la trame de lecture ouverte (ORF), le codon d’arrêt et l’entière région 3' UTR de transcription utilisant l’ARN issus de lignées de cellules cancéreuses différent.

Adaptation de 3' Amplification rapide des ADNc se termine pour mapper les transcriptions en Cancer

Le séquençage de prochaine génération (NGS) est un outil puissant pour la caractérisation génomique qui est limité par le taux élevé d’erreurs de la plateforme (~0.5–2.0%). Nous décrivons nos méthodes de séquençage de l’erreur-corrigé qui nous permettent d’éviter le taux d’erreur NGS et détecter les mutations aux fractions d’allèle variant aussi rares que 0,0001.

Détection des événements rares en utilisant l’erreur corrigée ADN et le séquençage de l’ARN

L’identification des interactions physiques entre les gènes et les éléments de régulation est difficile, mais a été facilitée par les méthodes de capture de conformation du chromosome. Cette modification du protocole 4C-seq atténue la partialité de la PCR en réduisant au minimum l’amplification excessive des modèles PCR et maximise la mappability se lit en y incorporant une étape digest d’enzyme de restriction addition.

High-throughput Identification des séquences régulatrices du gène à l’aide de prochaine génération séquençage du Chromosome circulaire Conformation Capture (4C-seq)

Les ARN circulaires (circRNAs) sont des ARN non codants qui peuvent avoir des rôles dans la régulation transcriptionnelle et la médiation des interactions entre les protéines. Après l'évaluation de différents paramètres pour la construction des bibliothèques de séquençage circRNA, un protocole a été compilé utilisant la préparation totale échouée de bibliothèque d'ARN avec RNase R pré-traitement et est présenté ici.

Identification des ARN circulaires à l'aide du séquençage de l'ARN

Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.

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Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

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Les nanomachines basées sur DNAzyme peuvent être utilisées pour la détection hautement sélective et sensible des acides nucléiques. Cet article décrit un protocole détaillé pour la conception de nanomachines basées sur DNAzyme avec un cœur de 10 à 23 à l’aide de logiciels libres et leur application dans la détection d’un fragment de virus d’Epstein-Barr à titre d’exemple.

Nanomachines à base de DNAzyme 10-23 pour la reconnaissance des acides nucléiques

Apprenez à générer des ARN circulaires via un système d'expression génomique utilisant des éléments Alu et l'épissage alternatif. Cette méthode permet d'étudier leur fonction et leur association aux maladies.

Utilisation d’un élément Alu contenant des minigènes pour analyser les ARN circulaires

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