Name: Synthèse enzymatique des métabolites époxidisés de Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, et Arachidonic Acids (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Découvrez la synthèse enzymatique d'acides gras époxy enantiopurs à l'aide de l'enzyme cytochrome P450 BM3. Cette méthode simple et rapide permet d'obtenir des métabolites de l'acide docosahexaénoïque, eicosapentaénoïque et arachidonique pour la recherche en biochimie.

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Ces travaux sont financés par R00 ES024806 (National Institutes of Health), DMS-1761320 (National Science Foundation) et des fonds de démarrage de l'Université d'État du Michigan. Les auteurs tiennent à remercier le Dr Jun Yang (Université de Californie à Davis) et Lalitha Karchalla (Michigan State University) pour leur aide dans l'optimisation de la réaction enzymatique, et le Dr Tony Schilmiller (MSU Mass Spectrometry and Metabolomics Facility) pour l'aide à l'acquisition de données DU SMR.

CAUTION : Veuillez consulter toutes les fiches de données pertinentes sur la sécurité des matériaux (MSDS) avant d'utiliser les produits chimiques énumérés.
1. Expression de type sauvage BM3
<ol><li>Inoculer le pBS-BM3 transfecté DH5MD E. coli (un don généreux du Dr F. Ann Walker) dans 5 ml de bouillon lb stérile avec 0,5 mg d'ampicilline ajouté dans un tube de culture de 20 ml.</li>
	<li>Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 oC pour 24 h à 200 tr/min. Ajouter la culture de démarrage de nuit (5 ml) et 100 mg d'ampicilline à 1 L de bouillon stérile DE LB dans un flacon Fernbach ou Erlenmeyer. Secouer à 37 oC pendant 6 h à 200 tr/min, puis à 30 oC pour 18 h à 200 tr/min.</li>
	<li>Recueillir et centrifuger la culture cellulaire à 4 oC pendant 10 min à 1 000 xg. Jeter le supernatant et stocker le granule de cellules à -78 oC jusqu'à ce que la purification enzymatique. REMARQUE : Le supernatant peut être soit chimiquement stérilisé par traitement à l'eau de Javel ou stérilisé à l'aide d'un autoclave, puis versé dans le drain.</li>
</ol>2. Purification de BM3.
<ol><li>
Lyse cellulaire
	<ol>
<li>Décongeler le granule de cellules sur la glace et le resuspendre dans 40 ml de tampon de solubilisation glacé (4 oC) (10 mM Tris, 0,01 mM de fluorure de phénylmethylsulfonyle (PMSF;), 0,01 mM EDTA; pH 7,8). CAUTION: PMSF est toxique par contact.</li>
		<li>Sur la glace, sonicate les cellules pendant 1 min avec un homogénéisateur à ultrasons (réglage de puissance de sortie 10, service 100%), suivi d'une pause de 1 min sur la glace afin de lyser les cellules. Répétez cette procédure 6 fois. Centrifuger la cellule lysais à 4 oC pendant 30 min à 11 000 x g de débris de cellules à granulés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chromatographie d'affinité
	<ol>
<li>Préparer une forte colonne de chromatographie d'échange d'anion (voir Tableau des matériaux; diamètre : 2,8 cm x 6 cm, volume de colonne : 37 ml) en lavant avec 5 volumes de colonnes (CV) de tampon A (10 mM Tris, pH 7,8) à 4 oC.</li>
		<li>Ajouter les lysates cellulaires à la colonne libéetée et laver la colonne avec 3 CV de tampon froid A. Elute le BM3 en lavant la colonne avec tampon froid B (10 mM Tris, 600 mM NaCl, 6 CV).</li>
		<li>Recueillir la fraction d'élude brun-rougeâtre. Si la protéine n'est pas utilisée immédiatement, mélangez-la avec un volume égal de glycérol et de gel éclair avec de l'azote liquide. Conserver la solution congelée à -78 oC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Epoxidation de DHA par BM3
<ol><li>Préparer la réaction en ajoutant 0,308 g (0,940 mmol) de DHA en 18,8 ml de diméthylsulfoxide (DMSO) à 2 L de tampon de réaction en remuant (0,12 M de phosphate de potassium, 5 mM MgCl2, pH 7,4) avec 20 nM de l'enzyme BM3 décongelée. La concentration enzymatique peut être déterminée par la méthode d'analyse spectrale du monoxyde de carbone/dithionite19.</li>
	<li>Pendant que la solution est en remuant, commencer la réaction en ajoutant 1 équivalent de NADPH (nicotinamide adénine dinuccléotide phosphate réduit, sel tétrasodium, 0,808 g, 0,940 mmol) dissous dans le tampon de réaction. Remuer la réaction pendant 30 min tout en bouillonnant l'air à travers le mélange de réaction avec un ballon rempli d'air attaché à une seringue et une aiguille.</li>
	<li>À l'aide d'un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux),vérifiez l'absorption du mélange de réaction à 340 nm pour déterminer si le NADPH est épuisé. S'il n'y a pas d'absorption restante indiquant la consommation de NADPH, la réaction est complète. REMARQUE: Typiquement, la réaction est complète après 30 min.</li>
	<li>Étancher le mélange de réaction en ajoutant lentement 1 M d'acide oxalique, goutte à goutte, jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 4.</li>
</ol>4. Extraction de PDE
<ol><li>Extraire la solution tampon étanchée avec 2 L d'éther diéthyle (anhyde, sans peroxyde) 3 fois. Recueillir la couche d'éther (6 L) et sécher avec du sulfate de magnésium anhydre (MgSO4).</li>
	<li>Filtrer le MgSO4 de la solution et concentrer la couche d'éther séchée sur un évaporateur rotatif pour produire les résidus bruts edP.</li>
	<li>Purifier les résidus par chromatographie à colonne flash (une cartouche de silice de 40 g suffit). Commencez à 10% d'acétate d'éthyle (EtOAc) en hexanes et rampe jusqu'à 60% EtOAc en hexanes de plus de 22 min. REMARQUE : Trois pics majeurs sont obtenus et collectés, élichant de l'ordre de 1. DHA non réagis; 2. mélange d'isores EDP; et 3. di-époxyde (produits normaux de suroxydation (voir figure 1)).</li>
	<li>Mélanger les fractions et les concentrer sur l'évaporateur rotatif. De cet exemple, 0,074 g, (24 %) de DHA non réagi, 0,151 g (47%) des isoreurs EDP, et 0,076 g, (22%) de di-époxide ont été obtenus.</li>
</ol>5. Estérification des PDE, séparation de 16(S), 17(R)- et 19(S), 20(R)-EDP, et saponification des esters
CAUTION : Le trimethylsilyldiazométhane (TMS-diazométhane) est très toxique par contact et par inhalation. Utilisez seulement dans une hotte de fumée avec l'équipement de protection individuelle approprié.
<ol><li>Diluer les époxydes (0,151 g, 0,435 mmol) dans un flacon à fond rond ou une petite fiole avec 2 ml de méthanol anhydre (MeOH) et 3 ml de toluène anhydre, ajouter une barre à remous, et ajouter TMS-diazométhane (1,2 équivalent molaire, ou 0,26 ml d'une solution de 2 Ml en hexanes) sous l'argon.</li>
	<li>Attendez 10 min et ajoutez du TMS-diazométhane supplémentaire (0,050 ml) jusqu'à ce qu'il reste une couleur jaune pâle.</li>
	<li>Après 30 min, concentrer soigneusement le mélange à l'aide de l'évaporateur rotatif et purifier les résidus par chromatographie à colonne flash. Elute avec 4% EtOAc en hexanes (à l'aide d'une colonne ou d'une cartouche de gel de silice de 40 g) pendant 22 min. Dans cet exemple, 19,20-EDP ester méthyle (0,116 g, 74%) et 16,17-EDP ester méthyle (0,029 g, 19%), ont été obtenus comme huiles claires (rendement total, 93%).</li>
	<li>Recueillir les fractions contenant les regioisomers purifiés EDP ester ester. 19(S), 20(R)-EDP ester elutes first, followed by 16(S),17(R)-EDP methyl ester.</li>
	<li>S'il reste des fractions mixtes (contenant les deux isomères; peuvent être évaluées par chromatographie à couches minces (TLC) en 8:1 hexane/EtOAc et tachées de permanganate de potassium (KMnO 4)), les re-chromatographe avec le même système de solvants qu'auparavant.</li>
	<li>Concentrez les fractions contenant les regioisomers individuels. REMARQUE : À ce stade, l'identité et la pureté peuvent être évaluées par la RMN (en utilisant cDCl3 comme solvant; voir la légende de la figure 2).</li>
	<li>Pour convertir les regioisomers d'ester de méthyle d'EDP individuels à leurs formes acides, diluer l'ester d'EDP dans THF:water (approximativement 0.7 mL/0.1 mmol d'ester). Ajouter 2 M liOH aqueux (3 équivalents molaires) et remuer toute la nuit. REMARQUE: L'exhaustivité de la réaction peut être évaluée par TLC, en utilisant 3:1 hexanes/EtOAc, coloration avec KMnO4; le produit a un facteur de rétention de 0,3.</li>
	<li>Étancher la réaction lentement avec de l'acide formique, jusqu'à ce que le pH du mélange atteigne 3-4. Ajouter l'eau et l'acétate d'éthyle (1-2 mL/0,100 mmol d'ester) et séparer les couches. Extraire la couche d'eau avec EtOAc (3 x 5 ml), laver avec la solution de saumure saturée (NaCl) et sécher la couche EtOAc sur le sulfate de sodium anhydre (Na2SO4).</li>
	<li>Concentrer la solution d'acétate d'éthyle à l'aide d'un évaporateur rotatif, ajouter les hexanes (10 ml) et se concentrer à nouveau. Répéter deux fois pour enlever l'acide formique résiduel. Purifie le résidu par chromatographie de colonne flash, eluting avec 10-30% EtOAc plus de 15 min.</li>
	<li>Concentrez les fractions désirées et séchez dans le vacuo pour se permettre l'acide purifié. REMARQUE : À ce stade, la pureté enantiomérique peut être évaluée (par Chiraquien HPLC, voir les légendes de la figure 3 - Figure 4 pour les colonnes et les conditions). La pureté chimique peut être évaluée par C18 (achiral) HPLC (voir Tableau des matériaux et référence 14).</li>
</ol>

<ol><li>Campbell, W. B., Gebremedhin, D., Pratt, P. F., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+epoxyeicosatrienoic+acids+as+endothelium-derived+hyperpolarizing+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of epoxyeicosatrienoic acids as endothelium-derived hyperpolarizing factors.</a> Circulation Research. 78, 415-423 (1996).</li>
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<li>Cinelli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+synthesis+and+chemical+inversion+provide+both+enantiomers+of+bioactive+epoxydocosapentaenoic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Enzymatic synthesis and chemical inversion provide both enantiomers of bioactive epoxydocosapentaenoic acids.</a> Journal of Lipid Research. 59, 2237-2252 (2018).</li>
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<li>Celik, A., Sperandio, D., Speight, R. E., Turner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enantioselective+epoxidation+of+linolenic+acid+catalyzed+by+cytochrome+P450BM3+from+Bacillus+megaterium%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+and+Biomolecular+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enantioselective epoxidation of linolenic acid catalyzed by cytochrome P450BM3 from Bacillus megaterium.</a> Organic and Biomolecular Chemistry. 3, 1688-2690 (2005).</li>
<li>Capdevila, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+stereoselective+oxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+cytochrome+P450BM-3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The highly stereoselective oxidation of polyunsaturated fatty acids by cytochrome P450BM-3.</a> Journal of Biological Chemistry. 271, 22663-22671 (1996).</li>
<li>Lucas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereoselective+epoxidation+of+the+last+double+bond+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Stereoselective epoxidation of the last double bond of polyunsaturated fatty acids by human cytochromes P450.</a> Journal of Lipid Research. 51, 1125-1133 (2010).</li>
<li>Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., Cheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cytochrome+P450+and+NADPH-cytochrome+P450+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase.</a> Nature Protocols. 4, 1245-1251 (2009).</li>
<li>Cayman Chemical, 19,20-EpDPA. , 
 <a target="_blank" href="https://www.caymanchem.com/product/10175">https://www.caymanchem.com/product/10175</a> (2019).</li>
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</ol>

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Nous présentons ici une méthode opérationnellement simple et rentable pour préparer les deux métabolites époxy les plus abondants de DHA - 19,20 et 16,17-EDP. Ces acides gras époxy peuvent être préparés en très enantiopure (comme leur S,R-isomers) forme en utilisant l'enzyme de type sauvage BM3. Plusieurs points critiques qui peuvent être utilisés pour le dépannage, et l'extension de notre méthode à la préparation des métabolites époxy éantiopure de AA et EPA, sont décrits ci-dessous.
<p class="jove_content"...

Comme l'intérêt pour le rôle que les acides gras polyinsaturés (en particulier les acides gras oméga-3 et oméga-6 gras polyinsaturés) jouent dans la biologie humaine a augmenté ces dernières années, les chercheurs ont pris connaissance de la large gamme d'avantages attrayants que leurs métabolites pièce. En particulier, les métabolites d'acide gras époxy produits par la classe cytochrome P450 d'enzymes ont été un grand point de discussion. Par exemple, de nombreux époxydes PUFA, y compris les acides époxyeicosatrienoic (EET), les acides époxydocosapentaenoic (EDP) et les acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), jouent un rôle critique dans la régulation de la tension artérielle et de l'inflammation1,2 , 3 (en) , 4 ( en plus) , 5. Fait intéressant, les enantiomères spécifiques et les regioisomers des époxydes AA et EPA sont connus pour avoir des effets variables sur la vasoconstriction6,7. Tandis que les effets physiologiques des enantiomers et des regioisomers des EET et des EEQs ont été documentés, peu est connu au sujet de l'effet des acides éoxydocoentaénoïques analogues (EDP) formés à partir de DHA. L'utilisation généralisée de l'huile de poisson8, qui est riche en EPA et En DHA, a également suscité l'intérêt pour les PDE9. Les avantages de ces suppléments sont censés être en partie dus aux métabolites en aval de DHA (16,17-EDP et 19,20-EDP étant les plus abondants) parce que les niveaux in vivo des EDP coordonnent très bien avec la quantité de DHA dans le régime10,, 11.
L'étude des mécanismes et des cibles de ces acides gras époxy par la métabolomique, la biologie chimique, et d'autres méthodes s'est avérée provocante, en partie parce qu'elles existent en tant que mélanges de regio- et de stéréo-isomers, et une méthode d'obtenir des quantités pures de la enantiomers et regioisomers est nécessaire. Les moyens conventionnels pour synthétiser chimiquement ces composés se sont avérés inefficaces. L'utilisation de peroxyacids comme l'acide méta-chloroperoxybenzoïque pour l'époxidation présente de nombreux inconvénients, notamment le manque de sélectivité de l'époxidation, qui nécessite une purification coûteuse et minutieuse des regioisomers et des enantiomères individuels. La synthèse totale des métabolites de DHA et d'EPA est possible, mais souffre également des inconvénients qui le rendent peu pratique pour la synthèse à grande échelle telle que les coûts élevés et les rendements bas12,13. Une production globale efficace peut être réalisée avec la synthèse enzymatique, car les réactions enzymatiques sont regio- et stéréosélective14. Les études montrent que l'époxidation enzymatique de l'AA et de l'EPA (avec BM3) est à la fois regioselective et enantioselective15,16,17,18, mais cette procédure n'a pas été testée avec DHA, ou sur un grand échelle. L'objectif global de notre méthode était d'augmenter et d'optimiser cette époxidation chimioenzymatique pour produire rapidement des quantités significatives d'acides gras époxy purs comme leurs enantiomères individuels. En utilisant la méthode présentée ici, les chercheurs ont accès à une stratégie simple et rentable pour la synthèse des PDE et d'autres métabolites époxy PUFA.

<table><tbody><tr><td>Bicarbonate d’ammonium</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>NA</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>GoldBio</td><td>A30125</td><td>NA</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-3</td><td></td></tr><tr><td>NA Méthanol anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322515</td><td>NA</td></tr><tr><td>Sulfate de sodium anhydre</td><td>Fisher Scientific</td><td>S421-500</td><td></td></tr><tr><td>NA Anhydre toluène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acide arachidonique (AA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-71A</td><td>Sensible à l’air.&nbsp ;</td></tr><tr><td>Éther diéthylique</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>NA DMSO (grade de biologie moléculaire)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acide docosahexaénoïque (DHA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>U-84A</td><td>Sensible à l’air.&nbsp ;</td></tr><tr><td>EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique)</td><td>Invitrogen</td><td>15576028</td><td>NA</td></tr><tr><td>Acide eicosapentaénoïque (EPA)</td><td>Nu-Chek Prep</td><td>&nbsp ; U-99A</td><td>Sensible à l’air.</td></tr><tr><td>Acétate d’éthyle</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>34858</td><td>NA</td></tr><tr><td>Cartouches de colonne Flash 25, 40, 4, 12 g Fisher</td><td>Scientific</td><td>145170203, 145154064, 5170200</td><td>Alternativement, la chromatographie sur colonne conventionnelle peut être utilisée</td></tr><tr><td>Acide formique (grade HPLC)</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-01</td><td></td></tr><tr><td>NA Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>NA Hexanes</td><td>VWR</td><td>BDH24575</td><td>NA</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Sigma</td><td>L3022</td><td>NA</td></tr><tr><td>Hydroxyde de lithium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442410</td><td>NA</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium</td><td>Fisher Scientific</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>NA Méthanol (grade HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-41-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>NADPH Sel tétrasodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>sensible à l’air.</td></tr><tr><td>Acide oxalique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>194131</td><td>NA</td></tr><tr><td>pBS-BM3 transfecté DH5&alpha ; E. coli</td><td>NA</td><td>NA NA</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (fluorure de phénylméthanesulfonyle)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Toxique !</td></tr><tr><td>Permanganate de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>pour la coloration TLC.</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma</td><td>795496</td><td>NA</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td>NA</td></tr><tr><td>Q Résine à écoulement rapide Sepharose (GE Healthcare life sciences)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-0515-01</td><td>Pour la purification par échange d’anions de l’enzyme</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tétrahydrofurane anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>186562</td><td>NA</td></tr><tr><td>TMS-Diazométhane (2,0 M en hexanes)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>362832</td><td>Très toxique.</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>GoldBio</td><td>T-400</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>Aussi nécessaire :</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de purification flash automatique (nous avons utilisé un Buchi Reveleris X2)&nbsp ;</td>Colonne HPLC <td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C18 (Zorbax Eclipse XDB-C18)</td>Centrifugeuse <td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capable de 10 000 x g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne HPLC chirale (Lux cellulose-3), 250 x 4,6 mm, 5 & micro ; M, 1000 &Aring ;)</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Chemistry fournit : un entonnoir séparateur de 2 L, des béchers et des erlenmeyers d’une capacité de 1000-2000 L, des flacons de 20 mL, des flacons HPLC, de petits flacons à fond rond et des agitateurs.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (nous utilisons une pompe analytique Shimadzu Prominence LC-20AT et un détecteur UV-vis SPD-20A</td>, un spectrophotomètre <td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000)</td><td>RMN Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>RMN : Spectromètre Agilent DD2 (500 MHz)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Évaporateur rotatif</td><td>Buchi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Démonteur sonique ou homogénéisateur à ultrasons</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synthèse enzymatique des métabolites époxidisés de docosahexaenoic, eicosapentaenoic, et arachidonic acids

Enzymatic Synthesis of Epoxidized Metabolites of Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, and Arachidonic Acids

Les métabolites époxidés de divers acides gras polyinsaturés (PUFAs), appelés acides gras époxy, ont un large éventail de rôles dans la physiologie humaine. Ces métabolites sont produits endogènement par la classe cytochrome P450 d'enzymes. En raison de leurs effets biologiques divers et puissants, il y a un intérêt considérable dans l'étude de ces métabolites. Déterminer les rôles uniques de ces métabolites dans le corps est une tâche difficile, car les acides gras époxy doivent d'abord être obtenus en quantités significatives et avec une grande pureté. L'obtention de composés à partir de sources naturelles est souvent laborieuse, et les hydrolases solubles d'époxyde (sEH) hydrolysent rapidement les métabolites. D'autre part, l'obtention de ces métabolites par des réactions chimiques est très inefficace, en raison de la difficulté d'obtenir des regioisomers purs et des enantiomères, de faibles rendements, et la purification étendue (et coûteuse). Ici, nous présentons une synthèse enzymatique efficace de 19(S), 20(R)- et 16(S), 17(R)-epoxydocosapentaenoic acids (EDP) from DHA via epoxidation with BM3, a bacterial CYP450 enzyme isolated originally from Bacillus mégaterium (qui s'exprime facilement dans Escherichia coli). La caractérisation et la détermination de la pureté sont effectuées avec la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN), la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse (MS). Cette procédure illustre les avantages de la synthèse enzymatique des métabolites époxy PUFA, et s'applique à l'époxidation d'autres acides gras, y compris l'acide arachidonique (AA) et l'acide eicosapentaenoic (EPA) pour produire l'époxyeicosatrienoic analogue acides époxyeicosatetraenoic (EEQ), respectivement.

Le chromatogramme de colonne flash (exécuté à l'aide d'un système automatisé de purification flash tel que décrit ci-dessous) obtenu lors de la purification du mélange brut de l'époxidation enzymatique est montré dans la figure 1. Après l'estérification et la séparation des regioisomers, des esters purs 16(S), 17(R)-EDP et 19(S), 20(R)-EDP esters méthylaux ont été obtenus. Typiquement, ils sont présents dans un rapport appr...

Nous présentons une méthode utile pour la synthèse et la purification enzymatiques à grande échelle des enantiomers et des regioisomers spécifiques des époxydes de l'acide arachidonique (AA), de l'acide docosahexaénoïque (DHA), et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) avec l'utilisation d'un cytochrome bactérien P450 enzyme (BM3).

Synthèse enzymatique des métabolites époxidisés de Docosahexaenoic, Eicosapentaenoic, et Arachidonic Acids

The epoxidized metabolites of various polyunsaturated fatty acids (PUFAs), termed epoxy fatty acids, have a wide range of roles in human physiology. These ...

Ainsi, notre protocole nous permet de préparer des acides gras époxy enantiopure, et cette méthode pourrait aider à faire avancer la recherche sur les mécanismes par lesquels ces métabolites agissent dans le corps. Historiquement, les acides gras époxy purs sont très difficiles à obtenir. Donc, notre protocole est simple, rapide, rentable, et il nous permet de préparer des quantités importantes de ces métabolites.Oui, nous avons développé un protocole pour le DHA, mais il fonctionne aussi très bien pour l’EPA et l’acide arachidonique. Travaillez rapidement, car certains des reagents sont sensibles à l’air, en particulier DHA et NADPH, et assurez-vous de tout jumeler à l’avance afin que la configuration soit simple. En outre, soyez conscient des dangers.Notre protocole utilise des techniques en enzymologie et en chimie organique. La visualisation est essentielle pour aider les lecteurs et les téléspectateurs qui ne sont pas familiers avec les techniques spécialisées dans ces domaines. Pour inoculer, utilisez une boucle stérile ou une pipette trempée dans du stock de glycérol de PBS-BM3 transfecté DH5-alpha E.coli en cinq millilitres de bouillon stérile LB complété par 0,5 milligramme d’ampicilline.Incuber la culture cellulaire dans un shaker à 37 degrés Celsius pendant 24 heures à 200 tours. Ensuite, ajoutez la culture de démarrage de cinq millilitres et 100 milligrammes d’ampicilline à un litre de bouillon LB stérile dans un flacon Erlenmeyer. Agiter à 37 degrés Celsius pendant six heures à 200 rpm, puis à 30 degrés Celsius pendant 18 heures à 200 rpm.Après cela, recueillir la culture cellulaire dans des tubes de centrifugeuse, et centrifuger la culture cellulaire à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 1000 fois g. Verser le surnatant dans un autre flacon. Décontaminer avec de l’eau de Javel ou en utilisant l’autoclave, et stocker la pastille cellulaire à moins 78 degrés Celsius jusqu’à la purification enzymatique.Pour effectuer la lyse cellulaire, décongelez d’abord la pastille cellulaire sur la glace, et résuspendez dans 40 millilitres de tampon de solubilisation glacée contenant tris, PMSF, et EDTA. Sur la glace, sonifier les cellules pendant une minute avec un homogénéiseur ultrasonique, avec un réglage de puissance de sortie de 10 et le devoir de 100, suivie d’une pause d’une minute sur la glace afin de lyse les cellules. Répétez cette procédure six fois.Centrifugeuse la cellule lysate à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes à 11.000 fois g pour pelleter les débris cellulaires. Pour effectuer la chromatographie d’affinité, dans une pièce froide ou un réfrigérateur avec une porte coulissante, à quatre degrés Celsius, préparez d’abord une forte colonne de chromatographie d’échange d’anion en lavant la résine avec cinq volumes de colonne de tampon A de Tris de 10 millimolar au pH 7.8. Ensuite, ajoutez le supernatant des lysates cellulaires à la colonne équilibrée, et lavez la colonne avec trois volumes de colonne de tampon froid A.Then, évaluez le BM3 en lavant la colonne avec six volumes de colonne de tampon froid B de Tris de 10 millimolaires et de chlorure de sodium de 600 millimolaires.Recueillir la fraction élitente brun-rougeâtre. Si la protéine n’est pas utilisée immédiatement, mélangez-la avec un volume égal de glycérol et clignotez avec de l’azote liquide. Conservez la solution congelée à moins 78 degrés Celsius.Pour effectuer l’epoxidation du DHA, déterminez d’abord la concentration de l’enzyme BM3 décongelée, selon la méthode d’analyse spectrale de dithionite de monoxyde de carbone. Puis, dans un bécher contenant deux litres de tampon de réaction agités sur une plaque magnétique, ajouter 0,94 millimoles de DHA diluées en 18,8 millilitres de DMSO et l’enzyme BM3 diluée à 20 nanomolaires. Pendant que la solution est en remuant, commencez la réaction d’epoxidation en ajoutant 8.7 millilitres de tampon de réaction contenant 0.94 millimoles de NADPH.Remuer la réaction pendant 30 minutes tout en bouillonnant l’air dans le mélange de réaction avec un ballon rempli d’air attaché à une seringue et une aiguille scotchée à l’intérieur du bécher. Après cela, dessinez un microlitre du mélange de réaction, et mettez-le dans un spectrophotomètre NanoDrop pour mesurer l’absorption à 340 nanomètres. Utilisez l’eau comme blanc.S’il n’y a pas d’absorption restante, ce qui indique que la NADPH a été consommée, la réaction est complète. Étanchez le mélange de réaction en ajoutant lentement de l’acide oxalique uni molaire dans le sens de la goutte, jusqu’à ce que le pH de la solution atteigne environ quatre. Maintenant, extrayez la solution tampon trempée avec deux litres d’éther de déthyle anhydre et sans peroxyde.Utilisez un entonnoir séparateur pour secouer et séparer les couches, et recueillir l’éther dans un flacon Erlenmeyer. Répéter deux fois de plus et ajouter environ 50 grammes de sulfate de magnésium anhydre pour sécher l’éther. Sur un entonnoir de filtre à vide, verser l’éther séché pour filtrer le sulfate de magnésium et transférer la couche d’éther filtrée dans un flacon à fond rond de l’évaporateur rotatif.Réglez la vitesse de rotation à moyen, et commencez le vide pour concentrer le liquide pour produire des résidus bruts d’EDP. Chargez les résidus dans une cartouche de silice de 40 grammes pour effectuer une chromatographie à colonne flash à l’aide d’une machine automatisée de purification flash. Commencez à 10% d’acétate d’éthylique dans les hexanes, et rampez jusqu’à 60% d’acétate d’éthylique dans les hexanes plus de 22 minutes.Les fractions sont automatiquement collectées dans des tubes. Ensuite, combinez les fractions de chaque pic dans un flacon à fond rond, mettez l’évaporateur rotatif et commencez l’évaporation. Trois fractions sont obtenues, DHA, isomers EDP, et diepoxide.Pour estérifier les 0,151 grammes d’epoxide obtenus, dans un flacon à fond rond ou un petit flacon, ajouter deux millilitres de méthanol anhydre et trois millilitres de toluène anhydre, et ajouter une barre d’agitation. Connectez le flacon avec un ballon rempli d’argon à travers un septum en caoutchouc et une aiguille, et ajoutez 0,26 millilitres de tms-diazomethane à deux molaires à travers une seringue en remuant. Attendez 10 minutes et ajoutez 05 millilitres supplémentaires de TMS-diazomethane jusqu’à ce qu’une couleur jaune pâle apparaisse.Après 30 minutes, concentrer soigneusement le mélange à l’aide de l’évaporateur rotatif et utiliser une cartouche de colonne de gel de silice de 40 grammes sur la machine à chromatographie flash pour purifier les résidus. Elute avec une concentration isocratique de 4% d’acétate d’éthyle dans les hexanes plus de 22 minutes. Recueillir les fractions contenant le purifié 19S, 20R-EDP ester méthyle élit d’abord, suivie par 16S, 17R-EDP ester méthyle.Maintenant, évaluez les fractions par chromatographie de couche mince dans un mélange de huit à un hexane-à-éthyl-acétate. Tache avec du permanganate de potassium pour vérifier toutes les fractions mélangées contenant les deux isomères. Concentrez les fractions correspondant à chaque pic sur un évaporateur rotatif, puis pesez sur un équilibre pour déterminer la quantité d’esters EDP obtenus.S’il reste des fractions mélangées, re chromatographiez-les avec le même système de solvants qu’auparavant. Concentrez chaque fraction contenant le regioisomer individuel sur un évaporateur rotatif. Pour convertir les regioisomers méthyles EDP individuels en leurs formes acides, diluer l’ester EDP dans un petit flacon d’environ 0,7 millilitres de THF par 0,1 millimoles d’ester, ainsi que 0,175 millilitres d’eau.Refroidir le flacon à zéro degré Celsius dans un bain de glace, ajouter trois équivalents de solution hydroxyde de lithium, et remuer sur une plaque de remue-pièce sous argon pendant la nuit tout en se réchauffant à température ambiante. Le matin, étanchez la réaction en ajoutant lentement de l’acide formique, jusqu’à ce que le pH du mélange atteigne trois à quatre. Ajouter ensuite de l’eau et deux millilitres d’acétate d’éthyle pour séparer les couches.Extraire la couche d’eau avec 10 millilitres d’acétate d’éthyle trois fois, laver avec 20 millilitres de solution de saumure saturée, et ajouter plusieurs grammes de sulfate de sodium anhydre dans la solution pour sécher la couche d’acétate d’éthyle. Concentrez la solution d’acétate d’éthylique à l’aide de l’évaporateur rotatif, ajoutez 10 millilitres d’hexanes et concentrez-vous à nouveau. Répétez deux fois pour éliminer azeotropically acide formique résiduel.Purifier les résidus par chromatographie à colonne flash, en l’évasant de 10 à 30% d’acétate d’éthyle pendant 15 minutes. Concentrez les fractions désirées dans l’évaporateur rotatif et séchez-les en vacuo pour vous permettre l’acide purifié. Le chromatogramme de colonne flash obtenu lors de la purification du mélange brut de l’epoxidation enzymatique est montré ici.Trois pics majeurs ont été obtenus, s’échappant de l’ordre, d’une première, d’un DHA non réagi, deuxièmement, d’un mélange d’isomères EDP et, troisièmement, de diepoxide, qui sont des produits normaux de suroxydation. Après l’estérification et la séparation des regioisomers, les spectres de NMR de proton indiquent que des esters méthyles de haute pureté 16S, 17R-EDP et 19S, 20R-EDP méthyle ont été obtenus. Chiral HPLC a confirmé la pureté enantiomeric des formes acides des EDP.Assurez-vous de garder votre bouillon stérile pendant la manipulation et l’inoculation pour éviter la contamination. L’epoxidation peut être utilisée pour d’autres acides gras. Nous l’avons donc aussi essayé avec des acides arachidoniques et eicosapentaénoïques, et nous avons obtenu de bons rendements de ces epoxides enantiopure, donc 14, 15-EET et 17, 18-EEQ.Ainsi, un protocole qui permet aux chercheurs d’accéder aux acides gras époxy pourrait aider à la recherche sur les fonctions biologiques de ces composés, ce qui pourrait conduire à leur utilisation comme médicaments conduit. Les produits chimiques dangereux sont le PMSF, qui est dangereux par contact, et le TMS-diazomethane, qui est très toxique par contact et inhalation. Ainsi, ce dernier doit être utilisé dans un capot de fumée et avec un équipement de protection individuelle approprié.

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